川芎嗪調(diào)控NF-κB 信號通路對銀屑病HaCaT 細胞模型趨化因子和炎癥因子表達影響

王 生 劉 洋 張 晶 （河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院皮膚科，唐山 063000）

銀屑病是一種慢性皮膚疾病，病程較長且容易復(fù)發(fā)，一般藥物治療后的效果并不明顯，遺傳、內(nèi)分泌、感染、代謝障礙等均可誘導(dǎo)銀屑病的發(fā)生［1］。角質(zhì)形成細胞發(fā)育不良、角化過度、炎癥浸潤、毛細血管擴張等均為銀屑病的病理特點［2］。研究顯示，角質(zhì)形成細胞在銀屑病的發(fā)生過程中占據(jù)重要地位，其能夠表達炎癥因子IL-6、IL-4、IL-13 和趨化因子Eotaxin、RANTES、TARC，促進炎癥反應(yīng)［3］。川芎嗪是一種從中藥川芎分離提取出來的四甲基吡嗪，具有降血壓、利尿、抗血小板凝集、抗腫瘤等功效［4］。既往研究表明，川芎嗪治療后銀屑病小鼠尾部鱗片中顆粒層明顯增加［5］。川芎嗪處理后HaCaT 細胞中EGF10 表達水平降低，而EGF10 是銀屑病發(fā)生的促進因子［6］。目前對川芎嗪作用機制的相關(guān)研究顯示，川芎嗪抵抗細胞炎癥因子分泌與下調(diào)NF-κB 信號通路的激活水平有關(guān)［7］。NF-κB 是在人體內(nèi)發(fā)揮多種作用的信號調(diào)控通路，在腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等進展中具有重要調(diào)節(jié)作用［8］。在銀屑病中發(fā)現(xiàn)NF-κB 過度激活，而下調(diào)NF-κB 信號水平能夠抑制銀屑病進展，減少銀屑病角質(zhì)形成細胞炎癥因子分泌［9］?，F(xiàn)階段對川芎嗪調(diào)控NF-κB 信號影響銀屑病角質(zhì)形成細胞炎癥因子和趨化因子分泌的作用尚不明確。本實驗以TNF-α 和IFN-γ 刺激人角質(zhì)形成HaCaT 細胞，體外構(gòu)建銀屑病HaCaT 細胞模型，探討川芎嗪在銀屑病中的作用及可能機制，為川芎嗪治療銀屑病提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 川芎嗪購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自美國Abbkine；IL-6含量檢測試劑盒購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；IL-4 含量檢測試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；IL-13含量檢測試劑盒購自上海滬鼎生物科技有限公司；人角質(zhì)形成HaCaT 細胞購自武漢普諾賽生物科技有限公司；p65抗體、IκBα抗體購自美國Cell Signaling Technology。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8 法檢測川芎嗪對HaCaT 細胞增殖活性的影響 將HaCaT 細胞以3 000個/孔分別接種至96 孔板，將細胞置于飽和濕度、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，然后將細胞培養(yǎng)液更換成含有0、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/ml 的川芎嗪的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，24 h 后取出培養(yǎng)板，分別在細胞內(nèi)添加10μl CCK-8溶液，37 ℃下繼續(xù)反應(yīng)4 h。取出培養(yǎng)板，檢測波長為450 nm 處的A 值，以空白孔調(diào)零，計算細胞存活率變化。

1.2.2 實驗分組處理 HaCaT 細胞分為Control、Model、TMP-L、TMP-M、TMP-H組，Model組在實驗0 h時用含10 ng/ml TNF-α 和10 ng/ml IFN-γ 的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，TMP-L、TMP-M、TMP-H 組細胞在實驗開始前2 h分別用含有0.1、0.2、0.4 mg/ml的川芎嗪預(yù)處理，然后用含10 ng/ml TNF-α 和10 ng/ml IFN-γ 的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。Control 為空白對照細胞，不做處理。收集Control、Model、TMP-L、TMP-M、TMP-H 組培養(yǎng)24 h 后的細胞用于后續(xù)檢測。TNF-α 和IFN-γ刺激后的HaCaT細胞分泌的IL-6、IL-4、IL-13水平增加，細胞中Eotaxin、RANTES、TARC 表達水平升高，提示成功構(gòu)建了體外銀屑病HaCaT細胞模型。

