鹿角與鹿茸蛋白質(zhì)鑒定

楊歡Roselyn Tehzee Gblinwon楊婭婭王強陳香盧夢瑤鄭晗雪吳沅臻夏國華*沈玉萍

（1.江蘇大學藥學院，江蘇 鎮(zhèn)江212013； 2.鎮(zhèn)江市食品藥品監(jiān)督檢驗中心，江蘇 鎮(zhèn)江212050）

鹿角Cervi Cornu為鹿科動物馬鹿或梅花鹿已骨化的角或鋸茸后翌年春季脫落的角基，鹿茸Cervi Cornu Pantotrichum為鹿科動物梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，是我國特有的貴細動物藥，具有壯腎陽、益精血、強筋骨等功效［1］，兩者經(jīng)炮制為飲片后入藥，包括鹿角片、鹿角粉、鹿茸片、鹿茸粉。鹿角質(zhì)量控制依據(jù)浸出物含量，而鹿茸質(zhì)量控制主要采用顯色反應和薄層色譜法，均缺乏特異性，給鹿角與鹿茸的真?zhèn)舞b別帶來困難［2-5］。

動物藥中蛋白質(zhì)含量較高且種類豐富，同一基原動物的不同藥用部位中標志蛋白質(zhì)的種類有別，特異性較高。SDS-PAGE 和2-DE 是分析蛋白質(zhì)的兩種重要方法，在中藥質(zhì)量評價等研究領(lǐng)域中已被廣泛應用［6-10］。邱乙等［11］基于差異蛋白質(zhì)建立了SDS-PAGE 鑒別僵蠶及其常見偽品的技術(shù)，并利用2-DE 尋找到冬蟲夏草特有的26 種指標性蛋白質(zhì)；Baskova等［12］用2-DE 區(qū)分3 種水蛭唾液腺分泌物的蛋白質(zhì)和多肽組成。此外，將蛋白質(zhì)酶解所得多肽混合物進行軟電離，結(jié)合生物信息學分析可進行蛋白質(zhì)的鑒定［13］。Lin等［14］結(jié)合SDS-PAGE、2-DE、MALDI-TOF／TOF-MS 分析，從僵蠶中鑒別出32 種蛋白質(zhì)。

因此，本實驗采用SDS-PAGE 和2-DE 分析鹿角與鹿茸的蛋白質(zhì)組成及其差異，將蛋白質(zhì)條帶進行胰蛋白酶膠內(nèi)消化，通過MALDI-TOF／TOF-MS分析獲取多肽的質(zhì)譜圖，通過MASCOT 檢索鑒定蛋白質(zhì)，為鹿角與鹿茸的鑒別提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 AE240 電子分析天平（0.01 mg，瑞士Mettler-Toledo 公司）；T-MS 型恒溫混勻儀（寧波拓普森科學儀器有限公司）；1-13 型臺式高速離心機（美國Sigma 公司）；TGL-16M 型高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗儀器有限公司）；XHF-DY 型高速分散器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；T100 型PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；SpectraMax Gemini EM 型酶標儀（美國Molecular Devices 公司）；Ettan IPGphor 3 型等電聚焦儀（美國GE Healthcare 公司）；Autoflex 型MALDI-TOF／TOF-MS（美國Bruker Daltonics 公司）；臺式快速離心濃縮干燥器（美國Labconco 公司）；Alpha 1-2 LD plus型凍干機（德國Christ 公司）。

1.2 試劑 Biosharp 透析袋（蘭杰柯科技有限公司）；蛋白分子量標準（14.4～116 kD）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。雙叉丙烯酰胺、丙烯酰胺、考馬斯亮藍R-250、碳酸氫銨（上海生工生物工程股份有限公司）；Destreak Rehydration Reagent（美 國 GE Healthcare 公司）；IPG Strips、Bio-Lyte 3-10 Buffer（美國Bio-Rad 公司）；二硫蘇糖醇、碘代乙酰胺（分析純，美國Sigma-Aldrich 公司）；乙腈、三氟乙酸（色譜純，美國Omni 公司）；modified trypsin（美國Promega 公司）；α-cyano-4-hydroxycinnamic acid（美國Sigma-Aldrich 公司）；甲醇、乙醇、異丙醇、乙酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；水為超純水（Smartplus-P 水純化系統(tǒng)，上?？道追治鰞x器有限公司）。

