化濁解毒疏肝方對戊四氮致癇模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及AC-cAMPCREB 通路的影響

平鑫 秦少坤劉書寧蘆曄曹亞飛張延紅趙亞男裴林*張少丹

（1.河北省中醫(yī)藥科學(xué)院，河北 石家莊050031； 2.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊050200； 3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊050073）

癲癇是一種大腦神經(jīng)元異常突發(fā)同步放電，導(dǎo)致出現(xiàn)中樞神經(jīng)功能障礙的疾病。我國癲癇患者約有1 000萬［1］，而其中約30%癲癇患者出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶能力障礙，嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量［2］。

癲癇患者發(fā)生學(xué)習(xí)記憶功能損傷的機(jī)制尚不明朗，且影響因素較復(fù)雜，目前較多研究認(rèn)為其機(jī)制與神經(jīng)遞質(zhì)異常、腦組織受損、氧化應(yīng)激等有關(guān)［3-6］。環(huán)磷酸腺苷（cAMP）是由激活腺苷酸環(huán)化酶（AC）催化腺嘌呤核苷三磷酸水解而生成，其核蛋白——環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）是產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄變化的傳導(dǎo)因子，在調(diào)控信號通路中起到關(guān)鍵作用，其活化后參與了調(diào)節(jié)突觸可塑性和長期記憶形成的過程，在調(diào)節(jié)工作和學(xué)習(xí)記憶等生物學(xué)功能中發(fā)揮著重要作用［7-8］。

化濁解毒疏肝方，原名調(diào)肝解毒方，是基于“濁毒”理論研究的中藥復(fù)方，認(rèn)為 “癇病”可歸因于風(fēng)、火、痰、瘀、五臟功能失調(diào)，之后內(nèi)化生毒并伏于腦絡(luò)，引發(fā)元神失控、癲癇抽搐。此方采用“化濁毒、調(diào)臟腑”的治則要點(diǎn)，通過觀察其改善癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的藥理效應(yīng)并探索作用機(jī)制，以期為抗癲癇及改善學(xué)習(xí)記憶障礙的治療提供新的思路。

1 材料

1.1 動物 SPF 級SD 雄性大鼠60只，體質(zhì)量100～120 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于正常規(guī)格聚砜鼠籠，室溫恒定于22 ℃，相對濕度60%。

1.2 試劑與藥物 化濁解毒疏肝方由黃芩12 g、柴胡12 g、絞股藍(lán)12 g、石菖蒲9 g、羅勒6 g、荷梗9 g 等組成，由安國市伊康藥業(yè)有限公司提供，批號190103。丙戊酸鈉片（批號181003，湖南省湘中制藥有限公司）；戊四氮（批號P6500-25G，美國Sigma-Aldrich 公司）；AC 兔抗大鼠多克隆抗體（批號TA322232，美國OriGene 公司）；cAMP 兔抗大鼠多克隆抗體（批號ab76238，英國Abcam 公司）；CREB、pCREB 兔抗大鼠多克隆抗體（批號9197、9198，美國Cell Signaling Technology 公司）；增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗兔IgG、10%山羊血清、TA-09 β-actin、Western blot 魯米諾化學(xué)發(fā)光試劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；BS-0061R β-actin（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。無水乙醇、二甲苯（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 儀器 電子天平（德國Sartorius 公司）；熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；微量加樣器（法國Gilson 公司）；RM2016 型切片機(jī)（德國Leica 公司）；KD-T 型攤烤片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；高速離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（北京六一儀器廠）；Morris 水迷宮、八臂迷宮（上海洛維生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥 60 只大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，丙戊酸鈉組，化濁解毒疏肝方低、高劑量組，每組12 只。參考文獻(xiàn)［9］報(bào)道，除正常組外，其余各組大鼠均建立癲癇模型，每天腹腔注射戊四氮40 mg／kg，另設(shè)正常組，每天腹腔注射等體積生理鹽水，共28 d，腹腔注射后密切觀察大鼠癇性發(fā)作行為1 h。大鼠癇性發(fā)作評價(jià)采用Lado 分級標(biāo)準(zhǔn)［10］，見表1。造模周期內(nèi)連續(xù)5 d 出現(xiàn)3.5級以上的癇性發(fā)作表現(xiàn)，即視為造模成功。28 d 造模結(jié)束后，第29 天進(jìn)入灌胃給藥階段，給藥周期為4 周?；瘽峤舛臼韪畏降汀⒏邉┝拷M大鼠每天灌胃給予藥物2.7、5.4 g／kg，丙戊酸鈉組大鼠每天灌胃給予藥物189 mg／kg，正常組和模型組大鼠每天灌胃給予生理鹽水10 mL／kg。

