丹參中菲醌有效部位不同純化工藝的比較

徐雅蝶何瑞欣王琪張曉云房雨彤曹杰李秋桐唐婷婷黃仕文嵇晶鄭云楓程建明

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省中藥功效物質(zhì)重點實驗室，江蘇 南京210023）

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBunge 的干燥根和根莖，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品［1］，具有活血化瘀、通經(jīng)止痛等功效［2］，臨床用治療冠心病、心絞痛等癥［3-7］。其藥效物質(zhì)主要分為2類，分別是以丹參酮ⅡA、隱丹參酮等為代表的菲醌有效部位［8-10］，以及以丹酚酸B、迷迭香酸等為代表的酚酸有效部位［11-12］。

在純化工藝條件考察中，常采用紫外分光光度法（UV-vis）和HPLC 進(jìn)行定量分析；在評價純化效果時，常采用LC-MS 法。其中，UV-vis 操作簡單，分析速度快，適用于有效部位定量分析；HPLC-UVD 是對有紫外吸收成分同時進(jìn)行分離和定量的方法，比UV-vis 更準(zhǔn)確；LC-MS 是按照碎片離子質(zhì)荷比的大小進(jìn)行分離后檢測的方法，不管成分是否有紫外吸收都可被其檢測到，從而在評價純化工藝時更加全面。

關(guān)于丹參菲醌類的提取工藝在前期已有相關(guān)報道［13-14］，但鮮有涉及適用于工業(yè)化生產(chǎn)、獲得高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的丹參菲醌有效部位研究。因此，本實驗采用90%乙醇提取后，以總菲醌、隱丹參酮、丹參酮ⅡA的洗脫率及純度為指標(biāo)［15］，考察了3 種純化工藝，制備了質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)50%以上的總菲醌有效部位，以期為相關(guān)制劑進(jìn)一步開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 試劑與藥物 丹參酮ⅡA（批號Y20J8C40264）、隱丹參酮（批號C28M6Y1）、丹酚酸B（批號P24A10F86797）、迷迭香酸（批號Y06A9K67402）對照品（上海源葉生物科技有限公司，純度98%）；HPD-100 大孔樹脂、X-5 大孔樹脂、AB-8 大孔樹脂、D101 大孔樹脂、中性氧化鋁（北京索萊寶科技有限公司）。丹參購自安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司（批號18111203），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBunge 的干燥根及根莖。甲醇、乙腈為色譜純（美國Tedia 公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 Waters 2695 型高效液相色譜儀（配置Waters 2489 UV 檢測器）（美國Waters 公司）；Agilent 1260 Infinity型高效液相色譜儀（配置DAD 檢測器、二元泵系統(tǒng)、高通量自動進(jìn)樣器、樣品室溫度控制模塊）、Agilent 6530B Accurate-Mass Q-TOF 型電噴霧離子源（美國Agilent 公司）；UV-7504 型紫外可見分光光度計（上海精密儀器儀表有限公司）；DT6002C 型電子天平（成都恒基儀器有限公司）；STP FA2004 型電子分析天平（上海上平儀器有限公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DK-98-II 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；PTHW 型電熱套（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 上樣液制備 稱取藥材1 kg，10 倍量90% 乙醇浸泡0.5 h 后加熱回流1.5 h，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 HPLC 法測定隱丹參酮、丹參酮ⅡA含量

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取隱丹參酮、丹參酮ⅡA對照品適量，置于50 mL 棕色量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 選用HPD-100 大孔樹脂，按“2.2”項下方法制備上樣液，加水至上樣液含醇量為50%，上樣36 BV，待其全部通過樹脂后用90%乙醇洗脫27 BV，收集洗脫液，即得。

2.2.3 色譜條件 Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.05% 磷酸（B），梯度洗脫（0～15 min，10%～25%A；15～25 min，25%～26%A；25～30 min，26%～43% A；30～40 min，43%～74% A；40～60 min，74%A）；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長270 nm；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液（含隱丹參酮0.056 8 mg／mL、丹參酮ⅡA0.048 4 mg／mL）0.2、0.5、1、2、3、5、7 mL，甲醇定容至10 mL，在“2.2.3”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得隱丹參酮、丹參酮ⅡA方程分別為Y＝46.353X-14 512（R2＝0.999 7），線性范圍1.136～48.4 μg／mL；Y＝52.518X-17 998（R2＝0.999 7），線性范圍0.968～56.8 μg／mL。