1.3 藥材 鹿角片、鹿茸片各9批，均由亳州市佰世信中藥飲片有限公司提供，產(chǎn)地吉林，分別來源于鹿科動物馬鹿Cervi elaphus已骨化的角或角基、馬鹿Cervi elaphus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，經(jīng)鎮(zhèn)江市中醫(yī)院藥劑科孫小祥主任中藥師鑒定為正品，具體見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法

2.1 SDS-PAGE 分析

2.1.1 供試品溶液制備 精密稱取鹿角粉末（40目以下）100 mg，置于50 mL 離心管中，加入蛋白質(zhì)裂解液2.0 mL，室溫、8 000 r／min 高速勻漿10 min，勻漿液12 000 r／min 離心5 min，吸出上清液，即得鹿角蛋白質(zhì)供試品溶液；另精密稱取100 mg 鹿茸粉末（40 目以下），置于2.0 mL 離心管中，加入蛋白質(zhì)裂解液0.4 mL，混勻后超聲提取30 mins，混懸液12 000 r／min 離心5 min，吸出上清液，即得鹿茸蛋白質(zhì)供試品溶液，在4 ℃下保存。

2.1.2 分析條件 制備SDS-PAGE 凝膠（5%集成膠，12%分離膠），分別吸取“2.1.1”項下供試品溶液各15 μL、蛋白質(zhì)混合對照品溶液5 μL，載入凝膠泳道。濃縮膠電壓設定為80 V，當溴酚藍指示劑到達分離膠時，上調(diào)電壓至110 V 繼續(xù)電泳約50 min，取出凝膠，采用考馬斯亮藍染色法進行染色。

2.2 2-DE 分析

2.2.1 供試品溶液制備 分別精密稱取鹿角、鹿茸粉末各2.00 g，加入5.0 mL 蛋白質(zhì)裂解液，按“2.1.1”項下方法提取2次，合并上清液，超純水透析，內(nèi)容物凍干后在-70 ℃下低溫冷凍保存。臨用前，加入200 μL 水化液復溶，并使用BCA 試劑盒進行蛋白濃度測定。

2.2.2 蛋白質(zhì)水化與等電聚焦 將供試品溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度調(diào)整為3.5 mg／mL，分別吸取350 μL，再加入1.75 μL IPG 緩沖液（pH3～10），混勻，高速離心15 min，移取上清液至陶瓷槽中，使IPG 膠條充分接觸蛋白溶液，再加入3 mL 礦物油覆蓋在膠條上，逐步升高電壓至8 kV 進行等電聚焦。

2.2.3 IPG 膠條平衡與SDS-PAGE 電泳 IEF 結(jié)束后取出IPG 膠條，超純水洗凈，將膠條放入5 mL平衡液（含0.05 g DTT、0.625 g 碘代乙酰胺）中，振搖15 min 平衡，重復2次，取出膠條，置于12%凝膠上，依次采用5、15 W 進行電泳分離，取出凝膠，采用考馬斯亮藍染色法進行染色。

