靈芝提取物對帕金森病模型細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

黃茜任志麗

（1.重慶城市管理職業(yè)學(xué)院智慧康養(yǎng)學(xué)院，重慶401331； 2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京100053）

帕金森病是中老年人常見的神經(jīng)退行性疾病之一，也是中老年人最常見的運(yùn)動功能障礙性疾病，其主要病理特點(diǎn)為黑質(zhì)紋狀體通路的多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生退行性病變減少和死亡，使神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺水平下降，主要臨床表現(xiàn)為運(yùn)動功能障礙，包括靜止性震顫、運(yùn)動遲緩、肌張力增高和姿勢不穩(wěn)等［1］。目前治療帕金森病的藥物大多通過增加腦內(nèi)多巴胺水平或模擬多巴胺效應(yīng)來控制癥狀，但長期服用存在較大的不良反應(yīng)，并在使用一定時間后會出現(xiàn)療效減退及遠(yuǎn)期副作用。

我國傳統(tǒng)中藥靈芝，被歷代醫(yī)藥家尊為“滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正固本”的神奇珍品，對人體具有雙向調(diào)節(jié)作用，涉及心腦血管、消化、神經(jīng)、內(nèi)分泌、呼吸、運(yùn)動等系統(tǒng)，尤其對腫瘤、肝臟病變、失眠、衰老的防治作用最為顯著［2-4］。研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖的抗氧化作用，可以減輕神經(jīng)毒素對多巴胺能神經(jīng)元的損傷［5-6］。

本研究將采用小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞neuro-2a，通過多巴胺能特異性神經(jīng)毒素MPP＋損傷，抑制線粒體復(fù)合物I，觀察靈芝提取物對MPP＋損傷線粒體功能的影響，并從細(xì)胞凋亡的角度探究靈芝可能發(fā)揮的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞 neuro-2a 小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.2 試劑與藥物 靈芝提取物由培力（南寧）藥業(yè)有限公司提供，批號為A1800775，其中靈芝多糖約為98.1 mg／g，占10%。1-甲 基-4-苯基吡啶離子（MPP＋），購于美國Sigma 公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）購于日本Dojindo公司；JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒，購于美國Biotium 公司；活性氧檢測試劑盒、ATP 檢測試劑盒，購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Cytochrome C 抗體，購于英國Abcam公司；caspase-3抗體、caspase-9 抗體，購于美國Cell Signaling Technology 公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)neuro-2a 小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞，并置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照1∶3 比例傳代，2～4 d 傳1 代。利用細(xì)胞計數(shù)板調(diào)整細(xì)胞密度，將細(xì)胞接種于合適的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中。實(shí)驗(yàn)共分3組，正常組（加入PBS 和靈芝提取物溶解介質(zhì)）、模型組（加入1 mmol／L 溶于PBS 的MPP＋和相應(yīng)體積的靈芝提取物溶解介質(zhì)）、靈芝提取物組（加入1 mmol／L 溶于PBS 的MPP＋和800 μg／mL 溶解于相應(yīng)培養(yǎng)基的靈芝提取物）。

2.2 細(xì)胞活性檢測 收集對數(shù)生長期neuro-2a 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105／mL，每孔100 μL 接種于96 孔板（邊緣孔用相應(yīng)培養(yǎng)基填充）。5%CO2、37 ℃孵育至細(xì)胞穩(wěn)定貼壁，細(xì)胞單層鋪滿孔底時，各孔加入相應(yīng)藥物，并設(shè)置3～5 個復(fù)孔。同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基），對照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)基）。重新更換培養(yǎng)基，小心吸除孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 用相應(yīng)培養(yǎng)基新鮮配制的CCK-8 溶液，于培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h，采用1 mmol／L MPP＋培養(yǎng)48 h，同時給予100、200、400、800 μg／mL 靈芝提取物，使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長處檢測吸光度，計算細(xì)胞存活率。

