lncRNA XIST通過(guò)靶向miR-3666調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制①

范 淵 吳海龍 竹 夢(mèng) 周 銳（武漢市第四醫(yī)院普外科，武漢 430030）

胃癌是全球高發(fā)惡性腫瘤，晚期胃癌主要以全身化療為主，雖能延長(zhǎng)腫瘤患者的生存期，但副作用較明顯；近年來(lái)，隨著對(duì)胃癌進(jìn)展相關(guān)分子機(jī)制研究的深入，相應(yīng)的靶向藥物應(yīng)運(yùn)而生，用于臨床治療，但由于基因的不穩(wěn)定性導(dǎo)致許多靶向藥物療效受限，亟需研究新的靶向藥物［1-2］。研究表明lncRNA 參與了胃癌的進(jìn)展過(guò)程，lncRNA XIST 在胃癌組織及胃癌患者血漿中表達(dá)升高，可能是胃癌的一個(gè)潛在的腫瘤標(biāo)志物［3］。lncRNA XIST 高表達(dá)與胃癌患者的腫瘤體積，淋巴結(jié)浸潤(rùn)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM 分期顯著相關(guān)；而敲低lncRNA XIST 可通過(guò)miR-101/Zeste 同源增強(qiáng)子2（enhancer of zeste homo?log 2，EZH2）軸抑制體外細(xì)胞增殖、遷移和侵襲以及體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［4］。lncRNA XIST 在胃癌MGC803 和BGC823 細(xì)胞中高表達(dá)，沉默lncRNA XIST 可通過(guò)靶向miR-185 抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［5］。且lncRNA XIST 高表達(dá)與胃癌細(xì)胞的耐藥性相關(guān)［6］。miR-3666 在胃癌組織中低表達(dá)，并且與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示胃癌患者預(yù)后不良［7］。然而miR-3666 對(duì)胃癌增殖、遷移和侵襲的影響及l(fā)ncRNA XIST是否通過(guò)調(diào)控miR-3666影響胃癌的進(jìn)展尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究lncRNA XIST是否通過(guò)調(diào)控miR-3666 影響胃癌的增殖、遷移和侵襲。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 癌組織和癌旁組織來(lái)源 選取武漢市第四醫(yī)院2017年6月至2019年12月期間收治的30例胃癌患者，通過(guò)手術(shù)取其癌組織及癌旁組織，然后立即置于液氮中凍存，后存于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫谢颊呔?jīng)病理檢測(cè)確診為胃癌，且具有完整臨床病理資料，所有患者均知情且同意，本研究經(jīng)武漢市第四醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 細(xì)胞與主要試劑 正常胃黏膜上皮細(xì)胞MRG-1、胃癌細(xì)胞SGC-7901、胃腺癌細(xì)胞AGS 購(gòu)自美國(guó)ATCC；RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自深圳市豪地華拓生物科技有限公司；Trizol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；熒光定量試劑盒購(gòu)自上海研卉生物科技有限公司；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠（Annexin V-FITC/PI）凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司；Transwell 小室、Matrigel購(gòu)自美國(guó)BD 公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司。XIST 過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)載體質(zhì)粒、miR-3666 模擬物、miR-3666 抑制劑及陰性對(duì)照購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞處理與分組 正常胃黏膜上皮細(xì)胞MRG-1、胃癌細(xì)胞SGC-7901、胃腺癌細(xì)胞AGS 用RPMI1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞AGS，將si-NC、si-XIST、pcDNA-NC、pcDNA-XIST、miR-NC、miR-3666 轉(zhuǎn)染至AGS 細(xì)胞，記為si-NC 組、si-XIST 組、pcDNA-NC 組、pcDNA-XIST 組、miR-NC組、miR-3666組；將si-XIST分別與anti-miR-NC、antimiR-3666 共轉(zhuǎn)染至AGS 細(xì)胞，記為si-XIST+antimiR-NC組、si-XIST+anti-miR-3666組。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)lncRNA XIST 和miR-3666 表達(dá)水平 各取10 g 癌組織及癌旁組織，剪碎后加液氮研磨，然后加入Trizol 裂解液提取總RNA；各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后離心收集細(xì)胞，再加入用Trizol 試劑提取總RNA；然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR，循環(huán)條件為95 ℃5 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s；72 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)；相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。XIST 和miR-3666分別以GAPDH 和U6 為內(nèi)參，XIST 正向引物序列：5'-AGGGTGTGTGTGCATATGGA-3'，反向引物序列：5'-CCGCCATCTTTTCCTGTACG-3'；GAPDH 正向引物序列：5'-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3'，反向引物序列：5'-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3'；miR-3666 正向引物序列：5'-ACGAGACGACGA?CAGAC-3'，反向引物序列：5'-CAGTGCAAGTGTAG?ATGCCGA-3'；U6 正向引物序列：5'-AACGAGAC?GACGACAGAC-3'，反向引物序列：5'-GCAAATTC?GTGAAGCGTTCCATA-3'。