2.2.5 精密度試驗 取對照品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得隱丹參酮、丹參酮ⅡA峰面積RSD 分別為0.44%、0.47%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.2.3”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得隱丹參酮、丹參酮ⅡA峰面積RSD 分別為1.76%、1.69%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取同一批藥材，按“2.2.2”項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得隱丹參酮、丹參酮ⅡA峰面積RSD 分別為1.18%、1.16%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的同一批藥材粉末，分別加入80%、100%、120% 水平對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.3”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，隱丹參酮平均加樣回收率為99.54%，RSD 為1.99%；丹參酮ⅡA平均加樣回收率為99.98%，RSD 為1.42%。

2.3 總菲醌含量測定 參照文獻(xiàn)［16］報道，以丹參酮ⅡA為對照品，采用紫外分光光度法測定。

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱取丹參酮ⅡA對照品11.30 mg，置于25 mL 棕色量瓶中，95%乙醇溶解定容至刻度，即得。

2.3.2 供試品溶液制備 將純化后樣品用95%乙醇稀釋并定容至10 mL，搖勻，即得。

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液40、60、80、100、120、150、180 μL，95% 乙醇定容至10 mL，以95%乙醇為空白，在270 nm 波長處測定其吸光度。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝98.868X-0.026 23（R2＝0.994 7），在1.808～8.136 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度試驗 取對照品溶液適量，按“2.3.3”項下方法測定6 次吸光度，測得其RSD 為1.58%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液適量，于0、2、4、8、12、24 h 按“2.3.3”項下方法測定吸光度，測得其RSD為2.86%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗 取同一批藥材，按“2.2.2”“2.3.2”項下方法各制備6 份供試品溶液，按“2.3.3”項下方法測定吸光度，測得其RSD 為2.57%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的同一批藥材粉末，分別加入80%、100%、120% 水平對照品溶液，按“2.2.2”“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項下方法測定吸光度，計算回收率。結(jié)果，總菲醌平均加樣回收率為99.27%，RSD 為1.58%。

2.4 LC-MS 分析

2.4.1 色譜條件 Agilent Poroshell 120SB-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，2.7 μm）；流動相乙腈（A）-水（含0.1%甲酸）（B），梯度洗脫（0～15 min，10%～25% A；15～25 min，25%～26%A；25～30 min，26%～43%A；30～40 min，43%～74% A；40～60 min，74% A）；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；分析時間60 min。

2.4.2 質(zhì)譜條件 負(fù)離子檢測模式；霧化氣溫度（TEM）500 ℃；源內(nèi)氣（GS1、GS2，N2）60 psi（1 psi ＝0.133 kPa）；氣簾氣壓力（CUR）40 psi；噴霧電壓（IS）4 000 eV；去簇電壓（DP）100 eV；碰撞電壓（CE）40 eV；碰撞電壓差15 eV；掃描范圍m／z50～2 000。參數(shù)設(shè)置、數(shù)據(jù)采集分析采用Agilent Masshunter Qualitative Analysis 軟件。

2.5 中性氧化鋁純化工藝考察

2.5.1 顆粒粒度篩選 稱取100～200、200～300 目中性氧化鋁各15 g，分別裝柱后從頂端加入“2.1”項下上樣液0.5 BV，4 BV 95%乙醇洗脫，收集流出液和洗脫液，測定丹參酮ⅡA、隱丹參酮含量，計算洗脫率，結(jié)果見表1。由此可知，顆粒粒度對隱丹參酮、丹參酮ⅡA洗脫率有較大影響，其中200～300 目孔容太小，而菲醌主要成分是丹參酮ⅡA之類的小分子物質(zhì)，導(dǎo)致洗脫效果不理想［16］，并且其粒徑過小，裝填緊密，洗脫時間較長；100～200 目下指標(biāo)成分損失率較低，洗脫效果更好，故選擇其進(jìn)行純化。

8）本項目收錄到中央電視臺《厲害了，我的國》欄目并多次進(jìn)行專題展播，進(jìn)一步提升了公司作為管廊領(lǐng)跑者的品牌形象。

表1 顆粒粒度對洗脫效果的影響

2.5.2 上樣質(zhì)量濃度篩選 稱取100～200 目中性氧化鋁15 g 裝柱4根，將“2.1”項下上樣液減壓濃縮至生藥量為0.1、0.2、0.4、0.8 g／mL，分別上樣0.5 BV，4 BV 95%乙醇洗脫，收集流出液和洗脫液，測定丹參酮ⅡA、隱丹參酮含量，計算洗脫率，結(jié)果見表2。由此可知，上樣0.2 g／mL時隱丹參酮、丹參酮ⅡA洗脫率較優(yōu)，故選擇其作為最佳上樣質(zhì)量濃度。

