QuEChERS-氣相色譜/質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定尿液中7種芬太尼類物質(zhì)

劉雅珣， 劉慧格， 劉 凱， 柯 威， 陶 濤， 高 吭*

(1.湖北省黃石市公安局，湖北黃石 435000；2.湖北省潛江市公安局，湖北潛江 433100)

芬太尼作為一種阿片受體激動(dòng)劑，其具有和傳統(tǒng)毒品海洛因相似的藥理作用，藥效是嗎啡的50～100倍[1]。2019年5月1日起，公安部等有關(guān)部門聯(lián)合決定，將芬太尼類物質(zhì)列入《非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補(bǔ)目錄》[2]。為打擊防范芬太尼類物質(zhì)的濫用，國內(nèi)外眾多專家學(xué)者對(duì)芬太尼類物質(zhì)的檢測(cè)方法開展了研究[3]。Sarah[4]等報(bào)道了使用正己烷和乙酸乙酯混合溶劑作為萃取劑的液-液萃取方法，同時(shí)測(cè)定血液和尿液中6種芬太尼類物質(zhì)；Eckart等[5]報(bào)道了使用Bakerbond C18小柱對(duì)血清、血液以及死者組織液等樣本進(jìn)行固相萃取，同時(shí)測(cè)定5種芬太尼類物質(zhì)；吳健美等[6]報(bào)道了檢測(cè)毛發(fā)中36種芬太尼類物質(zhì)的方法。Sabina[7]等和劉曉云等[8]分別報(bào)道了液-液萃取和固相萃取技術(shù)對(duì)生物檢材中芬太尼類物質(zhì)進(jìn)行前處理的研究，均具有良好的檢測(cè)效果。目前尚未發(fā)現(xiàn)以QuEChERS法進(jìn)行前處理，氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)尿液中芬太尼類物質(zhì)的報(bào)道。

減少復(fù)雜樣品基質(zhì)影響、得到較高回收率一直是法庭科學(xué)毒物檢驗(yàn)工作研究的重點(diǎn)。QuEChERS方法具有回收率高、穩(wěn)定性好、有效減少基質(zhì)干擾等顯著優(yōu)點(diǎn)[9]。本文基于QuEChERS法，結(jié)合氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立了同時(shí)測(cè)定尿液中乙酰芬太尼(Acetylfentanyl)、丙烯酰芬太尼(Acrylfentanyl)、呋喃芬太尼(Furanylfentanyl)、戊酰芬太尼(Valerylfentanyl)、4-氟丁酰芬太尼(4-Fluorobutyrfentanyl)、奧芬太尼(Ocfentanyl)和異丁酰芬太尼(Isobutyrfentanyl) 7種芬太尼類物質(zhì)的方法。該方法簡(jiǎn)單，靈敏，準(zhǔn)確，為打擊違法濫用芬太尼類物質(zhì)提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

7890BGC-5977BMSD氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，Agilent公司)；TOLEDO FE20K pH計(jì)(美國，METTLER公司)；H1850離心機(jī)(長(zhǎng)沙市湘儀離心機(jī)股份有限公司)；VORTEX2漩渦混勻儀(德國，IKA公司)；VORTEX-5漩渦混勻儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

4-氟丁酰芬太尼、奧芬太尼、丙烯酰芬太尼、呋喃芬太尼、戊酰芬太尼、異丁酰芬太尼、乙酰芬太尼(純度高于98%)均購自上海刑事科學(xué)技術(shù)研究院、中科院上海有機(jī)化學(xué)研究所。稱取適量上述標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于-20 ℃保存。

N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18,40～63 μm)購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；無水NaH2PO4、無水Na2HPO4(分析純)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇(色譜純)購自西隴化工股份有限公司；乙酸乙酯(色譜純)購自美國TEDLA公司。所用水由Pure-lab Option Q7超純水儀(英國ELGA公司)制備。

1.2 樣品前處理

準(zhǔn)確吸取2 mL待測(cè)尿液樣品于50 mL離心管中，加入1 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=9)，1 g NaCl和4 g無水Na2SO4，5 mL乙酸乙酯，于5 000 r/min振蕩提取1 min， 5 000 r/min離心5 min，精密吸取乙酸乙酯3 mL于15 mL離心管中(離心管中加入10 mg C18)，3 000 r/min振蕩5 min后，4 000 r/min離心1 min，取上清液2 mL在60 ℃下用氮?dú)獯蹈?，?.1 mL甲醇定容后，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 色譜條件