1.2.3 qRT-PCR 檢測Eotaxin、RANTES、TARC mRNA 表達 收集細胞，在細胞內(nèi)添加PBS 溶液洗滌2 次，然后吸取1 ml 的Trizol 試劑添加到細胞內(nèi)，提取細胞總RNA。RNA溶解在80μl的DEPC水中。按以下方法配制逆轉(zhuǎn)錄體系，包含：2 μl 5×Prime Buffer、0.5μl Radom 6 mers、0.5μl Oligo dT Primer、0.5 μl Prime Script RT Enzyme Mix、500 ng 總RNA，最后添加RNase Free dH2O 至10μl。將上述試劑混合后，瞬時離心，然后在37 ℃下反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s，4 ℃冷卻。PCR 引物如下：Eotaxin F-5′-AA?CATGGCGGGCTCTGCTAC-3'，R-5′-CCTGCCTTGGGACAGATGCT-3'；RANTES F-5′-CCCCGTGCCGA?GATCAAGGAGTATTT-3'，R-5′-CGTCCAGCCTGGGGAAGGTTTTTGTA-3'；TARC F-5′-ACTGCTCCAGGGATGCCATCGTTTTT-3'，R-5′-ACAAGGGGATGGGATCTCCCTCACTG-3'；GAPDH F-5′-CGTCTAGAAAAACCTGCCAA-3'，R-5′-TGAAGTCAAAGGAGAC?CACC-3'。配制PCR 反應(yīng)體系，包括：0.5μl 正向及反向引物、5μl SYBR GreenⅠ、1μl cDNA，然后添加DEPC 水至10 μl，首先設(shè)置95 ℃孵育40 s，然后以90 ℃孵育3 s，65 ℃退火40 s，共40個循環(huán)，以GAPDH為參照，分析Eotaxin、RANTES、TARC mRNA 水平，計算方法為2-ΔΔCt法。

1.2.4 ELISA 法檢測IL-6、IL-4、IL-13 含量 收集細胞培養(yǎng)液上清，ELISA 分別檢測IL-6、IL-4、IL-13含量，步驟均按照IL-6、IL-4、IL-13 含量檢測試劑盒說明書進行。

1.2.5 Western blot 檢測p65、IκBα 蛋白表達 在RIPA 裂解溶液中以100∶1 比例加入PMSF，混合均勻后置于冰上孵育備用。收集細胞，棄上清，PBS洗滌3 次。將裂解溶液添加到細胞內(nèi)，渦旋30 s，冰上反應(yīng)30 min，期間每隔10 min 渦旋1次。4 ℃條件下以12 000 g 離心10 min。吸取上清溶液，添加5×Loading Buffer 混合后，100 ℃煮沸5 min。將玻璃板洗滌干凈并組裝。按照常規(guī)方法制備10%的分離膠并灌入玻璃板間，室溫靜置50 min 后，棄去上層的無水乙醇，以濾紙吸干。制備5%的濃縮膠，灌入玻璃板內(nèi)，室溫結(jié)合30 min。以30 μg/孔蛋白樣品進行點樣，設(shè)置80 V 電壓電泳30 min，觀察染料進入分離膠后，以120 V 電壓電泳90 min。裁剪PVDF膜，以90 V電壓轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜從電泳槽內(nèi)取出，并置于TBST 溶液洗滌3 次，然后于5%脫脂奶粉中室溫中孵育1 h。將一抗和二抗分別用封閉液稀釋。將PVDF 膜分別置于一抗、二抗溶液中孵育后，ECL法顯色。內(nèi)參為GAPDH，分析目的蛋白的表達變化。p65、IκBα以1∶800稀釋，二抗以1∶4 000稀釋。

1.2.6 NF-κB信號激活劑的逆轉(zhuǎn)作用檢測 HaCaT細胞在實驗開始前2 h 用1μmol/L 的NF-κB 信號激活劑PMA 和0.2 mg/ml 的川芎嗪預(yù)處理，然后用含10 ng/ml TNF-α 和10 ng/ml IFN-γ 的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為TMP-M+PMA組，以TMP-M為參照培養(yǎng)24 h后，qRT-PCR檢測Eotaxin、RANTES、TARC mRNA 表達（參照1.2.3），ELISA 法檢測IL-6、IL-4、IL-13含量（參照1.2.4），Western blot 檢測p65、IκBα 蛋白表達（參照1.2.5）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS21.0軟件分析，計量資料以±s表示，兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗，多組差異比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 川芎嗪對HaCaT 細胞增殖影響 與0 mg/ml川芎嗪處理的細胞相比，0.1、0.2、0.4 mg/ml川芎嗪處理后HaCaT細胞存活率無明顯變化，而0.8 mg/ml川芎嗪處理的HaCaT 細胞存活率明顯降低（表1）。選擇對細胞增殖活性沒有影響的0.1、0.2、0.4 mg/ml的川芎嗪進行后續(xù)實驗。

表1 川芎嗪處理后HaCaT細胞存活率（±s）Tab.1 HaCaT cell survival rate after ligustrazine treat?ment（±s）

表1 川芎嗪處理后HaCaT細胞存活率（±s）Tab.1 HaCaT cell survival rate after ligustrazine treat?ment（±s）

Note：Compared with 0 mg/ml group，1）P<0.05.