2.3 蛋白質(zhì)鑒定 切取鹿角與鹿茸目的蛋白質(zhì)條帶，置于離心管中切成小塊，加入超純水洗滌2次，加入50%乙腈-0.1%TFA 200 μL 洗滌2次，再加入100 μL 乙腈洗滌，離心濃縮儀除去殘留溶劑，加入10.0 mmol／L DTT-25.0 mmol／L NH4HCO3溶液60 μL，在37 ℃下孵育1 h，冷卻至室溫，棄去溶液，再加入 55.0 mmol／L IAM-25.0 mmol／L NH4HCO360 μL，渦旋混勻，室溫避光放置45 min，棄去溶液，25.0 mmol／L NH4HCO3、50%乙腈、乙腈各100 μL 依次洗滌，揮干溶劑，膠條中加入10 ng／μL 胰蛋白酶溶液15 μL，室溫放置30 min，再加入 50.0 mmol／L NH4HCO3-乙 腈20 μL，混勻后在37 ℃下孵育過夜，自然冷卻至室溫后加入超純水200 μL，混勻，離心1 min，吸出上清液，膠條碎片中再加入50% 乙腈-5% TFA 50 μL提取30 min，離心1 min，吸出上清液，再提取2次，合并上清液，離心濃縮儀除去溶劑，在上述多肽片段混合物中加入80% 乙腈-0.1% TFA 20 μL復溶，吸取0.5 μL 供試品溶液點樣 于MALDI 分析板，并加入α-CHCA 基質(zhì)溶液0.5 μL迅速混勻，室溫干燥后采用MALDI-TOF／TOF-MS分析。陽離子模式，線性；掃描次數(shù)500；激光頻率1 000 Hz；離子源1 電壓25.01 kV；離子源2 電壓22.51 kV；透鏡電壓7.29 kV；脈沖離子提取時間150 ns；基質(zhì)抑制偏離；抑制值600 Da；質(zhì)量范圍1 000～5 000 Da，所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用MASCOT進行分析。

3 結(jié)果

3.1 SDS-PAGE 圖1～2 顯示，鹿角與鹿茸在14.4～116 kD 之間均呈現(xiàn)數(shù)個清晰的蛋白質(zhì)條帶，兩者SDS-PAGE 圖譜存在較明顯差異，并且鹿茸蛋白質(zhì)條帶數(shù)量多于鹿角；鹿角中蛋白質(zhì)條帶較少，9 批樣品中穩(wěn)定出現(xiàn)2 個清晰的蛋白質(zhì)條帶，分別位于約75 kD（條帶a）、66.2 kD（條帶b）；9 批鹿茸片均出現(xiàn)4 個蛋白質(zhì)條帶，分別位于約75 kD（條帶1）、61 kD（條帶2）、45 kD（條帶3）；20 kD（條帶4）；兩者穩(wěn)定存在差異性蛋白質(zhì)條帶為條帶b、條帶2、條帶3 和條帶4）。

圖1 鹿角的典型SDS-PAGE 蛋白質(zhì)譜Fig.1 Typical SDS-PAGE protein profile of Cervi Cornu

圖2 鹿茸的典型SDS-PAGE 蛋白質(zhì)圖譜Fig.2 Typical SDS-PAGE protein profile of Cervi Cornu Pantotrichum

3.2 2-DE 圖3～4 顯示，鹿角蛋白質(zhì)斑點大多在Ⅰ區(qū)（pH5～7，Mw45 kD）、Ⅱ區(qū)（pH10，Mw66.2 kD），而在45～70 kD 之間少有分布；鹿茸蛋白質(zhì)斑點則密集分布于Ⅲ區(qū)（pH5～7，Mw45 kD），并在pH5～6、Mw20 kD 的區(qū)域內(nèi)存在3 個穩(wěn)定出現(xiàn)的蛋白質(zhì)斑點1～3。綜上所述，鹿角與鹿茸的2-DE 蛋白質(zhì)圖譜存在較大差異，其蛋白質(zhì)斑點分布具有明顯特征。

圖3 鹿角的典型2-DE 蛋白質(zhì)圖譜Fig.3 Typical 2-DE protein profile of Cervi Cornu

圖4 鹿茸的典型2-DE 蛋白質(zhì)圖譜Fig.4 Typical 2-DE protein profile of Cervi Cornu Pantotrichum

3.3 蛋白質(zhì)生物質(zhì)譜鑒定 鹿角與鹿茸蛋白質(zhì)SDS-PAGE 條帶見圖5，可知分別劃分為2 個（CC-I、CC-Ⅱ）和4 個（CP-I、CP-Ⅱ、CP-Ⅲ、CP-Ⅳ）區(qū)域。

圖5 鹿角與鹿茸SDS-PAGE 切割條帶Fig.5 Protein bands cut from SDS-PAGE of Cervi Cornu and Cervi Cornu Pantotrichum

