不同產(chǎn)地苗圃銀杏葉的質(zhì)量表征與土壤因子關(guān)聯(lián)性

江美芳張艷欣王丹丹高崎

（上海上藥杏靈科技藥業(yè)股份有限公司，上海200120）

銀杏葉為銀杏科銀杏屬植物銀杏Ginkgo bilobaL.的干燥葉，是我國(guó)特有品種，主產(chǎn)區(qū)有江蘇、山東、四川等地，不同產(chǎn)區(qū)環(huán)境不同，銀杏葉化學(xué)成分存在差異，品質(zhì)不一。自20 世紀(jì)60 年代起，國(guó)內(nèi)外對(duì)銀杏的化學(xué)成分、藥理活性及臨床應(yīng)用進(jìn)行研究［1-7］。銀杏葉提取物由銀杏的干燥葉經(jīng)提取加工制成，具有抗氧化、抗疲勞、擴(kuò)張血管等作用［8-10］，對(duì)治療動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、腦功能障礙等具有顯著療效［10-11］。銀杏酮酯是銀杏葉中的主要藥效成分高度富集提取物［12］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)收集不同產(chǎn)地、采收期的苗圃銀杏葉，基于UPLC-QTOF-MS／MS 技術(shù)，建立同時(shí)測(cè)定銀杏葉中成分含量方法，全面表征不同產(chǎn)地銀杏葉品質(zhì)特征。

化學(xué)成分是藥用植物在長(zhǎng)期進(jìn)化中與環(huán)境相互作用的結(jié)果［13］；土壤是藥用植物賴(lài)以生存和發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，土壤因子是藥用植物生長(zhǎng)的主要環(huán)境因子［14］，土壤理化指標(biāo)含量會(huì)直接影響藥用植物化學(xué)成分的含量［15］。因此，開(kāi)展土壤因子與藥用植物有效成分含量關(guān)聯(lián)性研究，科學(xué)控制土壤條件，為合理規(guī)劃栽培優(yōu)質(zhì)藥用銀杏葉提供數(shù)據(jù)支撐，為高品質(zhì)銀杏葉制劑優(yōu)選原藥材提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料

1.1 藥材 收集32 個(gè)采樣點(diǎn)2019 年采收期（7 月）的銀杏葉，經(jīng)專(zhuān)家鑒定為銀杏科銀杏屬植物銀杏Ginkgo bilobaL.的干燥葉。其中，采樣點(diǎn)S1～S13 位于四川都江堰，S14～S20 位于山東平邑，S21～S32 位于上海崇明。于2019 年7月，采用五點(diǎn)法挖取四川都江堰、山東平邑、上海崇明銀杏葉采樣點(diǎn)S2、S8、S12、S13、S14、S16、S19、S21、S24、S27、S29 處40 cm 左右深的土壤，混合均勻，編號(hào)同銀杏葉。

1.2 試劑 銀杏內(nèi)酯A（批號(hào)W25A7K13730）、銀杏內(nèi)酯B（批號(hào)D15D8G50608）、銀杏內(nèi)酯C（批 號(hào) C28S6G3986 ）、白果內(nèi)酯（批 號(hào)P08J9F52398）、銀杏內(nèi)酯J（批號(hào)D29J9G53845）、蘆丁（批號(hào)Y16M9S61523）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（批 號(hào) Y15N8H48277 ）、碟豆素（批 號(hào)M13J10S90494）、槲皮素3-O-葡萄糖基（1-2）鼠李糖苷（批號(hào)M13J10S90493）、水仙苷（批號(hào)S08A8D33447）、3-O｛2-O-［6-O（β 羥基-反-香豆酰）-葡萄糖基］-鼠李糖基｝ 山柰酚（批號(hào)M13J10S90492）、3-O｛2-O-［6-O（β 羥基-反-香豆酰）-葡萄糖基］-鼠李糖基｝ 槲皮素（批號(hào)M13J10S90491）、銀杏雙黃酮（批 號(hào) GR-133-150405）、金松雙黃酮（批號(hào)P03M9F55041）、白果雙黃酮（批號(hào)Y15J9L63710）、銀杏酸C17∶1（批號(hào)Y18J10H73680）、銀杏酸C13∶ 0（批號(hào)P11D8F50448 ）、D-（-）奎寧酸（批 號(hào)A06N11L130218）對(duì)照品均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；穗花杉雙黃酮（批號(hào)10412）、銀杏酸C15∶1（批號(hào)1130）、原兒茶酸（批號(hào)5668）、莽草酸（批號(hào)863）對(duì)照品均購(gòu)于上海詩(shī)丹徳生物技術(shù)有限公司。甲醇、乙醇、甲酸為色譜純，均來(lái)自德國(guó)Fisher 公司；水為去離子水。