2.3 線粒體膜電位檢測 取對數(shù)生長期的neuro-2a 細(xì)胞進(jìn)行線粒體膜電位（MMP）觀察，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105／mL，分組及培養(yǎng)方法同“2.1”項(xiàng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，進(jìn)行JC-1 熒光染色。首先將含有10%FBS 的DMEM 高糖培養(yǎng)基預(yù)先平衡至室溫，用相應(yīng)培養(yǎng)基稀釋熒光染料JC-1 至1×，吸棄培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，PBS 清洗1次，每孔加入200 μL 含有JC-1 的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱孵育30 min，棄培養(yǎng)基，PBS 清洗2次，去除未結(jié)合的熒光染料，熒光倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.4 細(xì)胞免疫熒光染色 細(xì)胞按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組給藥培養(yǎng)12 h后，將培養(yǎng)基吸出后，PBS 清洗3次，4%多聚甲醛固定15～30 min，0.3% Triton X-100 和0.01 mol／L PBST 清洗3次，滴加10%胎牛血清封閉液，室溫封閉1 h，傾去，勿洗，滴加一抗 ［cytochrome C（1∶400），LC3B（1∶ 1 000）］，4 ℃孵育過夜，PBS清洗3次，每次10 min；滴加二抗，37 ℃孵育1 h，PBS 清洗3次，每次10 min，滴加DAPI 復(fù)染，作用1 min，再滴加抗熒光淬滅封片劑。激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.5 Western blot 法檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，用RIPA 裂解液提取蛋白，并測定蛋白濃度。采用SDSPAGE 凝膠電泳后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，PVDF膜，200 mA 恒流電轉(zhuǎn)1.5 h，加入5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，去除封閉液，加入一抗，4 ℃過夜孵育，TBST 洗膜，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，使用ECL 發(fā)光法顯影，目的蛋白相對表達(dá)量以目的條帶灰度值與β-actin 灰度值的比值表示。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 11.5 軟件進(jìn)行處理，Sigmaplot 繪圖軟件作圖，結(jié)果以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 靈芝提取物對MPP＋誘導(dǎo)neuro-2a 細(xì)胞活性的影響 與正常組比較，模型組neuro-2a 細(xì)胞活性降低（P＜0.01）；與模型組比較，800 μg／mL 靈芝提取物組neuro-2a 細(xì)胞活性升高（P＜0.05），見圖1。提示靈芝提取物能夠提高M(jìn)PP＋誘導(dǎo)的neuro-2a 細(xì)胞活性。

圖1 靈芝提取物對MPP＋誘導(dǎo)neuro-2a 細(xì)胞活性的影響（， n＝3）

3.2 靈芝提取物對MPP＋誘導(dǎo)的neuro-2a 細(xì)胞線粒體膜電位的影響 正常組除極少數(shù)細(xì)胞被染綠色外，紅色熒光幾乎布滿整個視野，表明正常細(xì)胞線粒體膜電位較高，JC-1以聚合物的形式存在于線粒體膜內(nèi)，紅色熒光多且亮；與正常組比較，模型組neuro-2a 細(xì)胞JC-1 從線粒體內(nèi)釋放，濃度降低，逆轉(zhuǎn)為發(fā)射綠色熒光的單體形式，線粒體跨膜電位去極化，并且隨著損傷時間的延長，紅色熒光逐漸減少，綠色熒光逐漸增加，最終幾乎全部細(xì)胞都被染為綠色，表明線粒體膜電位降低，線粒體遭到嚴(yán)重破壞；與模型組比較，靈芝提取物組neuro-2a 細(xì)胞線粒體膜電位水平升高，表現(xiàn)為紅色熒光的增加和綠色熒光的減少，見圖2。提示靈芝提取物可以增加MPP＋誘導(dǎo)的neur-2a 細(xì)胞線粒體膜電位。