Ligustrazine concentration/（mg·ml-1）Cell survival rate/%100.00±9.65 98.25±10.36 94.22±8.78 92.78±10.54 76.25±6.321）9.350<0.001 0 0.1 0.2 0.4 0.8 FP

2.2 川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型趨化因子Eotaxin、RANTES、TARC mRNA 表達影響 結(jié)果見表2，與Control 組相比，Model 組HaCaT 細胞模型中Eotaxin、RANTES、TARC mRNA 表達水平升高；與Model組相比，TMP-L、TMP-M、TMP-H組HaCaT細胞模型中Eotaxin、RANTES、TARC mRNA 表達水平依次降低。

表2 川芎嗪對銀屑病HaCaT細胞模型中Eotaxin、RANTES、TARC mRNA表達的影響（±s）Tab.2 Effect of ligustrazine on expressions of Eotaxin，RANTES and TARC mRNA in HaCaT cell model of psoriasis（±s）

表2 川芎嗪對銀屑病HaCaT細胞模型中Eotaxin、RANTES、TARC mRNA表達的影響（±s）Tab.2 Effect of ligustrazine on expressions of Eotaxin，RANTES and TARC mRNA in HaCaT cell model of psoriasis（±s）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with Model group，2）P<0.05；compared with TMP-L group，3）P<0.05；compared with TMP-M group，4）P<0.05.

TARC mRNA 1.00±0.11 2.96±0.211）2.03±0.142）1.62±0.122）3）1.14±0.112）3）4）274.267<0.001 Groups Control Model TMP-L TMP-M TMP-H FP Eotaxin mRNA 1.00±0.09 3.69±0.251）2.75±0.142）2.23±0.162）3）1.40±0.112）3）4）404.835<0.001 RANTES mRNA 1.00±0.10 4.51±0.281）3.27±0.362）2.23±0.172）3）1.80±0.122）3）4）319.748<0.001

2.3 川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型炎癥因子IL-6、IL-4、IL-13 分泌影響 結(jié)果見表3，與Control組相比，Model 組HaCaT 細胞模型分泌的IL-6、IL-4、IL-13 水平升高；與Model 組相比，TMP-L、TMP-M、TMP-H 組HaCaT 細胞模型分泌的IL-6、IL-4、IL-13水平依次降低。

表3 川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型分泌IL-6、IL-4、IL-13水平的影響（±s，pg/ml）Tab.3 Effect of ligustrazine on levels of IL-6，IL-4 and IL-13 secreted by HaCaT cell model of psoriasis（±s，pg/ml）

表3 川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型分泌IL-6、IL-4、IL-13水平的影響（±s，pg/ml）Tab.3 Effect of ligustrazine on levels of IL-6，IL-4 and IL-13 secreted by HaCaT cell model of psoriasis（±s，pg/ml）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with Model group，2）P<0.05；compared with TMP-L group，3）P<0.05；compared with TMP-M group，4）P<0.05.

IL-13 5.58±0.42 26.35±2.471）14.20±1.222）10.66±1.042）3）6.42±0.502）3）4）349.781<0.001 Groups Control Model TMP-L TMP-M TMP-H FP IL-6 96.32±8.87 275.14±26.311）204.15±13.622）162.01±14.812）3）117.62±10.302）3）4）179.493<0.001 IL-4 23.61±1.47 108.62±11.961）80.43±7.792）53.24±4.112）3）31.20±2.262）3）4）245.796<0.001

2.4 川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型中NF-κB 信號通路激活影響 結(jié)果見圖1、表4，與Control 組相比，Model 組HaCaT 細胞模型中p65 蛋白水平升高，IκBα 蛋白水平降低；與Model 組相比，TMP-L、TMP-M、TMP-H 組HaCaT 細胞模型中p65 蛋白水平依次降低，IκBα蛋白水平依次升高。

表4 川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型中p65、IκBα 蛋白表達的影響（±s）Tab.4 Effect of ligustrazine on p65 and IκBα proteinexpressions in HaCaT cell model of psoriasis（±s）

