含ACC 脫氨酶的植物促生菌對金鐵鎖種子萌發(fā)的影響

李 茜，賈 顏，李新藝，李芹梅，劉 松，王夢雨，黃海泉，黃美娟

（西南林業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院/國家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心/云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心/西南林業(yè)大學(xué) 園林園藝花卉研發(fā)中心，云南 昆明 650224）

金鐵鎖（Psammosilene tunicoides）為石竹科金鐵鎖屬的多年生植物，又名獨(dú)定子、昆明沙參等，是中國西南地區(qū)特有的單種屬植物，喜緊實(shí)、干燥且貧瘠的石灰?guī)r土或紅壤，主要分布于四川、云南及貴州等地[1-2]，該植物于1991年被《中國植物紅皮書》列為珍稀瀕危物種[3]。金鐵鎖具有重要的藥用價值，其根為珍貴的中藥材，具有散瘀、止血、消炎、祛風(fēng)濕等功效，主治跌打損傷、胃痛、風(fēng)濕痛、創(chuàng)傷出血等，為云南白藥、貴州金骨蓮膠囊等中藥的主要成分之一[4]。因金鐵鎖野生資源分布狹窄，再加上長期無節(jié)制的挖掘，其物種數(shù)量急劇下降，已成為我國珍稀瀕危植物。目前，金鐵鎖市場需求與日俱增，人工種植已成為栽培繁育的趨勢。

植物促生菌（Plant growth-promoting bacteria，PGPB）是對植物有益的微生物的統(tǒng)稱[5]，含ACC 脫氨酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase）的PGPB 能將乙烯直接前體物ACC 裂解成α-丁酮酸和氨，降低植物體內(nèi)乙烯的合成，從而促進(jìn)植物次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生[6]、增強(qiáng)植物抗性[7]、促進(jìn)植物生長[8]，進(jìn)而提高農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)等[9]。楊亞茹等[10]研究發(fā)現(xiàn)，以熒光假單胞菌制備的DLJ1發(fā)酵菌液對小麥和油菜種子的萌發(fā)具有顯著的促生能力。盧玉君等[11]采用不同砂生槐根瘤菌對青稞種子進(jìn)行促生處理，萌發(fā)率最高可達(dá)到100%。張凱曄等[12]研究發(fā)現(xiàn)，從田菁種子中分離獲得的具ACC 脫氨酶的內(nèi)生細(xì)菌可促進(jìn)田菁種子萌發(fā)生長。將含ACC 脫氨酶的PGPB 應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的前景，也是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一[13]。目前，關(guān)于含ACC 脫氨酶的PGPB 對金鐵鎖種子萌發(fā)的影響研究還未見報道。鑒于此，以含ACC 脫氨酶的不同PGPB 菌株對金鐵鎖種子進(jìn)行浸種處理，篩選對金鐵鎖種子具有良好促生效果的菌株，為下一步微生物菌肥的開發(fā)利用以及擴(kuò)大金鐵鎖的繁育規(guī)模提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試種子 試驗(yàn)所用金鐵鎖種子購買于云南省藥材市場，置于常溫儲藏室保存待用。

1.1.2 供試菌株 試驗(yàn)所用菌株為西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)室前期分離篩選而來的4 株具ACC 脫氨酶活性的PGPB，將其分別編號為F195（假單胞菌屬）、Z24（寡養(yǎng)單胞菌屬）、Z39（芽孢桿菌屬）、Z89（芽孢桿菌屬），4個菌株混合后編號為Mix，將上述4個菌株及其混合菌株作為試驗(yàn)用菌。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子處理 首先挑取顆粒飽滿、大小一致、外表無受損的種子，用無菌水沖洗30～40 min，去掉種子表皮的污垢和塵埃；用75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗3 次；用次氯酸鈉消毒2.5 min，無菌水沖洗4次。