圖6 顯示，鹿角與鹿茸蛋白質(zhì)條帶經(jīng)胰蛋白酶膠內(nèi)消化后所得肽段的m／z主要分布于1 000～3 000，MASCOT 檢索結(jié)果見表2，可知分別從兩者中鑒定出2、4 個蛋白質(zhì)。其中，從鹿茸蛋白質(zhì)條帶CP-Ⅱ、CP-Ⅲ中分別鑒定出源于馬鹿的白蛋白（ALB）、馬鹿假定蛋白hypothetical protein Celaphus_00009169，partial，并且評分高于100，可信度較高。

表2 鹿角與鹿茸蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果Tab.2 Results for protein identification of Cervi Cornu and Cervi Cornu Pantotrichum

圖6 鹿角與鹿茸中蛋白質(zhì)的多肽MALDI-TOF-MS 質(zhì)譜圖Fig.6 MALDI-TOF-MS spectra of peptide fragments from Cervi Cornu and Cervi Cornu Pantotrichum proteins

4 討論

動物藥應用歷史悠久，一直受到醫(yī)藥學家和政府部門的重視，是中藥體系的重要組成部分。大多數(shù)動物藥的鑒定技術(shù)為性狀鑒定和顯微鑒定，這兩種方法要求供試品或為完整的藥材、飲片，或具有特定的微觀或宏觀的可視特征，因此難以作為識別角類中藥以及同屬近似種等的專屬性鑒定手段。本研究以鹿角與鹿茸的蛋白質(zhì)為研究對象，分別進行SDS-PAGE 和2-DE 電泳分析。結(jié)果表明鹿角與鹿茸蛋白質(zhì)的電泳圖譜中均存在穩(wěn)定的蛋白質(zhì)條帶或斑點且具有一定差異，這些差異性蛋白質(zhì)條帶和蛋白質(zhì)斑點為鹿角與鹿茸的鑒別提供了依據(jù)。

近年來利用現(xiàn)代分析技術(shù)鑒定動物藥的研究不斷增加，但主要是檢測小分子［15-16］；動物藥中小分子物質(zhì)的種類遠少于植物藥，且特異性差，因此導致多味動物藥以同一小分子化合物為指標性成分缺乏專屬性。此外，由于特異性高，DNA 分子鑒定發(fā)展迅速，是黃璐琦院士提出并發(fā)展的“分子生藥學”的重要組成部分［17］。鹿角與鹿茸為不同采收時間所得到的鹿的角組織，兩者的DNA 分子具有物種內(nèi)和個體內(nèi)同一性，且基因序列相對保守，不易隨時間周期或環(huán)境變化而發(fā)生改變，因而難以根據(jù)鹿角與鹿茸的基因差異設計特異性引物以擴增目標片段，或以DNA 條形碼技術(shù)區(qū)分鹿角與鹿茸。但因鹿角與鹿茸采收時間的差異，蛋白質(zhì)種類及含量均會發(fā)生改變，即同一物種不同組織中分別具有特異性高的標志蛋白質(zhì)［18］，并且其會穩(wěn)定表達。因此，相比于位點特異性PCR 技術(shù)等DNA分子鑒定方法，以標志蛋白質(zhì)作為鹿角與鹿茸特征識別物的電泳分析方法則具有其獨特之處。

通過對鹿角與鹿茸的蛋白質(zhì)條帶進行胰蛋白酶膠內(nèi)消化，利用MALDI-TOF／TOF-MS 測定多肽片段并結(jié)合MASCOT 搜索匹配，鑒定多種可信度較高的蛋白質(zhì)。該方法為角類中藥的專屬性鑒別研究提供了一條新的途徑。然而，由于 NCBI、SWISSPROT 等數(shù)據(jù)庫中鹿的蛋白質(zhì)條目較少，因此匹配出的蛋白質(zhì)數(shù)量不多。在進一步的研究中，可將含量較高的特異性蛋白質(zhì)以柱層析法進行分離，然后通過液質(zhì)聯(lián)用并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學和生物信息學研究手段［19-20］，解析標志蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。