1.3 儀器 Xevo G2-XS Q-TOF 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters 公司）；BS124S 電子分析天平、SQPQUINTIX65-1CN 電子分析天平（十萬(wàn)分之一）（德國(guó)賽多利斯公司）；SF-TGL-16M 離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；KQ5200DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Direct-Q 3UV 型超純水機(jī)（美國(guó)Millipore 公司）；FE28 PH計(jì)（瑞士梅特勒-托利多公司）；Cary 3500 紫外分光光度計(jì)、240FS AA 原子吸收分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫公司）；PANalytical Axios PW4400 X 射線(xiàn)熒光光譜儀（荷蘭帕納科公司）。

2 方法

2.1 銀杏葉主要成分含量測(cè)定

2.1.1 分析條件 Waters ACQUITY UPLC C18色譜柱（50 mm × 2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相水（0.05%甲酸）（A）-甲醇（含0.05%甲酸）（B），梯度洗脫（0～1 min，98%A；1～13.5 min，98%～2% A；13.5～16.5 min，2% A；16.5～20 min，2%～98%A）；體積流量0.4 mL／min；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；進(jìn)樣量5 μL。在負(fù)離子條件下采用Sensitivity 模式；掃描時(shí)間20 min；毛細(xì)管電壓-2.5 kV；離子源溫度120 ℃；脫溶劑氣體積流量800 L／h，溫度450 ℃；錐孔電壓40 V。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)、對(duì)照品溶液的制備

2.1.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱(chēng)取內(nèi)標(biāo)（格列本脲）2.00 mg至2 mL 量瓶中，甲醇定容，制成1.00 mg／mL貯備液，在-20 ℃下冷凍保存。準(zhǔn)確移取500 μL至50 mL 量瓶中，分別用50% 甲醇、乙醇定容，制成10.00 μg／mL，即得，在-20 ℃下冷凍保存。

2.1.2.2 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、銀杏內(nèi)酯J、總內(nèi)酯、水仙苷、碟豆素、3-O｛2-O-［6-O（β 羥基-反-香豆酰）-葡萄糖基］-鼠李糖基｝ 山柰酚、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、蘆丁、槲皮素3-O-葡萄糖基（1-2）鼠李糖苷、3-O｛2-O-［6-O（β 羥基-反-香豆酰）-葡萄糖基］-鼠李糖基｝ 槲皮素、總黃酮醇苷、穗花杉雙黃酮、金松雙黃酮、白果雙黃酮、銀杏雙黃酮、總雙黃酮、D-（-）奎寧酸、莽草酸、原兒茶酸、總有機(jī)酸、銀杏酸C13∶0、銀杏酸C15∶1、銀杏酸C17∶1、總烷基酚對(duì)照品，50%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為9.89、14.46、9.28、4.71、21.19、8.91、5.89、6.21、5.91、6.85、15.90、16.34、9.84、4.07、8.04、9.51、179.68、90.97、16.11、41.10、2.02、97.50 μg／mL 的貯備液，稀釋成不同質(zhì)量濃度，加入10.00 μg／mL 內(nèi)標(biāo)溶液500 μL，定容至10 mL 量瓶中，即得。

2.1.3 供試品溶液制備

2.1.3.1 雙黃酮類(lèi)、烷基酚類(lèi)成分（前處理1）取藥材適量，粉碎后過(guò)4 號(hào)篩，精密稱(chēng)取粉末0.1 g，5 mL 乙醇超聲提取10 min，3 000 r／min 離心10 min，吸取上清液，重復(fù)3次，合并上清液，加入10 μg／mL 內(nèi)標(biāo)溶液500 μL，定容至25 mL 量瓶中，即得，離心后進(jìn)樣分析。

2.1.3.2 萜內(nèi)酯類(lèi)、黃酮醇苷類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)成分（前處理2）取藥材適量，粉碎后過(guò)4 號(hào)篩，精密稱(chēng)取粉末0.1 g，5 mL50%甲醇超聲提取10 min，3 000 r／min 下離心10 min，吸取上清液，重復(fù)3次，合并上清液，加入10 μg／mL 內(nèi)標(biāo)溶液500 μL，定容至25 mL 量瓶中，即得，離心后進(jìn)樣分析。

2.1.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取干燥至恒重的對(duì)照品適量，50%甲醇溶解并逐級(jí)稀釋?zhuān)玫讲煌|(zhì)量濃度，在“2.1.1”項(xiàng)條件下各進(jìn)樣測(cè)定2 次。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

表1 各成分線(xiàn)性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液適量，在“2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得各成分色譜峰出峰時(shí)間、峰面積RSD 均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液適量，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定各成分色譜峰出峰時(shí)間、峰面積RSD均小于3%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品溶液適量，在“2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得各成分色譜峰出峰時(shí)間、峰面積RSD 均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取各成分含量已知的藥材粉末0.05 g，共6份，分別按50%、100%、150% 水平加入對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每個(gè)水平平行2份，在“2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，各成分平均加樣回收率均在90.29%～105.41% 范圍內(nèi)，RSD 均小于3%。