表4 川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型中p65、IκBα 蛋白表達的影響（±s）Tab.4 Effect of ligustrazine on p65 and IκBα proteinexpressions in HaCaT cell model of psoriasis（±s）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with Model group，2）P<0.05；compared with TMP-L group，3）P<0.05；compared with TMP-M group，4）P<0.05.

p65 0.23±0.02 0.86±0.081）0.56±0.052）0.45±0.042）3）0.30±0.032）3）4）235.106<0.001 Groups Control Model TMP-L TMP-M TMP-H FP IκBα 0.96±0.09 0.25±0.041）0.52±0.062）0.63±0.062）3）0.79±0.072）3）4）150.172<0.001

圖1 Western blot檢測川芎嗪對銀屑病HaCaT細胞模型中p65、IκBα蛋白表達的影響Fig.1 Effect of ligustrazine on p65 and IκBα protein expressions in HaCaT cell model of psoriasis were detected by Western blot

2.5 NF-κB 信號激活劑對川芎嗪作用的銀屑病HaCaT細胞模型中NF-κB信號激活的影響 結(jié)果見圖2、表5，與TMP-M 組相比，TMP-M+PMA 組HaCaT細胞模型中p65蛋白水平升高，IκBα蛋白水平降低。

表5 NF-κB 信號激活劑和川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型中p65、IκBα蛋白表達的影響（±s）Tab.5 Effects of NF-κB signal activator and ligustrazine on expressions of p65 and IκBα protein in HaCaT cell model of psoriasis（±s）

表5 NF-κB 信號激活劑和川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型中p65、IκBα蛋白表達的影響（±s）Tab.5 Effects of NF-κB signal activator and ligustrazine on expressions of p65 and IκBα protein in HaCaT cell model of psoriasis（±s）

Note：Compared with TMP-M group，1）P<0.05.

IκBα 0.60±0.07 0.26±0.031）13.393<0.001 Groups TMP-M TMP-M+PMA tP p65 0.45±0.06 0.98±0.121）11.851<0.001

2.6 NF-κB 信號激活劑對川芎嗪作用的銀屑病HaCaT細胞模型趨化因子表達和炎癥因子分泌的影響 結(jié)果見表6，與TMP-M 組相比，TMP-M+PMA 組HaCaT 細胞模型中Eotaxin、RANTES、TARC mRNA水平升高，細胞分泌的IL-6、IL-4、IL-13增多。

表6 NF-κB 信號激活劑和川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型中Eotaxin、RANTES、TARC mRNA 表達和分泌IL-6、IL-4、IL-13水平的影響（±s）Tab.6 Effect of NF-κB signal activator and ligustrazine on expressions of Eotaxin，RANTES，TARC mRNA and secretion of IL-6，IL-4 and IL-13 levels in HaCaT cell model of psoriasis（±s）

表6 NF-κB 信號激活劑和川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型中Eotaxin、RANTES、TARC mRNA 表達和分泌IL-6、IL-4、IL-13水平的影響（±s）Tab.6 Effect of NF-κB signal activator and ligustrazine on expressions of Eotaxin，RANTES，TARC mRNA and secretion of IL-6，IL-4 and IL-13 levels in HaCaT cell model of psoriasis（±s）

Note：Compared with TMP-M group，1）P<0.05.

IL-13/（pg·ml-1）9.76±0.75 16.42±1.371）12.792<0.001 Groups TMP-M TMP-M+PMA tP Eotaxin mRNA 1.00±0.08 1.86±0.121）17.889<0.001 RANTES mRNA 1.00±0.10 2.64±0.231）19.617<0.001 TARC mRNA 1.00±0.09 1.56±0.131）10.625<0.001 IL-6/（pg·ml-1）163.50±12.84 200.61±13.601）5.952<0.001 IL-4/（pg·ml-1）52.87±5.39 86.48±6.921）11.495<0.001