1.2.3 MTT 檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 在各組細(xì)胞分別培養(yǎng)至0 h、24 h、48 h、72 h 時(shí)，每孔加入20 μl 的MTT 溶液，孵育4 h 后加入150 μl DMSO，振蕩反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度（OD）值。

1.2.4 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 細(xì)胞遷移：將細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基以5×105個(gè)/ml 的密度懸浮，取100 μl 懸浮液加入小室上室，600 μl 含10%FBS 的培養(yǎng)液添加到小室下室，溫育48 h，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，PBS 輕輕清洗2 次；用倒置顯微鏡拍攝染色細(xì)胞的照片并計(jì)數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：用Matrigel 包被Transwell 小室的上室，其余與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)操作相同。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，用預(yù)冷的PBS 漂洗，按試劑盒說(shuō)明操作，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)lncRNA XIST 和miR-3666的靶向關(guān)系 構(gòu)建lncRNA XIST野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體WT-XIST 和MUT-XIST，將其分別與miR-NC 和miR-3666共轉(zhuǎn)染至胃腺癌細(xì)胞AGS中；按照說(shuō)明書檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示，兩組比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA XIST 和miR-3666 在胃癌組織中的表達(dá) 用RT-qPCR 檢測(cè)lncRNA XIST 和miR-3666 表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，胃癌組織中XIST 表達(dá)水平升高，miR-3666 表達(dá)水平降低（P<0.05），見圖1。

圖1 lncRNA XIST和miR-3666在胃癌組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of lncRNA XIST and miR-3666 in gastric cancer tissues

2.2 lncRNA XIST 和miR-3666 在不同細(xì)胞株中的表達(dá) 培養(yǎng)正常胃黏膜上皮細(xì)胞MRG-1、胃癌細(xì)胞SGC-7901及胃腺癌細(xì)胞AGS，RT-qPCR檢測(cè)lncRNA XIST 和miR-3666 表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與MRG-1 細(xì)胞相比，AGS、SGC-7901細(xì)胞中XIST表達(dá)水平升高，miR-3666表達(dá)水平降低（P<0.05），見圖2。

圖2 lncRNA XIST和miR-3666在不同細(xì)胞株中的表達(dá)Fig.2 Expression of lncRNA XIST and miR-3666 in different cell lines

2.3 lncRNA XIST 的敲除對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響 將si-NC、si-XIST 轉(zhuǎn)染至胃癌AGS細(xì)胞后，RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，si-XIST 組XIST 表達(dá)水平低于si-NC組；MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，si-XIST組細(xì)胞增殖能力低于si-NC組；Transwell 檢測(cè)結(jié)果顯示，si-XIST 組細(xì)胞遷移和侵襲能力低于si-NC 組，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，si-XIST 組細(xì)胞凋亡率高于si-XIST 組（P<0.05），見圖3。

圖3 lncRNA XIST的敲除對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響Fig.3 Effects of lncRNA XIST knockout on prolifera?tion，migration，invasion and apoptosis of gastric cancer AGS cells

2.4 lncRNA XIST 靶向調(diào)控miR-3666 的表達(dá)TargetScan 在線軟件預(yù)測(cè)顯示，XIST 的序列中含有與miR-3666互補(bǔ)的核苷酸序列（圖4A）。與miR-NC組相比，miR-3666組轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-XIST 的AGS 細(xì)胞的熒光素酶活性降低（P<0.05，圖4B）。抑制lncRNA XIST 表達(dá)，miR-3666 表達(dá)水平升高；過(guò)表達(dá)lncRNA XIST，miR-3666表達(dá)水平降低（P<0.05，圖4C）。

圖4 lncRNA XIST靶向調(diào)控miR-3666的表達(dá)Fig.4 lncRNA XIST targets expression of miR-3666

2.5 miR-3666 過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響 將miR-NC、miR-3666 轉(zhuǎn)染至胃癌AGS 細(xì)胞后，RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-3666 組miR-3666 表達(dá)水平高于miR-NC 組，MTT 檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 后miR-3666 組細(xì)胞增殖能力低于miR-NC 組；Transwell 檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-3666 組細(xì)胞遷移和侵襲能力低于miR-NC組，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-3666 組細(xì)胞凋亡率高于miR-NC組（P<0.05），見圖5。