2.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定 參考《NY／T1377-2007土壤pH 的測(cè)定》，采用電位法測(cè)定土壤pH。參考《HJ613-2011 土壤 干物質(zhì)和水分的測(cè)定重量法》，采用重量法測(cè)定土壤水分。參考《NY／T 1121.6-2006 土壤檢測(cè)第6 部分：有機(jī)質(zhì)的測(cè)定》，采用重鉻酸鉀容量法測(cè)定土壤水分。參考《LY／T 1288-2015 森林土壤氮的測(cè)定》，采用酚二磺酸比色法測(cè)定土壤水分。參考《NY／T 1121.7-2014 土壤檢測(cè)第7 部分：土壤有效磷的測(cè)定》，采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定土壤水分。參考《NY／T 889-2004 土壤速效鉀和緩效鉀含量的測(cè)定》，采用以中性乙酸銨溶液浸提、火焰光度計(jì)測(cè)定。

2.3 數(shù)據(jù)分析 采用SIMCA14.1 軟件進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），DPS 9.01 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析，Canoco5 軟件進(jìn)行冗余分析。

3 結(jié)果

3.1 含量測(cè)定 總離子流圖見(jiàn)圖1，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 銀杏葉總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of G.biloba leaves

表2 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／g， n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg／g， n＝3）

3.2 差異性成分篩選 OPLS-DA 分析顯示，R2X＝0.76，R2Y＝0.953，Q2＝0.891，表明模型可靠，載荷圖見(jiàn)圖2，可知3 個(gè)基地藥材成分具有顯著差異，分布在3 個(gè)象限間。為了確定影響分組的差異標(biāo)志物，采用變量重要性投影（VIP）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)銀杏酸C17∶1、莽草酸、原兒茶酸、銀杏內(nèi)酯B、金松雙黃酮、銀杏酸C13∶0、銀杏內(nèi)酯A、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、白果內(nèi)酯VIP 值均大于1，表明對(duì)分類(lèi)結(jié)果影響較大，可作為為不同種植基地的品質(zhì)標(biāo)志物。

圖2 不同產(chǎn)地樣品OPLS-DA圖Fig.2 OPLS-DA diagram of samples from different producing areas

3.3 土壤因子對(duì)主要成分含量的影響 選取與土壤采集點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的11 個(gè)銀杏葉采樣點(diǎn)，匯總各成分含量，將其與土壤因子進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由此可知，3 個(gè)產(chǎn)地土壤性質(zhì)具有顯著差異，其中山東平邑、四川都江堰土壤養(yǎng)分高，而上海崇明較缺乏，可能與四川都江堰基地氮肥施較多，山東平邑、上海崇明磷肥、鉀肥施加較多有關(guān)。

表3 不同種植基地采收期土壤理化性質(zhì)（）Tab.3 Soil physicochemical properties at harvest time in different planting bases（）

表3 不同種植基地采收期土壤理化性質(zhì)（）Tab.3 Soil physicochemical properties at harvest time in different planting bases（）

注：同一行不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。

3.3.1 灰色關(guān)聯(lián)度分析 表4 顯示，各成分含量與土壤因子的灰色關(guān)聯(lián)值在0.5～0.8 之間，表明兩者關(guān)系密切，成分積累主要受pH、有機(jī)質(zhì)、有效磷、硝態(tài)氮的影響，程度分別為萜內(nèi)酯類(lèi)，有機(jī)質(zhì)＞pH＞硝態(tài)氮＞有效磷；黃酮醇苷類(lèi)，pH ＞有機(jī)質(zhì)＞硝態(tài)氮＞有效磷；有機(jī)酸類(lèi)，速效鉀＞有效磷＞pH＞有機(jī)質(zhì)；烷基酚類(lèi)，水分＞氨態(tài)氮＞pH＞硝態(tài)氮；雙黃酮類(lèi)，pH＞水分＞有機(jī)質(zhì)＞速效鉀。

表4 各成分含量與土壤因子灰色關(guān)聯(lián)值Tab.4 Grey correlation values between various constituent contents and soil factors

3.3.2 冗余分析 為了清晰直觀(guān)地展示土壤因子與各成分含量的相互關(guān)系，對(duì)兩者進(jìn)行RDA［16-18］分析排序制圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。從各土壤因子向量的長(zhǎng)度來(lái)看，有效磷、pH、有機(jī)質(zhì)、水分箭頭連線(xiàn)最長(zhǎng)，可知四者對(duì)各成分含量變異起到較好的解釋作用，即為關(guān)鍵因子，與灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果基本一致，其中有機(jī)質(zhì)比較靠近第一排序軸的負(fù)軸方向，表明與第一排序軸的負(fù)軸方向相關(guān)性更大；pH 較靠近第一排序軸的正軸方向，表明與第一排序軸的正軸方向相關(guān)性更大；水分、硝態(tài)氮、速效鉀比較接近第二排序軸，表明與第二排序軸相關(guān)性更大，而第一排序軸與土壤因子、各成分含量的相關(guān)性遠(yuǎn)大于第二排序軸。