表1 Lado 分級標(biāo)準(zhǔn)

2.2 行為學(xué)測試

2.2.1 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 末次給藥后第2天，通過Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)開展學(xué)習(xí)能力和記憶能力測試。每組選取10 只大鼠，實(shí)驗(yàn)開始后依次將大鼠從各個(gè)象限墻壁中心位置入水，要求120 s 內(nèi)搜索水下隱藏平臺，待大鼠爬上平臺則單次測試結(jié)束。若時(shí)間截止大鼠仍未爬上平臺，則在下一次測試前將大鼠放置平臺上適應(yīng)30 s。前4 天測試為定位航行實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠尋找平臺的逃避潛伏期，第5 天測試為空間探索實(shí)驗(yàn)，當(dāng)撤掉水下平臺后，記錄大鼠穿越原平臺位置的次數(shù)。

2.2.2 八臂迷宮實(shí)驗(yàn) Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)完成后第2天，通過八臂迷宮實(shí)驗(yàn)評估大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力［11］。每組選取經(jīng)過Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)的10 只大鼠，在正式實(shí)驗(yàn)開始前進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)性訓(xùn)練2 d，每天2次，每次訓(xùn)練10 min，以便大鼠熟悉迷宮環(huán)境及建立攝食策略。為保證大鼠足夠的攝食動力，正式測試前所有大鼠均被禁食24 h。將八臂迷宮實(shí)驗(yàn)的1、2、4、7 號臂放入飼料且固定為喂食臂。觀察大鼠10 min 內(nèi)的攝食活動并記錄大鼠重復(fù)進(jìn)入喂食臂總數(shù)為工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)，重復(fù)進(jìn)入非喂食臂總數(shù)為參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)，兩者之和為總錯(cuò)誤次數(shù)。每次測試結(jié)束后，將八臂迷宮實(shí)驗(yàn)用75%乙醇擦拭、晾干，以防止氣味信號對大鼠的干擾作用。

2.3 免疫熒光法檢測海馬神經(jīng)元AC、cAMP、CREB 表達(dá) 每組選取5 只經(jīng)過行為學(xué)測試的大鼠，深度麻醉后解剖暴露心臟，從心尖處插管依次進(jìn)行生理鹽水沖洗和4%多聚甲醛固定，全腦取材并石蠟包埋后，制備8 μm 的冠狀連續(xù)切片。腦切片在二甲苯中脫蠟后，依次在梯度乙醇中脫水，0.3%過氧化氫孵育?？乖崛〔捎?0%檸檬酸鈉緩沖液98 ℃加熱，冷卻后孵育山羊血清。組織切片用AC、cAMP、CREB 兔抗大鼠多克隆抗體孵育于4 ℃冰箱過夜。加入二抗避光孵育和DAPI 復(fù)染，封片。每1 個(gè)標(biāo)本選取5個(gè)切片，每1 個(gè)切片隨機(jī)選取5 張視野圖像，觀察海馬CA1、CA3、DG 區(qū)的表達(dá)。