圖2 靈芝提取物對MPP＋誘導(dǎo)的neuro-2a 細(xì)胞線粒體膜電位的影響（×200）

3.3 靈芝提取物對MPP＋誘導(dǎo)的neuro-2a 細(xì)胞線粒體色素C 的影響 正常組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C 的綠色熒光與標(biāo)記線粒體的紅色熒光基本重疊，表明細(xì)胞色素C 與線粒體共定位［7］；模型組細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C 的綠色熒光呈彌散狀態(tài)，與線粒體紅色熒光不能共定位，表明細(xì)胞色素C 從線粒體釋放；靈芝提取物組細(xì)胞內(nèi)這種“不共定位”的情況有所改善，見圖3。提示MPP＋可以誘導(dǎo)neuro-2a 細(xì)胞產(chǎn)生凋亡反應(yīng)，并且靈芝提取物可以抑制MPP＋誘導(dǎo)的細(xì)胞色素C從線粒體的釋放。

圖3 靈芝提取物對MPP＋誘導(dǎo)的neuro-2a 細(xì)胞線粒體色素C 的影響（×400）

3.4 靈芝提取物對MPP＋誘導(dǎo)的neuro-2a 細(xì)胞cleavedcaspase-3／pro-caspase-3、cleaved-caspase-9／pro-caspase-9 表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組neuro-2a 細(xì)胞cleavedcaspase-3／pro-caspase-3、cleaved-caspase-9／pro-caspase-9 表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，靈芝提取物組neuro-2a細(xì)胞cleaved-caspase-3／pro-caspase-3、cleaved-caspase-9／procaspase-9 表達(dá)降低（P＜0.01），見圖4。

圖4 靈芝提取物對MPP＋誘導(dǎo)的neuro-2a 細(xì)胞caspase-3、caspase-9 蛋白表達(dá)的影響（， n＝3）

4 討論

MPP＋能造成線粒體損傷［8］，因此本研究選用MPP＋誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。ATP 的合成是線粒體功能的核心，起著至關(guān)重要的作用，特別是線粒體的產(chǎn)生及其生理功能在調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞以及維持突觸可塑性方面尤為重要［9-10］。帕金森病患者腦中多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的丟失程度與這些細(xì)胞組中caspase-3 陽性神經(jīng)元的百分比呈正相關(guān)，這種關(guān)聯(lián)在帕金森病動物模型中亦可觀察到，這表明表達(dá)caspase-3 的神經(jīng)元比那些不表達(dá)的神經(jīng)元對病理損傷過程更敏感。另外，電子顯微鏡觀察表明，caspase-3 激活先于帕金森病并且不是帕金森病中凋亡細(xì)胞死亡的結(jié)果［11］。

細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元丟失的主要原因［12-13］，與自噬對細(xì)胞存活的雙向調(diào)節(jié)作用不同，凋亡對細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)是單向性的，它能及時主動清除機(jī)體衰老及異常細(xì)胞發(fā)揮清道夫作用［14］。MPP＋作用后，引起caspase-3、caspase-9 活化，表現(xiàn)為活化亞基水平升高，因此，初步判斷caspase 家族在MPP＋介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中起著重要作用，其中caspase-3 為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。caspase-3 正常以酶原（32 kDa）的形式存在于胞漿中，在凋亡早期階段被激活，活化的caspase-3 由2 個大亞基（17 kDa）和2 個小亞基（12 kDa）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究通過采用MPP＋損傷線粒體，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位下降和細(xì)胞色素C 釋放，從而促進(jìn)caspase 通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。使用靈芝提取物干預(yù)后，不同程度、不同方面減輕了線粒體損傷，從而抑制了細(xì)胞凋亡，可能對于提高多巴胺能神經(jīng)元生存率或者改善微環(huán)境具有特殊的意義［15］，也對于靈芝今后在帕金森病的應(yīng)用和開發(fā)利用有著一定的借鑒作用。