表2 上樣質(zhì)量濃度對洗脫效果的影響

2.5.3 泄漏曲線繪制 稱取100～200 目中性氧化鋁15 g 裝柱，將“2.1”項下上樣液減壓濃縮至生藥量為0.2 g／mL上樣，每1 BV 收集1 份流出液，測定丹酚酸B、迷迭香酸含量，計算洗脫量，繪制泄漏曲線，見圖2。由此可知，上樣10、12 BV 時丹酚酸B、迷迭香酸分別出現(xiàn)泄漏，故確定上樣體積為9 BV。

圖2 丹酚酸B、迷迭香酸泄漏曲線

2.5.4 洗脫溶劑種類篩選 稱取100～200 目中性氧化鋁15 g 共裝柱3根，將“2.1”項下上樣液減壓濃縮至生藥量為0.2 g／mL，上樣9 BV，95%、75%、50%乙醇各5 BV 進(jìn)行洗脫，收集流出液和洗脫液，測定丹參酮ⅡA、隱丹參酮含量，計算洗脫率，結(jié)果見表3。由此可知，洗脫溶劑種類對隱丹參酮、丹參酮ⅡA的洗脫量無明顯影響，但中性氧化鋁會和水發(fā)生氫鍵反應(yīng)，導(dǎo)致其吸附效果減弱，故選擇95%乙醇作為洗脫溶劑。

表3 洗脫溶劑種類對洗脫效果的影響（Ⅰ）

2.5.5 洗脫溶劑用量篩選 稱取100～200 目中性氧化鋁15 g 裝柱，將“2.1”項下上樣液減壓濃縮至生藥量為0.2 g／mL，上樣9 BV，95%乙醇洗脫，每0.5 BV 收集1 份洗脫液，測定隱丹參酮、丹參酮ⅡA含量，計算洗脫率，結(jié)果見圖3。由此可知，1.5 BV 時丹參酮ⅡA、隱丹參酮的含量不再變化，故選擇其作為洗脫溶劑用量。

圖3 隱丹參酮、丹參酮ⅡA 洗脫曲線（Ⅰ）

2.5.6 驗證試驗 稱取100～200 目中性氧化鋁3份，每份15 g，濕法裝柱，將上樣液減壓濃縮至生藥量為0.2 g／mL，上樣9 BV，待樣品全部流過柱子后用1.5 BV 95% 乙醇洗脫，收集流出液、洗脫液，測定隱丹參酮、丹參酮ⅡA、總菲醌含量及浸膏得率，計算洗脫率、純度、除雜率，結(jié)果見表4。由此可知，上樣后隱丹參酮、丹參酮ⅡA、總菲醌純度明顯提高，酚酸被完全除去。

表4 驗證試驗結(jié)果（Ⅰ， n＝3）

2.6 大孔樹脂純化工藝研究

圖4 4 種大孔樹脂吸附率

圖5 4 種大孔樹脂解吸率

2.6.2 上樣液含醇量考察 取預(yù)處理后HPD-100 大孔樹脂5 mL，濕法裝柱，精密吸取“2.1”項下上樣液5份，每份50 mL，加入純水至含醇量分別為20%、30%、40%、50%、60%，全部上樣后記錄流出液體積，測定隱丹參酮、丹參酮ⅡA含量，計算吸附率、保留率，結(jié)果見圖6～7。由此可知，50%時吸附率、保留率均較高，故選擇其作為上樣液含醇量。

圖6 不同含醇量上樣液吸附率

圖7 不同含醇量上樣液保留率

2.6.3 上樣量考察 取預(yù)處理好的HPD-100 大孔樹脂10 mL，濕法裝柱，將“2.1”項下上樣液加純水至含醇量為50%，以1.5 mL／min 體積流量通過樹脂，每10 mL 收集1 份流分，測定隱丹參酮、丹參酮ⅡA含量，繪制泄漏曲線，見圖8。由此可知，37 BV 時2 種成分出現(xiàn)明顯泄漏，故選擇其作為上樣量。

圖8 隱丹參酮、丹參酮ⅡA 洗脫曲線（Ⅱ）

2.6.4 洗脫溶劑種類考察 取預(yù)處理好的HPD-100 大孔樹脂適量，濕法裝柱，將“2.1”項下上樣液加純水至含醇量為50%，上樣36 BV，以1.5 mL／min 體積流量通過樹脂，吸附2 h，先用5 BV 水除雜，再分別用60%、70%、80%、90%乙醇以3 mL／min 洗脫至無顏色，記錄洗脫液體積，測定隱丹參酮、丹參酮ⅡA含量，計算洗脫率，結(jié)果見表5。由此可知，90%乙醇對2 種成分洗脫效果最好，故選擇其作為洗脫溶劑。