2.4 Western blot 法檢測海馬組織AC、cAMP、CREB、pCREB 的表達(dá) 每組另取5 只經(jīng)過行為學(xué)測試的大鼠，麻醉處死后直接取腦，剝離海馬后稱定質(zhì)量，并置于凍存管內(nèi)標(biāo)記，-80 ℃冷凍保存。取100 mg 腦組織，加入液氮研碎組織，研磨成液體狀，轉(zhuǎn)至EP 管后降溫并離心，標(biāo)本取上清液胞漿蛋白，立即-80 ℃分裝冷凍保存。根據(jù)蛋白定量結(jié)果，加入組織總蛋白樣品與凝膠電泳上樣緩沖液，95 ℃變性10 min。將樣品加入凝膠孔中，接通電源并將樣品通過濃縮膠與分離膠。采用濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，分別孵育非標(biāo)記一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗。化學(xué)發(fā)光法顯色，Image J 軟件分析灰度值，以β-actin 灰度值為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)蛋白相對表達(dá)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 化濁解毒疏肝方對大鼠癲癇發(fā)作情況的影響 與模型組比較，丙戊酸鈉組和化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠癲癇發(fā)作等級降低（P＜0.05，P＜0.01），各給藥組大鼠癲癇發(fā)作潛伏期延長（P＜0.05，P＜0.01），見表2。

表2 化濁解毒疏肝方對大鼠癲癇發(fā)作情況的影響（，n＝10）

表2 化濁解毒疏肝方對大鼠癲癇發(fā)作情況的影響（，n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與丙戊酸鈉組比較，＃＃P＜0.01；與化濁解毒疏肝方低劑量組比較，△△P＜0.01。

3.2 化濁解毒疏肝方對大鼠學(xué)習(xí)能力障礙的影響 各組大鼠在4 d 測試中的逃避潛伏期均有縮短趨勢。與模型組比較，正常組大鼠第3、4 天逃避潛伏期縮短（P＜0.05，P＜0.01），丙戊酸鈉組和化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠第4 天逃避潛伏期縮短（P＜0.05，P＜0.01），見表3。

3.3 化濁解毒疏肝方對大鼠記憶能力障礙的影響 與模型組比較，正常組、丙戊酸鈉組、化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠穿越平臺次數(shù)增加（P＜0.01）；與丙戊酸鈉組比較，化濁解毒疏肝方低劑量組大鼠穿越平臺次數(shù)減少（P＜0.05），化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠穿越平臺次數(shù)增加（P＜0.05）；與化濁解毒疏肝方低劑量組比較，化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠穿越平臺次數(shù)增加（P＜0.01），見表3、圖1。

表3 化濁解毒疏肝方對大鼠學(xué)習(xí)能力障礙、記憶能力障礙的影響（， n＝10）

表3 化濁解毒疏肝方對大鼠學(xué)習(xí)能力障礙、記憶能力障礙的影響（， n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與丙戊酸鈉組比較，＃P＜0.05；與化濁解毒疏肝方低劑量組比較，△△P＜0.01。

圖1 各組大鼠穿越平臺活動軌跡圖

3.4 化濁解毒疏肝方對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響 與模型組比較，正常組、丙戊酸鈉組、化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠的工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)、參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)、總錯(cuò)誤次數(shù)均減少（P＜0.01），化濁解毒疏肝方低劑量組大鼠總錯(cuò)誤次數(shù)減少（P＜0.05）；與丙戊酸鈉組比較，化濁解毒疏肝方低劑量組大鼠的參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)、總錯(cuò)誤次數(shù)增加（P＜0.05，P＜0.01），化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠的工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)、參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)、總錯(cuò)誤次數(shù)均減少（P＜0.05，P＜0.01）；與化濁解毒疏肝方低劑量組比較，化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠的工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)、參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)、總錯(cuò)誤次數(shù)均減少（P＜0.01），見表4。

