中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)形成的分子機制研究進展①

蔣 瑤 邢 艷 （川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，南充 637000）

中性粒細胞是人體內(nèi)含量最多的固有免疫細胞，通過抵御病原體入侵而在固有免疫中起重要作用，經(jīng)典殺菌方式包括吞噬和脫顆粒。中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）作為中性粒細胞區(qū)別于凋亡和壞死的第三種死亡形式，其獨特的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可捕獲和殺滅病原體而對機體有保護作用。但近年越來越多研究發(fā)現(xiàn)，異常NETs 參與多種疾病發(fā)生發(fā)展，如自身免疫性疾病、動脈粥樣硬化、癌癥等［1］。闡明NETs 形成的分子機制對調(diào)控異常NETs 釋放具有重要意義，進而為疾病治療提供可能靶點。因此，本綜述將重點論述NETs形成的分子機制，同時關(guān)注其與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 NETs概述

1.1 NETs 的發(fā)現(xiàn)及其結(jié)構(gòu)特征 1996 年，TAKEI等［2］發(fā)現(xiàn)佛波酯（phorbol ester，PMA）處理中性粒細胞后的形態(tài)變化與凋亡和壞死完全不同，且最終可導(dǎo)致細胞死亡。8 年后，BRINKMANN 等［3］發(fā)現(xiàn)激活后的中性粒細胞釋放顆粒蛋白和染色質(zhì)后形成NETs從而誘捕細菌。2007年，F(xiàn)UCHS等［4］證實中性粒細胞釋放NETs 的這種死亡方式不同于凋亡和壞死，并將其定義為中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)式死亡（NETosis），其大致過程為中性粒細胞被活化后，核膜裂解，胞質(zhì)中的彈性蛋白酶和髓過氧化物酶進入細胞核內(nèi)并作用于組蛋白，促使染色質(zhì)解聚，從細胞核中釋放出來與細胞質(zhì)中的各種抗菌物質(zhì)及顆粒蛋白結(jié)合后一起釋放至胞外形成NETs［5-6］。高分辨率掃描電子顯微鏡顯示，NETs具有獨特的超微結(jié)構(gòu)，其主要成分為直徑15～17 nm 的DNA 纖維和直徑約為25 nm 的球形蛋白結(jié)構(gòu)域，共同構(gòu)成可達50 nm的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［3］。

1.2 NETs 的啟動因素 NETs 是中性粒細胞激活后釋放的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，活化因素包括多種病原體，如肺炎克雷伯菌、白色念珠菌、利士曼原蟲、HIV-1等［6］。一些細胞因子、化學(xué)試劑和細菌成分也可促進NETs 生成，如TNF-α、PMA、脂多糖（lipopolysac?charide，LPS）［7］。研究發(fā)現(xiàn)脂類物質(zhì)也可調(diào)控NETs形成，如中性粒細胞脂質(zhì)成分改變可促進NETs 形成［8］；生理水平的2-氯脂肪酸可誘導(dǎo)人中性粒細胞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且可減少大腸桿菌集落形成［9］；氧化性低密度脂蛋白可顯著促進PMA 誘導(dǎo)的HL-60 來源的中性粒細胞形成NETs，而還原性低密度脂蛋白則無此功能［10］。經(jīng)典化學(xué)誘導(dǎo)劑PMA 或金黃色葡萄球菌存在情況下，抗菌肽LL-37 可顯著促進人源性原代中性粒細胞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成［11］。ARAI 等［12］發(fā)現(xiàn)低濃度尿酸可抑制NETs 形成，而高濃度則促使NETs 產(chǎn)生。血紅素可在體內(nèi)外刺激中性粒細胞釋放NETs，而參與鐮狀細胞病發(fā)病過程［13］?？沽字贵w和抗中性粒細胞胞漿抗體可刺激NETs 形成而分別參與抗磷脂綜合征患者血栓產(chǎn)生及抗中性粒細胞胞漿抗體相關(guān)性血管炎發(fā)病過程［14］。更多通過刺激NETs 形成而參與疾病進展的誘導(dǎo)物有待進一步發(fā)現(xiàn)。

2 NETs形成的分子機制

2.1 活性氧（reactive oxygen species，ROS） ROS是一組有高化學(xué)活性的含氧分子總稱，包括次氯酸、過氧化物、單線態(tài)氧等，幾乎可與所有細胞成分作用而改變其特性。機體生理產(chǎn)生的ROS 則主要由酶代謝產(chǎn)生，如NADPH 氧化酶（NADPH oxidase，NOX）復(fù)合物。研究表明，胞內(nèi)NOX 參與NETs 形成，加入NOX 抑制劑（二亞苯基碘、DPI）時可抑制氧化 還 原 反 應(yīng) 完 全 阻 斷PMA 誘 導(dǎo) 的NETs 釋 放［15］。NOX 缺陷突變小鼠中性粒細胞無法形成NETs，且慢性肉芽腫性疾病（chronic granulomatous disease，CGD）患者中性粒細胞因缺少NOX 膜亞基gp91phox（即NOX2），采用PMA 刺激后無NETs 產(chǎn)生，加入外源性過氧化氫時則恢復(fù)其NETs 形成能力，且通過基因治療重塑CGD 患者中性粒細胞生成NETs 能力后可恢復(fù)其對曲霉菌分生孢子和菌絲的清除，并促使難治性侵襲性肺曲霉菌病快速治愈［16］。IL-8通過PI3K/AKT/ROS軸促進NETs形成而參與膠質(zhì)母細胞瘤進展［17］；載脂蛋白E 可通過ROS/MAPK/MSK1 途徑調(diào)控NETs 形成而促進心肌梗死后梗死愈合［18］。證明NOX 產(chǎn)生的ROS 對NETs 形成具有重要作用，有助于開發(fā)相應(yīng)治療藥物，如中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑ONO-5046 可通過抑制ROS 產(chǎn)生而減少LPS 誘導(dǎo)的NETs 形成，從而減輕炎癥癥狀［19］。此外，幾種調(diào)節(jié)NOX2 活性的酶，如蛋白激酶C，也參與網(wǎng)狀形成，但觸發(fā)NETs 釋放的受體和ROS 驅(qū)動的分子機制鮮有報道［20］。

NETs形成除依賴ROS經(jīng)典途徑外，也存在不依賴ROS的早期/快速釋放途徑。NOX 非依賴性NETs形成過程中，中性粒細胞無法被裂解，而通過核膜起泡和由內(nèi)向外的囊泡運輸釋放NETs。活化的血小板是NOX 非依賴性網(wǎng)絡(luò)形成的有力誘導(dǎo)物［21］。此外，白色念珠菌刺激中性粒細胞通過Dectin-2 介導(dