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    孕酮及其受體、IL-8與原因不明自然流產(chǎn)的相關性研究①

    2022-07-21 09:15:48馬銘艷楊美霞宮曉玲趙紫薇岳淑芬
    中國免疫學雜志 2022年10期
    關鍵詞:母胎蛻膜組織化學

    馬銘艷 楊美霞 宮曉玲 趙紫薇 岳淑芬 宋 芳

    (包頭醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室,包頭 014040)

    自然流產(chǎn)病因較多且復雜,其中70%~80%原因不明。越來越多學者認為自然流產(chǎn)發(fā)生與母胎界面免疫微環(huán)境Th1/Th2 細胞因子失衡有關。王麗紅等[1]研究發(fā)現(xiàn),IL-8 是Th1 型細胞因子,其高表達可能與自然流產(chǎn)有關,但與別川定[2]觀點不同。王巧香[3]研究發(fā)現(xiàn),孕酮(progesterone,P)可促進Th2 型細胞因子分泌,維持正常妊娠。據(jù)統(tǒng)計,由于P 不足發(fā)生先兆流產(chǎn)患者肌內注射黃體酮治療后,仍有部分患者保胎失敗,推測可能與Th1/Th2 細胞因子失衡有關[4]。本課題組前期動物實驗證明,P可抑制自然流產(chǎn)小鼠母胎界面蛻膜細胞分泌IL-8,維持正常妊娠[5]。但人體存在復雜的細胞因子網(wǎng)絡,P不足是否與IL-8 表達相關尚未見報道。孕酮受體(progesterone receptor,PR)受雌孕激素雙重調控,與P 特異性結合發(fā)揮作用。因此,本文通過研究P、PR和IL-8 在自然流產(chǎn)患者外周血及母胎界面的表達情況,揭示其中關聯(lián),為進一步探討類固醇激素-蛻膜細胞-細胞因子在自然流產(chǎn)中的調節(jié)機制奠定理論基礎。

    1 資料與方法

    1.1 資料

    1.1.1 研 究 對 象 取2019 年5 月 至2020 年5 月包鋼第三職工醫(yī)院婦產(chǎn)科門診就診,出現(xiàn)少量陰道出血,B 超提示胚胎死亡,需進行清宮的30 例原因不明自然流產(chǎn)患者作為流產(chǎn)組。納入標準:①首次發(fā)生自然流產(chǎn);②夫妻雙方染色體核型正常,男方精液常規(guī)檢查正常;③患者無生殖道解剖學異常;④無主動免疫治療史。排除標準:遺傳性疾病、內分泌系統(tǒng)疾病、急慢性疾病、血液病、器質性病變、不良飲食史、服藥史及年齡≥40 歲患者。隨機選取同期正常早孕婦女30 例作為對照組,無自然流產(chǎn)史,無腹痛、陰道流血等癥狀,自愿行人工流產(chǎn)術,B 超提示胚胎發(fā)育正常。兩組一般資料差異無統(tǒng)計學意義,具有可比性。本研究經(jīng)包頭醫(yī)學院倫理委員會審批,所有研究對象知情同意。

    1.1.2 主要試劑 P、IL-8 ELISA 試劑盒(上海聯(lián)碩生物科技有限公司);兔抗人PR 抗體(英國Abcam公司);兔抗人IL-8 抗體(美國Santa Cruz 公司);PV-6000 試劑盒及DAB 顯色液(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 標本收集與處理 所有研究對象均于清晨空腹抽取肘正中靜脈血3 ml,1 h 內2 000 r/min 離心10 min,取上清,每人份分裝2 管,-20 ℃保存。流產(chǎn)組和對照組在施行清宮術時收集絨毛及蛻膜組織,生理鹽水沖洗干凈后Bouin's 液固定,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋制成蠟塊保存。

    1.2.2 ELISA 按照ELISA 測定試劑盒說明書,依次在預包被板中加入標準品或待測樣品(37 ℃、120 min)、生物素化抗體(37 ℃、60 min)、辣根過氧化物酶標記的鏈霉抗生物素蛋白(37 ℃、120 min)、TMB 顯色液37 ℃暗處反應5~10 min,加入終止液混勻,酶標儀檢測450 nm處吸光度。

    1.2.3 HE 染色 各蠟塊標本均切為5 μm,常規(guī)脫蠟水化,蘇木素染色3 min,加入1%鹽酸乙醇反應5 s,加入氨水反應5 s;伊紅染色2 min,乙醇脫水,透明,封片,鏡檢。

    1.2.4 免疫組織化學染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化,EDTA 抗原修復液微波修復10 min,加入0.3%H2O2-甲醇室溫孵育10 min,滴加兔抗人PR 抗體(1∶400)、兔抗人IL-8 抗體(1∶200)4 ℃孵育過夜;滴加辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG 抗體室溫孵育20 min,DAB 顯色6~10 min。蘇木素復染細胞核,常規(guī)脫水,透明,封片,鏡檢。PBS 代替一抗作為陰性對照,200 倍光鏡下每張切片選取5 個視野,Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件計算平均光密度值表示PR、IL-8 蛋白相對表達,免疫組織化學染色切片進行半定量分析。

    1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料以xˉ±s 表示,采用獨立樣本t檢驗;P、PR與IL-8相關性分析采用Pearson等級相關性分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 ELISA 測定 ELISA 結果顯示,流產(chǎn)組血清P水平明顯低于對照組(P<0.01);流產(chǎn)組血清IL-8 水平明顯高于對照組(P<0.01,表1)。

    表1 兩組血清P、IL-8水平比較(±s)Tab.1 Comparison of serum P and IL-8 concentrations in two groups(±s)

    表1 兩組血清P、IL-8水平比較(±s)Tab.1 Comparison of serum P and IL-8 concentrations in two groups(±s)

    Note:1)P<0.01 vs control group.

    IL-8/(pg·ml-1)1 411.03±256.241)628.45±175.36 Groups Abortion Control P/(nmol·L-1)27.38±3.171)64.21±6.35

    2.2 HE 染色 絨毛組織中,流產(chǎn)組絨毛上皮變薄,細胞嗜酸性增強,結締組織細胞纖維素樣變。對照組絨毛上皮合體滋養(yǎng)層細胞較多,細胞膜界限不清,流產(chǎn)組細胞滋養(yǎng)層細胞界限清晰,絨毛內結締組織細胞呈星芒狀排列(圖1A)。蛻膜組織中,流產(chǎn)組蛻膜細胞失去細胞間連接,細胞質嗜酸性增強,對照組蛻膜細胞體積較大,呈砌磚樣緊密排列,細胞界限清晰,細胞核呈圓形或卵圓形,位于細胞中央,著色淺(圖1B)。

    圖1 流產(chǎn)組與對照組絨毛組織、蛻膜組織HE染色(×200)Fig.1 HE staining of villi and decidua in abortion group and control group(×200)

    2.3 免疫組織化學染色

    2.3.1 絨毛和蛻膜中PR 和IL-8 蛋白組織學定位免疫組織化學染色結果顯示,兩組絨毛組織PR蛋白表達均為陰性,兩組蛻膜組織中PR 均表達于蛻膜細胞的細胞核,呈棕黃色顆粒(圖2A)。兩組絨毛組織中IL-8 均表達于絨毛上皮細胞的細胞質,呈棕黃色顆粒,兩組蛻膜組織中IL-8 均表達于蛻膜細胞的細胞質,呈棕黃色顆粒,各組陽性反應均強弱不等(圖2B)。

    圖2 兩組絨毛和蛻膜組織中PR、IL-8表達(×200)Fig.2 Expressions of PR and IL-8 in villi and decidual tissues in two groups(×200)

    2.3.2 PR 和IL-8 免疫組織化學染色半定量分析流產(chǎn)組蛻膜組織中PR 含量明顯低于對照組(P<0.01)。流產(chǎn)組絨毛組織中IL-8 含量明顯高于對照組(P<0.01)。流產(chǎn)組蛻膜組織中IL-8 含量高于對照組(P<0.05,表2)。

    表2 兩組絨毛和蛻膜組織中PR、IL-8蛋白含量比較(±s)Tab.2 Comparison of PR and IL-8 protein contents in villi and decidua in two groups(±s)

    表2 兩組絨毛和蛻膜組織中PR、IL-8蛋白含量比較(±s)Tab.2 Comparison of PR and IL-8 protein contents in villi and decidua in two groups(±s)

    Note:0. Negative expression;1)P<0.05,2)P<0.01 vs control group.