表4 化濁解毒疏肝方對大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響（， n＝10）

表4 化濁解毒疏肝方對大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響（， n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與丙戊酸鈉組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與化濁解毒疏肝方低劑量組比較，△△P＜0.01。

3.5 化濁解毒疏肝方對大鼠海馬神經(jīng)元AC、cAMP、CREB 表達(dá)的影響 與模型組比較，正常組、丙戊酸鈉組、化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠海馬神經(jīng)元CA1 區(qū)、CA3 區(qū)、DG 區(qū)的AC、cAMP、CREB 表達(dá)均升高（P＜0.05，P＜0.01）；與化濁解毒疏肝方低劑量組比較，化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠海馬神經(jīng)元CA1 區(qū)、CA3 區(qū)、DG 區(qū)的AC、cAMP、CREB 表達(dá)均升高（P＜0.05，P＜0.01），見表5～7、圖2～4?；瘽峤舛臼韪畏降蛣┝拷M與模型組、丙戊酸鈉組、化濁解毒疏肝方高劑量組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故不予對照圖示。

圖2 免疫熒光檢測大鼠海馬組織中AC 的表達(dá)

表5 化濁解毒疏肝方對大鼠海馬神經(jīng)元AC 表達(dá)的影響（， n＝5）

表5 化濁解毒疏肝方對大鼠海馬神經(jīng)元AC 表達(dá)的影響（， n＝5）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與丙戊酸鈉組比較，＃P＜0.05；與化濁解毒疏肝方低劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

表6 化濁解毒疏肝方對大鼠海馬神經(jīng)元cAMP 表達(dá)的影響（， n＝5）

表6 化濁解毒疏肝方對大鼠海馬神經(jīng)元cAMP 表達(dá)的影響（， n＝5）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與丙戊酸鈉組比較，＃P＜0.05；與化濁解毒疏肝方低劑量組比較，△△P＜0.01。

表7 化濁解毒疏肝方對大鼠海馬神經(jīng)元CREB 表達(dá)的影響（， n＝5）

表7 化濁解毒疏肝方對大鼠海馬神經(jīng)元CREB 表達(dá)的影響（， n＝5）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與化濁解毒疏肝方低劑量組比較，△P＜0.05。

3.6 化濁解毒疏肝方對大鼠海馬組織AC、cAMP、CREB、pCREB 蛋白表達(dá)的影響 與模型組比較，正常組、丙戊酸鈉組、化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠海馬組織AC、cAMP、CREB、pCREB 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）；與化濁解毒疏肝方低劑量組比較，化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠海馬組織 AC、cAMP、CREB、pCREB 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見圖5。

圖3 免疫熒光檢測大鼠海馬組織中cAMP 的表達(dá)

圖4 免疫熒光檢測大鼠海馬組織中CREB 的表達(dá)

圖5 化濁解毒疏肝方對大鼠海馬組織AC、cAMP、CREB、pCREB 蛋白表達(dá)的影響（， n＝5）

4 討論

戊四氮化學(xué)點(diǎn)燃致癲癇是經(jīng)典的慢性癲癇發(fā)作模型，表現(xiàn)為降低神經(jīng)系統(tǒng)功能，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性不斷升高，同時(shí)連續(xù)降低癲癇發(fā)作閾值［12］。學(xué)習(xí)記憶能力障礙的主要表現(xiàn)為長時(shí)與短時(shí)學(xué)習(xí)記憶功能受損，注意力不集中，思維活動緩慢，對事物的感知能力減退等多方面功能損傷［13］。其病理機(jī)制可能是由于反復(fù)癇性發(fā)作，大腦發(fā)生不同程度的缺氧、代謝紊亂、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)過度釋放、組織酸中毒等現(xiàn)象，或出現(xiàn)神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)變異而導(dǎo)致的［14］。