圖5 miR-3666 過(guò)表達(dá)對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響Fig.5 Effect of miR-3666 overexpression on prolifera?tion，migration，invasion and apoptosis of gastric cancer AGS cells

2.6 miR-3666 的抑制逆轉(zhuǎn)了lncRNA XIST 敲除對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響 將si-XIST分別與anti-miR-NC、anti-miR-3666共轉(zhuǎn)染至胃癌AGS 細(xì)胞后，RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，si-XIST+anti-miR-3666 組miR-3666 表達(dá)水平低于si-XIST+anti-miR-NC組，MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 后si-XIST+anti-miR-3666 組細(xì)胞增殖能力高于si-XIST+anti-miR-NC 組；Transwell 檢測(cè)結(jié)果顯示，si-XIST+anti-miR-3666 組細(xì)胞遷移和侵襲能力高于si-XIST+anti-miR-NC組，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，si-XIST+anti-miR-3666 組細(xì)胞凋亡率低于si-XIST+anti-miR-NC組（P<0.05），見圖6。

圖6 miR-3666 的抑制逆轉(zhuǎn)lncRNA XIST 敲除對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響Fig.6 Inhibition of miR-3666 reversed effect of lncRNA XIST knockout on proliferation，migration，invasion and apoptosis of gastric cancer AGS cells

3 討論

胃癌在全球的發(fā)病率及致死率位居前列，針對(duì)胃癌的靶向治療是研究熱點(diǎn)，是治療晚期胃癌的新治療手段之一，但胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚未完全明確，有待于進(jìn)一步探究，以尋找更多新的靶點(diǎn)［8-9］。已有研究報(bào)道敲降lncRNA XIST 通過(guò)靶向miR-337-3p 下調(diào)HOXC8 的表達(dá)抑制胃癌AGS 細(xì)胞增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［10］。此外，敲低lncRNA XIST 促進(jìn)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡并抑制了細(xì)胞增殖［11］。沉默XIST 可通過(guò)靶向miR-141-3p 抑制胰腺細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胃癌組織和AGS、SGC-7901 細(xì)胞中XIST 表達(dá)水平升高，提示XIST可能在胃癌中起促癌基因作用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步敲除lncRNA XIST 后，胃癌細(xì)胞增殖能力減弱，遷移和侵襲能力降低，細(xì)胞凋亡率升高；表明敲除lncRNA XIST 確實(shí)可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡；lncRNA XIST 在胃癌中的作用與在其他癌癥中的作用相同。

研究報(bào)道m(xù)iR-3666 通過(guò)靶向SATB2 抑制大腸癌細(xì)胞增殖和侵襲［13］。miR-3666 通過(guò)靶向KDM2A抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移［14］。miR-3666 過(guò)表達(dá)通過(guò)靶向Sirtuin 7 抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胃癌組織和AGS、SGC-7901 細(xì)胞中miR-3666 表達(dá)水平降低；過(guò)表達(dá)miR-3666 后胃癌細(xì)胞增殖能力減弱，遷移和侵襲能力降低，細(xì)胞凋亡率升高；表明過(guò)表達(dá)miR-3666 可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

研究報(bào)道敲低NNT-AS1通過(guò)miR-3666/E2F2軸減弱了肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，增強(qiáng)了細(xì)胞凋亡［16］。說(shuō)明lncRNA 可通過(guò)調(diào)控miR-3666 影響腫瘤進(jìn)展，為了研究lncRNA XIST 與miR-3666 的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)在線軟件預(yù)測(cè)XIST 的序列中含有與miR-3666 互補(bǔ)的核苷酸序列，說(shuō)明XIST 可結(jié)合miR-3666。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步構(gòu)建XIST 的野生型及突變型熒光素酶報(bào)告載體，將其與miR-3666共轉(zhuǎn)染至AGS 細(xì)胞，結(jié)果顯示，XIST 野生型熒光素酶報(bào)告載體與miR-3666 共轉(zhuǎn)染后的AGS 細(xì)胞的熒光素酶活性降低；且抑制lncRNA XIST 表達(dá)可提高miR-3666表達(dá)水平，過(guò)表達(dá)lncRNA XIST 可降低miR-3666 表達(dá)水平；表明lncRNA XIST可靶向負(fù)調(diào)控miR-3666。為研究lncRNA XIST 與miR-3666 相互作用對(duì)胃癌的影響，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)抑制miR-3666 和XIST 的表達(dá)，結(jié)果顯示胃癌細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，遷移和侵襲能力升高，細(xì)胞凋亡率降低，說(shuō)明抑制miR-3666 逆轉(zhuǎn)了XIST 基因敲除對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)性及凋亡的影響。

綜上所述，敲除lncRNA XIST 可通過(guò)上調(diào)miR-3666 抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。