1.2.2 菌液制備 將試驗(yàn)菌株在無菌環(huán)境下分別轉(zhuǎn)接于50 mL TSB 培養(yǎng)基中，混勻后放置28 ℃搖床中暗培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)好的菌液置于4 ℃低溫離心機(jī)中，8 000 r/min 離心15 min。棄上層液體，收集菌體，將菌體分別與純水混勻。將4個菌株以1∶1∶1∶1與50 mL 純水混勻制成Mix。上述PGPB 菌液OD600均為0.05。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計試驗(yàn)共設(shè)6 個處理，分別以無菌水（CK）、F195、Z24、Z39、Z89 菌株和Mix 混合菌株進(jìn)行處理。每個處理設(shè)置3 個重復(fù)，每個重復(fù)30 粒種子。將消毒處理后的金鐵鎖種子置于無菌濾紙上，吸干水分后，分別置于無菌培養(yǎng)皿中（放置2層無菌濾紙，加入5 mL 菌液濕潤）。將培養(yǎng)皿置于相對濕度75%、25 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。每隔1 d更換1 次濾紙，并加入5 mL 新鮮菌液，所有操作在無菌條件下進(jìn)行。以種子胚芽突破種皮為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，每天觀測并記錄1次萌發(fā)生長情況。

1.3 測定指標(biāo)與方法

發(fā)芽指標(biāo)測定：發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、日平均發(fā)芽率、活力指數(shù)、第1 粒種子萌發(fā)天數(shù)、種子萌發(fā)高峰期和平均發(fā)芽天數(shù)的計算參考楊亞茹等[10]和鄒成林等[14]的方法。吸水指標(biāo)測定：吸水百分率的計算參考馬潔等[15]的方法。幼苗生長指標(biāo)測定：每個處理挑取8 株長勢較好的幼苗進(jìn)行根系長度、胚芽長度、幼苗鮮質(zhì)量和幼苗干質(zhì)量的測定[14]。使用游標(biāo)卡尺對根系長度和胚芽長度進(jìn)行測量；將幼苗置于80 ℃烘箱中烘干，使用電子天平稱量幼苗鮮質(zhì)量和幼苗干質(zhì)量。指標(biāo)測量結(jié)果為各個處理的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2019 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，使用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行多因素方差分析，使用Origin 2018進(jìn)行主成分與聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 含ACC脫氨酶的不同PGPB菌株對金鐵鎖種子萌發(fā)特性的影響

從表1 可知，經(jīng)含ACC 脫氨酶的不同PGPB 菌株處理后，F(xiàn)195、Z24、Z39 和Mix 處理的種子萌發(fā)指標(biāo)顯著高于CK（P＜0.05）。F195、Z24、Z39 和Mix 處理的發(fā)芽率與CK 相比，分別提高了32%、24%、10%、15%；F195 處理的發(fā)芽勢最高，為74.44%，比CK 提高了49%，其次是Z24、Z39 和Mix 處理，發(fā)芽勢分別比CK提高了29%、18%、24%；F195、Z24、Z39和Mix 處理的發(fā)芽指數(shù)與CK 相比，分別提高了223%、179%、76%、145%；F195、Z24、Z39 和Mix 處理的日平均發(fā)芽率與CK 相比，分別提高了32%、24%、10%、15%。同時，不同PGPB 菌株處理在金鐵鎖種子的活力指數(shù)上也存在顯著差異（P＜0.05）。其中，F(xiàn)195 處理的活力指數(shù)最高，為56.20，比CK 提高了358%；其次是Z24、Z39 和Mix 處理，分別比CK提高了210%、80%、155%。由此可見，含ACC 脫氨酶的F195、Z24、Z39 和Mix 菌株對金鐵鎖種子萌發(fā)具有明顯的促進(jìn)作用。其中，F(xiàn)195 菌株處理效果最佳。

表1 含ACC脫氨酶的不同PGPB菌株對金鐵鎖種子萌發(fā)特性的影響Tab.1 Effect of different PGPB strains containing ACC deaminase on germination characteristics of P.tunicoides seeds