    IL-8 Villi Decidua 0.140±0.0092) 0.164±0.0891)0.131±0.018 0.109±0.063 Groups Abortion Control PR Villi Decidua 0 0.109±0.0172)0 0.148±0.020

    2.4 P、PR 與IL-8 相關性分析 流產(chǎn)組血清P 與IL-8呈顯著負相關(r=-0.870,P<0.01),流產(chǎn)組蛻膜組織PR 與IL-8 水平呈顯著負相關(r=-0.650,P<0.01,圖3)。

    圖3 相關性分析Fig.3 Correlation analysis

    3 討論

    自然流產(chǎn)指妊娠<28周、胎兒體重<1 kg、非人為原因導致的流產(chǎn),其病因受到廣泛關注,母體類固醇激素水平異常、母胎界面Th1/Th2 細胞因子失衡都可能導致自然流產(chǎn)。生殖免疫學認為,正常妊娠以Th2 型細胞為主,當向Th1 型細胞偏離時,Th1 型細胞分泌IL-8、IFN-γ、TNF-α 等促炎因子,抑制Th2型細胞增殖,破壞母胎界面免疫微環(huán)境,引發(fā)流產(chǎn)[6-9]。因此,維持正常免疫平衡是降低流產(chǎn)發(fā)生率的關鍵。

    P 是一種天然孕激素,妊娠早期,黃體分泌大量P,使血清P 含量不斷升高,與Ca2+結合降低子宮平滑肌興奮性,促進胚泡著床,一定程度防止流產(chǎn)發(fā)生;但黃體功能異常、P 分泌減少則易發(fā)生先兆流產(chǎn)等[10-11]。因此,P 水平對早期妊娠維持十分重要。RAGHUPATHY 等[12]研究發(fā)現(xiàn),P可通過抑制淋巴細胞產(chǎn)生Th1 型細胞因子,上調Th2 型細胞因子表達,維持Th1/Th2 細胞因子平衡。此外,TAN 等[13]研究發(fā)現(xiàn),P與A型PR結合可增強Th1型細胞因子表達,具有殺胚作用,與B 型PR 結合可降低Th1 型細胞因子表達,對滋養(yǎng)層細胞和胎兒起保護作用。

    IL-8 是Th1 型細胞分泌的一種炎癥因子,對中性粒細胞、T 淋巴細胞、嗜堿性粒細胞具有趨化作用,并可激活中性粒細胞,引發(fā)炎癥反應,還可與TNF-α 等促炎因子共同破壞母胎界面免疫微環(huán)境,促使滋養(yǎng)層細胞凋亡,影響胎盤功能。

    本研究發(fā)現(xiàn),自然流產(chǎn)患者血清P 水平明顯低于正常妊娠者,與謝雪梅等[14]結論一致。研究證實,妊娠早期,P 分泌不足,導致子宮平滑肌興奮性增強,易發(fā)生自然流產(chǎn)等。免疫組織化學染色結果表明,流產(chǎn)組蛻膜組織中PR 含量明顯低于對照組,與李新菊[15]研究結論一致。正常妊娠時,P 與PR 特異性結合,促進子宮內膜基質細胞轉化為蛻膜細胞,為胚胎發(fā)育提供營養(yǎng)物質,維持妊娠;PR表達減少,影響P 生理功能,增強子宮平滑肌興奮性,使蛻膜組織發(fā)生不同程度凋亡、壞死,引發(fā)流產(chǎn)。

    本研究發(fā)現(xiàn),自然流產(chǎn)患者血清、絨毛和蛻膜組織中IL-8 水平明顯高于正常妊娠者,與許云霞[16]研究結論一致。原因可能為絨毛和蛻膜組織中的免疫細胞被激活,釋放IL-8、TNF-α 等促炎因子,引發(fā)炎癥反應,同時損傷胎兒胎盤組織,引發(fā)自然流產(chǎn)。

    此外,本研究發(fā)現(xiàn),P 與IL-8 以及PR 與IL-8均呈負相關,提示P、PR 可能對IL-8 具有一定抑制作用,從而減少母胎界面炎癥因子釋放、淋巴細胞活化,使胚胎免受母體免疫系統(tǒng)殺傷,減少中性粒細胞侵入蛻膜組織,從而維持正常妊娠。HORIE等[17]通過研究子宮內膜異位癥患者基質細胞,發(fā)現(xiàn)P 可通過抑制NF-κB 信號通路下調IL-8 表達。P 通過哪種信號途徑調節(jié)自然流產(chǎn)患者IL-8 表達尚無文獻報道。

    綜上所述,P、PR 低表達、IL-8 高表達均可能引發(fā)自然流產(chǎn),且P、PR 可能對IL-8 有一定抑制作用。因此,進一步從類固醇激素-蛻膜細胞-細胞因子網(wǎng)絡揭示P下調IL-8表達的分子機制可為早期自然流產(chǎn)防治提供理論依據(jù)。

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