色譜柱：HP-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent公司)；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比5∶1；載氣：高純氮?dú)?99.999%)；流速：1 mL/min。升溫程序：初始溫度150 ℃，保持1 min，以20 ℃/min速率升至280 ℃，保持10 min；傳輸線溫度：280 ℃。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；采集類型：全掃描；質(zhì)量數(shù)范圍：50～500 amu；溶劑延遲時(shí)間：2.5 min。7種芬太尼類物質(zhì)的質(zhì)譜圖見圖1。

7種芬太尼類物質(zhì)的保留時(shí)間、定性離子和定量離子見表1。

表1 7種芬太尼類物質(zhì)的保留時(shí)間、定性離子和定量離子

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

不同的有機(jī)溶劑在QuEChERS方法中的提取效果因基質(zhì)和目標(biāo)物不同而異[10,11]。分別試驗(yàn)了乙酸乙酯、乙腈、環(huán)己烷和苯4種提取溶劑，考察不同提取溶劑對(duì)萃取效果的影響。如圖2所示，環(huán)己烷和苯萃取率較低，而使用乙腈作為提取溶劑時(shí)，存在較嚴(yán)重的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，7種芬太尼類物質(zhì)的回收率平均值都超過160%。選擇乙酸乙酯作為提取溶劑，既有較好的萃取效果，基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)也比使用乙腈小。造成芬太尼類物質(zhì)基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)是因?yàn)閷?shí)際樣品中，過量的基質(zhì)會(huì)與芬太尼類物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)氣相色譜進(jìn)樣口或色譜柱柱頭的活性位點(diǎn)，使得芬太尼類物質(zhì)與活性位點(diǎn)發(fā)生相互作用相比于配制在純?nèi)軇┲袝r(shí)大大減少，到達(dá)質(zhì)譜檢測(cè)器的量明顯增多[12]。

圖2 4種提取溶劑對(duì)7種芬太尼類物質(zhì)回收率的影響Fig.2 Effect of four extractant on recoveries of seven fentanyls

2.2 除水劑的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了分別使用4 g無水Na2SO4、無水MgSO4、無水Na2Ac作為除水劑對(duì)回收率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：選擇無水Na2SO4作除水劑時(shí)效果最好，使用無水MgSO4時(shí)，回收率較低，使用無水NaAc時(shí)，基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)較大。

2.3 凈化劑的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了C18和PSA作為凈化劑在不同的用量下對(duì)回收率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著C18用量的增加，除丙烯酰芬太尼的回收率逐漸下降之外，其余6種芬太尼類物質(zhì)的回收率無明顯變化。隨著PSA用量的增加，7種芬太尼類物質(zhì)的回收率逐漸下降，且在使用10 mg和20 mg PSA時(shí)，奧芬太尼和呋喃芬太尼的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)較大。最終確定C18作為凈化劑，使用量為10 mg。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

取5份1.9 mL新鮮空白尿液樣品，分別添加0.1 mL濃度為0.4、1、2、3、4 μg/mL的7種混合芬太尼類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,在確定的實(shí)驗(yàn)方法下檢測(cè)，以定量離子峰面積(y)對(duì)其在尿液中的質(zhì)量濃度(x,ng/mL)繪制校準(zhǔn)曲線，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)(r2)。結(jié)果顯示，7種分析物的線性關(guān)系良好，r2均大于0.998。按本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)20 ng/mL的空白加標(biāo)尿液樣品進(jìn)行檢測(cè)，分別以3倍和10倍信噪比(S/N)確定檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，結(jié)果列于表2。

表2 7種芬太尼類物質(zhì)的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

(續(xù)表2)

2.5 回收率與精密度

根據(jù)定量限及實(shí)際樣品中的含量范圍，在空白尿液樣品中添加20,100,200 ng/mL 3個(gè)水平的7種芬太尼類物質(zhì)。按照已確定的方法，每個(gè)樣品平行檢測(cè)5次，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)檢測(cè)3 d，考察日間精密度。如表3所示，7種分析物的平均回收率為96.24%～118.27%，日內(nèi)精密度為2.94%～8.64%,日間精密度為3.37%～9.10%。

表3 加標(biāo)尿樣中7種芬太尼類物質(zhì)的平均回收率、日內(nèi)精密度(n=5)和日間精密度(n=3)

3 結(jié)論

本文建立了QuEChERS-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時(shí)測(cè)定尿液中7種芬太尼類物質(zhì)的方法。本方法樣品前處理采用乙酸乙酯作為提取劑，無水Na2SO4作為除水劑，C18作為凈化劑。結(jié)果表明，方法的線性關(guān)系良好，回收率和靈敏度高，具有操作便捷、定性定量準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可滿足公安機(jī)關(guān)對(duì)于芬太尼類物質(zhì)濫用的監(jiān)管。