圖3 各成分含量與土壤因子關(guān)系的冗余分析圖Fig.3 Redundancy analysis diagram of relationships between various constituent contents and soil factors

采用t-value 雙序圖對(duì)各成分含量有顯著影響的土壤因子進(jìn)行逐一分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。由此可知，萜內(nèi)酯類(lèi)成分主要與土壤中水分、pH 有較大相關(guān)性，與土壤水分、pH 均呈負(fù)相關(guān)；雙黃酮類(lèi)成分主要與土壤中有機(jī)質(zhì)、水分有較大相關(guān)性，與土壤有機(jī)質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，與土壤水分呈正相關(guān)；烷基酚類(lèi)成分主要與土壤中有效磷、有機(jī)質(zhì)有較大相關(guān)性，與土壤有效磷、有機(jī)質(zhì)均呈負(fù)相關(guān)；總黃酮醇苷類(lèi)成分主要與土壤中水分、pH 有較大相關(guān)性，與土壤水分和pH 均呈正相關(guān)；有機(jī)酸類(lèi)成分主要與土壤中水分、pH 有較大相關(guān)性，與土壤水分、pH 均呈正相關(guān)。

圖4 土壤因子和成分含量關(guān)系的t-value 雙序圖Fig.4 t-value double sequence diagrams for relationships between soil factors and various constituent contents

4 討論

不同產(chǎn)地銀杏葉具有不同質(zhì)量特征。對(duì)四川都江堰、山東平邑、上海崇明3 個(gè)產(chǎn)地采收期銀杏葉含量進(jìn)行方差多重比較，山東平邑和四川都江堰總內(nèi)酯含量顯著高于上海崇明；黃酮醇苷類(lèi)化合物，3 個(gè)基地不具有顯著性差異；雙黃酮類(lèi)化合物，上海崇明和四川都江堰顯著高于山東平邑；有機(jī)酸類(lèi)化合物，山東平邑顯著高于其他兩個(gè)，烷基酚類(lèi)化合物，山東平邑總烷基酚含量顯著低于其他兩個(gè)產(chǎn)地。臨床上，銀杏內(nèi)酯常被制備成注射劑，用于瘀血阻絡(luò)所致的缺血性腦卒中［19］，銀杏內(nèi)酯注射劑可主要選用山東平邑和四川都江堰的銀杏苗圃葉，以獲得更高得率、更高品質(zhì)的產(chǎn)品。有機(jī)酸類(lèi)成分，具有抗氧化、抗病毒和抗菌等藥理活性［20］，廣泛應(yīng)用于藥物的合成，如抗流感藥物磷酸奧司他韋等［21］，在有機(jī)酸類(lèi)藥物制劑，可選用山東平邑銀杏苗圃葉，以獲得高產(chǎn)、高價(jià)值的產(chǎn)品。臨床上銀杏葉更多的是用于銀杏葉提取物制劑，用于治療心、腦血管疾病，其中主要藥效成分是黃酮和內(nèi)酯，生產(chǎn)過(guò)程中，應(yīng)考慮不同產(chǎn)地銀杏葉質(zhì)量差異，使生產(chǎn)過(guò)程投料均一化，保證藥品批次間質(zhì)量穩(wěn)定性，保證用藥有效和安全。

銀杏葉品質(zhì)主要受土壤中有效磷、pH、有機(jī)質(zhì)、水分這四個(gè)環(huán)境因子影響。山東平邑的萜內(nèi)酯類(lèi)成分含量相對(duì)最高，這與東平邑土壤有機(jī)質(zhì)含量高、土壤水分含量低相關(guān)，萜內(nèi)酯類(lèi)成分含量與土壤有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)性，與pH 和水分呈負(fù)相關(guān)性，上海崇明等地可通過(guò)適當(dāng)?shù)脑鍪┯袡C(jī)糞肥提高土壤有機(jī)質(zhì)，通過(guò)控制灌溉量、挖溝排水等控制土壤水分。

綜上所述，本研究為不同臨床療效銀杏葉制劑原藥材選取提供參考，為科學(xué)合理規(guī)劃范種植銀杏葉提供了依據(jù)，同時(shí)也表明銀杏葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能僅參考黃酮類(lèi)和萜內(nèi)酯類(lèi)，不同產(chǎn)地銀杏葉品質(zhì)不一，應(yīng)多組分多表征，才能全面控制銀杏葉質(zhì)量。