本研究采用Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)和八臂迷宮實(shí)驗(yàn)作為評估癲癇大鼠空間及工作學(xué)習(xí)記憶能力的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法［15-16］，發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作若得以控制，學(xué)習(xí)記憶障礙也會得到改善。與正常組比較，模型組大鼠表現(xiàn)出癇性抽搐、驚厥癥狀，癲癇發(fā)作后，其學(xué)習(xí)記憶能力同時(shí)降低；給予化濁解毒疏肝方后，大鼠的行為學(xué)測試結(jié)果有明顯提升。

海馬組織歸屬于大腦的邊緣系統(tǒng)，是大腦中反映長短時(shí)學(xué)習(xí)記憶、空間定位、聲光反應(yīng)等行為能力的重要功能區(qū)域，其中的CA1、CA3、DG 區(qū)是癲癇領(lǐng)域研究的主要觀察部位［17-18］。海馬與癲癇的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，嚙齒類動物反復(fù)癇性發(fā)作會降低海馬信息處理的突觸可塑性，對海馬組織的長期記憶功能產(chǎn)生損傷［19］。研究發(fā)現(xiàn)，AC-cAMPCREB 通路與學(xué)習(xí)記憶領(lǐng)域的關(guān)系密切，其中cAMP 作為傳遞生命活動信息的“第二信使”，具備調(diào)節(jié)胞內(nèi)物質(zhì)代謝、修復(fù)和活化腦細(xì)胞的功能。當(dāng)具有記憶功能的cAMP 核內(nèi)蛋白CREB 被激活，與突觸可塑性長時(shí)程增強(qiáng)產(chǎn)生和長時(shí)記憶鞏固密切相關(guān)［20］，它不僅介導(dǎo)短時(shí)記憶向長時(shí)記憶的轉(zhuǎn)變，還可促進(jìn)維持長時(shí)記憶形成，或激活其相關(guān)基因表達(dá)，尤其是磷酸化的CREB 轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)［21-22］。

丙戊酸鈉是傳統(tǒng)抗癲癇藥物中的臨床一線用藥，有研究證實(shí)其對癲癇所伴隨的學(xué)習(xí)記憶能力損傷具有改善作用［23］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組大鼠由于反復(fù)癲癇發(fā)作損傷導(dǎo)致AC-cAMP-CREB 通路相關(guān)蛋白表達(dá)降低；與模型組比較，經(jīng)化濁解毒疏肝方和丙戊酸鈉給藥后，大鼠相關(guān)蛋白表達(dá)均升高，其中高劑量化濁解毒疏肝方的表達(dá)更為突出，這表明該方可以升高AC-cAMP-CREB通路蛋白表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)CREB 轉(zhuǎn)錄水平改善了癲癇大鼠的學(xué)習(xí)記憶行為活動。同時(shí)也提示化濁解毒疏肝方改善癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的作用可能是參與上調(diào)AC-cAMPCREB 通路信號表達(dá)有關(guān)。

機(jī)體若有五臟失調(diào)，加以風(fēng)火痰瘀邪氣蘊(yùn)聚膠結(jié)，可內(nèi)發(fā)毒邪，伏藏于腦，損腦傷神則誘發(fā)癇病昏仆抽搐，此屬“濁毒證”范疇［24］。本研究采用化濁解毒疏肝方，可達(dá)清濕熱、化濁毒、理氣機(jī)、調(diào)臟腑之效，遂使癇病邪去，氣血調(diào)和，益腦養(yǎng)神，學(xué)習(xí)記憶損傷得以恢復(fù)。該方已在臨床研究中驗(yàn)證對癲癇患兒發(fā)作情況及神經(jīng)功能具有改善作用，尤其是明顯改善患兒的認(rèn)知功能［25］，故深入探究該方的作用機(jī)制將有益于對癲癇患者的臨床治療。

綜上所述，化濁解毒疏肝方在控制癲癇發(fā)作的同時(shí)可有效改善癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)AC-cAMP-CREB 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)而改善突觸可塑性，提升了學(xué)習(xí)記憶能力。