2.2 含ACC脫氨酶的不同PGPB菌株對金鐵鎖種子發(fā)芽時間的影響

由表2 可知，經(jīng)F195、Z24、Z39 和Mix 菌株處理后金鐵鎖種子的第1粒種子萌發(fā)天數(shù)明顯短于CK，分別比CK 提前3、2、1、1 d 萌發(fā)；Z89 處理比CK 晚1 d萌發(fā)，處理效果不佳。F195和Z24處理均在14 d達(dá)到萌發(fā)高峰期，比CK 提前2 d。F195 處理金鐵鎖種子平均發(fā)芽天數(shù)最短，為8.30 d；Z89 處理金鐵鎖種子平均發(fā)芽天數(shù)最長，為8.95 d，增加了種子平均發(fā)芽天數(shù)。綜上可知，F(xiàn)195、Z24、Z39 和Mix 處理對金鐵鎖種子萌發(fā)有促進(jìn)作用，而Z89 處理有抑制作用。其中，促進(jìn)金鐵鎖種子萌發(fā)效果最佳的菌株為F195，Z24菌株次之。

表2 含ACC脫氨酶的不同PGPB菌株對金鐵鎖種子發(fā)芽時間的影響Tab.2 Effect of different PGPB strains containing ACC deaminase on germination time of P.tunicoides seeds

2.3 含ACC脫氨酶的不同PGPB菌株對金鐵鎖種子吸水百分率的影響

從圖1 可知，經(jīng)含ACC 脫氨酶的不同PGPB 菌株處理后，金鐵鎖種子吸水百分率均呈先上升后趨于平穩(wěn)趨勢。處理24～32 h 金鐵鎖種子吸水百分率急劇增長，處理40 h 吸水速度趨緩。處理48 hF195、Z24、Z39和Mix處理的金鐵鎖種子吸水百分率與CK 呈顯著性差異（P＜0.05），分別比CK 高出80%、44%、13%、27%；而菌株Z89 處理的吸水百分率比CK 低14%。綜合比較來看，菌株F195、Z24、Z39 和Mix 處理能夠有效提高金鐵鎖種子吸水百分率。

圖1 含ACC脫氨酶的不同PGPB菌株對金鐵鎖種子吸水百分率的影響Fig.1 Effect of different PGPB strains containing ACC deaminase on water absorption of P.tunicoides seeds

2.4 含ACC脫氨酶的不同PGPB菌株對金鐵鎖幼苗生長的影響

由圖2A、2B 可知，經(jīng)含ACC 脫氨酶的不同菌株處理后，金鐵鎖根系長度和胚芽長度與CK 相比存在顯著性差異（P＜0.05），且隨著處理時間的延長，根系長度和胚芽長度的總體變化一致，均呈上升趨勢。其中，F(xiàn)195 處理隨著時間的推移，其根系長度和胚芽長度與CK 相比，每個時間點(diǎn)分別提高了63%、65%、69%、60%、71%和63%、55%、34%、42%、55%。Z89 處理的根系長度和胚芽長度上升較緩慢，一直處于較低水平，且總體波動不大；而其他處理則在CK 與F195 處理之間波動，其根系長度和胚芽長度一直隨時間的延長而遞增，且Z24和Mix處理表現(xiàn)較為相似。由此可以看出，在促進(jìn)金鐵鎖幼苗的根系長度和胚芽長度增加，從而促進(jìn)幼苗生長方面，F(xiàn)195菌株處理最佳，Z24和Mix菌株處理次之。

從圖2C、2D 可知，不同菌株處理的幼苗鮮質(zhì)量和干質(zhì)量與CK 相比差異顯著（P＜0.05）。其中，F(xiàn)195處理的幼苗鮮質(zhì)量和幼苗干質(zhì)量效果最好，分別比CK 提高76%、131%；其次為Z24 和Mix 處理，其幼苗干、鮮質(zhì)量均呈現(xiàn)相似的變化趨勢；而Z89處理的幼苗鮮質(zhì)量和幼苗干質(zhì)量仍然處于較低水平。由此可見，F(xiàn)195、Z24、Z39 和Mix 菌株對金鐵鎖幼苗的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量具有促進(jìn)作用，而Z89 菌株則抑制了幼苗的干、鮮質(zhì)量。綜上，促進(jìn)金鐵鎖幼苗干、鮮質(zhì)量增加效果最佳的菌株為F195，Z24和Mix次之。