3 討論

銀屑病是臨床上常見的有遺傳背景的慢性炎癥性皮膚疾病，以紅色丘疹、銀白色鱗屑皮損為主要表現(xiàn)［10］。近年來，角質(zhì)形成細胞在銀屑病進展中的作用逐漸被揭示，其可分泌大量炎癥因子，促進炎癥反應(yīng)，加速疾病進展［11］。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種細胞因子在銀屑病皮損組織中高表達，并可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞分泌更多炎癥因子和細胞因子［12］。TNF-α和IFN-γ 具有誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞損傷的作用，其也是常見的體外構(gòu)建銀屑病角質(zhì)形成細胞模型的誘導(dǎo)因子。既往研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α 和IFN-γ 刺激后的角質(zhì)形成細胞分泌的炎癥因子如IL-6、IL-4、IL-13等的表達水平升高，且趨化因子如Eotaxin、RANTES、TARC 的表達水平也升高［13］。IL-6、IL-4、IL-13 等炎癥因子能夠加重炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)組織損傷。人體組織中有多種趨化因子，其可激活并趨化白細胞，促進組織炎癥發(fā)生［14-15］。本研究結(jié)果顯示，TNF-α 和IFN-γ 刺激后的HaCaT 細胞分泌的IL-6、IL-4、IL-13水平增加，細胞中Eotaxin、RANTES、TARC表達水平升高，提示體外銀屑病HaCaT細胞模型構(gòu)建成功。

川芎最初記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歸膽、肝、心包經(jīng)，味辛、性溫，川芎嗪是從川芎內(nèi)提取出來的生物堿單體，具有抗炎、抗氧化等功效［16］。有研究顯示，川芎嗪對心肌缺血再灌注、關(guān)節(jié)炎軟骨細胞等有保護作用，其可降低組織細胞中炎癥因子水平，抑制炎癥反應(yīng)［7，17］。既往研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪對HaCaT 細胞中促銀屑病因子FGF10有抑制功效［6］。川芎嗪腹腔注射后的銀屑病小鼠皮損程度有所緩解［5］。本實驗表明，川芎嗪能夠降低銀屑病HaCaT 細胞模型分泌炎癥因子水平，減少細胞中趨化因子Eotaxin、RANTES、TARC 表達，提示川芎嗪可能通過抑制角質(zhì)形成細胞分泌促炎因子阻礙銀屑病進程，與既往研究報道相符，說明川芎嗪具有抗銀屑病作用。

NF-κB 最早發(fā)現(xiàn)于B 細胞，后續(xù)發(fā)現(xiàn)NF-κB 參與黏附因子、炎癥因子、生長因子等的表達，其也被認(rèn)為是免疫及炎癥反應(yīng)的中心樞紐，NF-κB 激活后不僅能夠誘導(dǎo)下游炎癥因子如IL-6、IL-4、IL-13的表達，還可通過促進趨化因子如Eotaxin、RANTES、TARC 的表達趨化白細胞，促進組織炎癥發(fā)生［18］。目前在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了多種NF-κB 信號亞單位，這些成員均有Rel 同源區(qū)域，它們通過形成二聚體影響基因的轉(zhuǎn)錄過程［19］。p65 是經(jīng)典NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)必不可少的亞單位［20］。IκBα 是NF-κB 的抑制蛋白，其可與NF-κB 結(jié)合抑制NF-κB 的活性［21-22］。既往研究表明，NF-κB在銀屑病進展中過度活化，其活性升高后促進角質(zhì)形成細胞促炎因子分泌，而抑制NF-κB 具有保護銀屑病角質(zhì)形成細胞的作用［23-24］。本研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病HaCaT 細胞模型中p65蛋白表達水平升高，IκBα 蛋白表達水平降低，而川芎嗪能夠降低p65 蛋白表達水平，促進IκBα 蛋白表達，說明川芎嗪的作用機制可能與NF-κB 有關(guān)。既往研究證實，川芎嗪的抗炎作用與NF-κB 有關(guān)，其可降低NF-κB 激活水平，抑制LPS 誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細胞炎癥損傷，后續(xù)在心肌缺血再灌注中也發(fā)現(xiàn)川芎嗪的作用機制與NF-κB 有關(guān)［7，17］。本研究進一步觀察發(fā)現(xiàn)，NF-κB 信號激活劑逆轉(zhuǎn)川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型促炎因子表達作用，川芎嗪參與銀屑病進展與NF-κB 信號有關(guān)，與既往研究結(jié)果相符，均說明川芎嗪的藥理作用與NF-κB信號有關(guān)。

綜上，川芎嗪在銀屑病進展中發(fā)揮抑制作用，其可在體外減少銀屑病HaCaT 細胞模型分泌炎癥因子和表達趨化因子，且其機制與NF-κB 信號有關(guān)。目前對于川芎嗪通過何種機制調(diào)控NF-κB 進而影響銀屑病HaCaT 細胞炎癥尚不明確，課題組在以后的實驗中會進行具體探討。本實驗為川芎嗪治療銀屑病的臨床應(yīng)用提供了資料，為進一步研究川芎嗪在銀屑病中的作用機制奠定了基礎(chǔ)。