表5 洗脫溶劑種類對洗脫效果的影響（Ⅱ）

2.6.5 洗脫溶劑用量考察 取預(yù)處理好的HPD-100 大孔樹脂適量，濕法裝柱，將“2.1”項下上樣液加純水至含醇量為50%，上樣36 BV，以1.5 mL／min 體積流量通過樹脂，吸附2 h，先用5 BV 水除雜，再用90%乙醇以3 mL／min 體積流量洗脫，每10 mL 收集1 份洗脫液至無顏色，測定隱丹參酮、丹參酮ⅡA含量，計算洗脫率，繪制洗脫曲線，見圖9。由此可知，28 BV 時2 種成分洗脫率都小于0.1%，可認(rèn)為洗脫完全，故選擇27 BV 作為洗脫溶劑用量。

圖9 隱丹參酮、丹參酮ⅡA 洗脫曲線（Ⅲ）

2.6.6 驗證試驗 選擇HPD-100 大孔樹脂，上樣液含醇量為50%，上樣36 BV，待樣品全部通過樹脂后用90% 乙醇洗脫27 BV，收集洗脫液，記錄體積，測定隱丹參酮、丹參酮ⅡA、總菲醌含量及浸膏得率，計算純度、洗脫率、除雜率，平行3份，結(jié)果見表6。由此可知，隱丹參酮、丹參酮ⅡA洗脫率均達(dá)到80% 左右，除雜率在93% 以上，達(dá)到有效部位的純化要求。

表6 驗證試驗結(jié)果（Ⅱ， n＝3）

2.7 醇提水沉工藝考察 參考文獻(xiàn)［17］報道，取“2.1”項下上樣液100 mL，濃縮至生藥量為0.25 g／mL（密度0.85 g／mL），加3 倍量水，在4 ℃下冷藏靜置24 h，離心后收集沉淀，在55 ℃下烘干，95% 乙醇溶解并定容至50 mL量瓶中，測定隱丹參酮、丹參酮ⅡA、總菲醌含量及浸膏得率，計算純度，結(jié)果見表7。由此可知，總菲醌有效部位純度大于50%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

表7 驗證試驗結(jié)果（n＝3）

2.8 LC-MS 分析 表8 顯示，經(jīng)LC-MS 分析，中性氧化鋁中并未檢測到酚酸類物質(zhì)的特征離子碎片，故并未列出；大孔樹脂純化和醇提水沉法雖然可得到純度較高的菲醌有效部位，但同時也檢測到了上述雜質(zhì)。

表8 各成分LC-MS 分析結(jié)果

3 討論

大孔樹脂吸附分離、氧化鋁柱層析及醇提水沉法等都是中藥制劑中常用的純化方法，用于中藥有效部位的富集精制，去除糖、氨基酸等水溶性雜質(zhì)。近年來對丹參中菲醌有效部位的純化精制方法研究報道較少，更多是以結(jié)構(gòu)修飾來獲得單體成分。本實驗系統(tǒng)地研了幾種針對丹參中菲醌有效部位的純化方法，其中中性氧化鋁柱層析是首次應(yīng)用。最終優(yōu)選出的純化方法可以使最后總菲醌的純度達(dá)到70%左右，遠(yuǎn)高于其他文獻(xiàn)中的結(jié)果［18-20］。本實驗確定的純化工藝在企業(yè)生產(chǎn)實際中樹脂可以再生循環(huán)使用，乙醇也可以回收再利用，這大大地節(jié)省了生產(chǎn)成本，工藝流程簡單，時間花費少，符合工業(yè)大生產(chǎn)的要求。

丹參酚酸類成分不僅導(dǎo)致產(chǎn)品純度下降，而且也為后面的純化工藝帶來困難，如柱子堵塞滴速過慢等。中性氧化鋁柱層析可以直接吸附酚酸類成分而達(dá)到精制的目的［21］。但是最后的純化效果并不理想。本實驗在選擇大孔樹脂型號時發(fā)現(xiàn)HPD-100 和D101 對丹參中菲醌有效部位的指標(biāo)成分的吸附率和解吸附率相差不大，但考慮到HPD-100 的載樣量更大，洗脫時有效成分更容易被洗脫，所以最后選擇了HPD-100。醇提水沉法雖然有效部位純度達(dá)到50%，但是有效成分損失太大，不符合經(jīng)濟(jì)環(huán)保的要求。結(jié)合質(zhì)譜結(jié)果，三種方法各有優(yōu)缺點。中性氧化鋁柱層析可以把酚酸類等水溶性雜質(zhì)全部去除，而另外兩種雖然純度較高但是依舊含有份酸類雜質(zhì)。在今后的丹參菲醌有效部位制備中可以嘗試使用中性氧化鋁和大孔樹脂聯(lián)用的方法，既能全部去除酚酸類等水溶性雜質(zhì)，也可以獲得純度較高的有效部位。