圖2 含ACC脫氨酶的不同PGPB菌株對金鐵鎖幼苗生長的影響Fig.2 Effect of different PGPB strains containing ACC deaminase on seedling growth of P.tunicoides

2.5 含ACC脫氨酶的不同PGPB菌株對金鐵鎖種子萌發(fā)生長影響的綜合性評價

2.5.1 含ACC脫氨酶的不同PGPB菌株對金鐵鎖種子萌發(fā)生長影響的主成分分析 對含ACC 脫氨酶的不同PGPB 菌株處理的金鐵鎖種子的11 個萌發(fā)生長指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，可以綜合反映不同PGPB 菌株對金鐵鎖種子萌發(fā)促生的影響。共提取1 個主成分（PC1），其貢獻(xiàn)率為89.82%，累計貢獻(xiàn)率為89.82%（表3）。其中，胚芽長度（0.317）、根系長度（0.316）、發(fā)芽率（0.316）、日平均發(fā)芽率（0.316）及活力指數(shù)（0.315）在主成分1 中載荷較高。因此，胚芽長度、根系長度、發(fā)芽率、日平均發(fā)芽率和活力指數(shù)可作為評價不同PGPB 菌株對金鐵鎖種子萌發(fā)生長影響的重要指標(biāo)。

表3 含ACC脫氨酶的不同PGPB菌株對金鐵鎖種子萌發(fā)生長影響的主成分分析Tab.3 Principal component analysis of the effect of different PGPB strains containing ACC deaminase on seed germination and growth of P.tunicoides

2.5.2 含ACC脫氨酶的不同PGPB菌株對金鐵鎖種子萌發(fā)生長影響的聚類分析 為進(jìn)一步確定含

ACC 脫氨酶的不同PGPB 菌株在金鐵鎖種子萌發(fā)生長方面的效果，對不同處理下萌發(fā)生長指標(biāo)進(jìn)行聚類分析（圖3）?？梢钥闯?，在歐氏距離為34 時，可以將不同的菌株聚為3 類。其中，萌發(fā)效果較好的F195 菌株為第Ⅰ類，萌發(fā)效果中等的Z24、Mix 和Z39 菌株為第Ⅱ類，萌發(fā)效果較差的Z89 菌株為第Ⅲ類，說明含ACC 脫氨酶的PGPB 菌株在不同程度上能促進(jìn)金鐵鎖種子萌發(fā)生長。其中，F(xiàn)195菌株處理效果最好。

圖3 含ACC脫氨酶的不同PGPB菌株對金鐵鎖種子萌發(fā)生長影響的聚類分析Fig.3 Cluster analysis of the effeit of different PGPB strains containing ACC deaminase on seed germination and growth of P.tunicoides

3 結(jié)論與討論

研究表明，具ACC 脫氨酶活性的PGPB 依附在種子表皮時，可通過合成ACC 來調(diào)節(jié)植物中乙烯的水平，尤其是在播種后的幾天，不僅可以促進(jìn)植物的萌發(fā)，還可提高植物幼苗的成活率[16-19]。本研究通過用前期篩選出的含ACC脫氨酶的不同PGPB菌株對金鐵鎖種子進(jìn)行浸種處理發(fā)現(xiàn)，其對金鐵鎖種子萌發(fā)及幼苗生長的影響存在顯著性差異（P＜0.05）。

種子發(fā)芽率是衡量種子質(zhì)量好壞的首選指標(biāo)，種子發(fā)芽勢是鑒別種子發(fā)芽整齊度的主要指標(biāo)，以上指標(biāo)都是驗(yàn)證種子發(fā)芽的重要指標(biāo)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，含ACC 脫氨酶活性的PGPB 菌株對金鐵鎖種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)等均有明顯促進(jìn)作用，與宋發(fā)軍等[21]和楊亞茹等[10]的試驗(yàn)研究結(jié)果一致，這可能是PGPB 接觸種子后，不僅降低了乙烯水平，還提高了植物體內(nèi)分裂素和生長素的代謝，從而促進(jìn)萌發(fā)[13]。種子吸水特征是反映種子生長最重要的指標(biāo)，也是對外源環(huán)境最敏感的時刻[22-23]。F195、Z24、Z39 和Mix 菌株對金鐵鎖種子的吸水百分率均有促進(jìn)作用，種子吸水百分率增加后，可以增強(qiáng)金鐵鎖種子抗脅迫能力，進(jìn)而提高發(fā)芽效果。其中，F(xiàn)195菌株處理效果最為明顯。主成分分析結(jié)果顯示，發(fā)芽率、日平均發(fā)芽率及活力指數(shù)等在主成分1中均具有較高載荷，表明發(fā)芽率、日平均發(fā)芽率及活力指數(shù)等可作為評價金鐵鎖種子萌發(fā)效果的重要指標(biāo)。

植物形態(tài)是反映植物長勢的重要指標(biāo)，可明顯反映出不同處理對植物生長的影響[24]。在本研究中，種子萌發(fā)，繼續(xù)被含ACC脫氨酶活性的PGPB菌株處理，金鐵鎖幼苗的根系長度、胚芽長度、幼苗鮮質(zhì)量和幼苗干質(zhì)量均呈上升趨勢，表明含ACC 脫氨酶活性的PGPB 菌株對幼苗的生長具有促進(jìn)作用，與譚佳緣[25]采用堿蓬內(nèi)生菌EF0802 對水稻幼苗的促生研究結(jié)果一致。這可能是隨著種子萌發(fā)，植物根際中會短暫分泌ACC，而含ACC 脫氨酶活性的PGPB 菌株利用ACC 作為氮源生長，增強(qiáng)活性能力，從而加快植物地上部分和地下部分的生長[11]。不同的菌株處理可以在不同程度上使金鐵鎖幼苗的根系長度、胚芽長度、幼苗鮮質(zhì)量和幼苗干質(zhì)量增加，從而提高植物長勢，特別是F195菌株對金鐵鎖幼苗的促進(jìn)效果極為顯著。主成分分析結(jié)果表明，胚芽長度和根系長度在主成分1 中載荷較高，由此可以看出，胚芽長度和根系長度可作為評價金鐵鎖幼苗生長的重要指標(biāo)；同時聚類分析結(jié)果表明，促進(jìn)效果最為顯著的F195 菌株單獨(dú)聚為一支。以上研究表明，F(xiàn)195菌株在促進(jìn)金鐵鎖種子萌發(fā)生長進(jìn)程中起到重要作用。

本研究結(jié)果表明，含ACC 脫氨酶活性的PGPB菌株能有效促進(jìn)金鐵鎖種子的萌發(fā)及其幼苗的生長。目前，國內(nèi)外對具ACC 脫氨酶活性的PGPB 相關(guān)研究主要集中于促進(jìn)植物生長、增強(qiáng)植物抗性以及促進(jìn)植物次生代謝產(chǎn)物發(fā)揮功能等方面[26]。SHIVSING 等[27]從雜交玉米PEEHM-5 和復(fù)合PC-4中分離出含ACC 脫氨酶活性的內(nèi)生細(xì)菌，并進(jìn)行了地上部和根系試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，使用含ACC 脫氨酶活性的菌株可以減少近25%的化肥投入。BARNAWAL等[28]研究表明，含ACC 脫氨酶的假單胞菌可以提高罌粟對棉鈴蟲、霜霉病的耐性。漫靜等[29]從羊草根際中分離出了含ACC 脫氨酶活性的內(nèi)生細(xì)菌，并發(fā)現(xiàn)其對羊草生長均具有促進(jìn)作用。由此可知，深入研究具ACC脫氨酶的PGPB對農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

綜上所述，含ACC 脫氨酶的不同PGPB 菌株對金鐵鎖種子萌發(fā)及生長的影響存在一定差異，說明適宜的菌株能在較短時間內(nèi)促進(jìn)種子萌發(fā)及其幼苗生長，進(jìn)一步提高人工育苗效率。因此，對于不同作物可探討不同植物促生菌的促生效果，為微生物菌肥的開發(fā)利用及作物的高效栽培技術(shù)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。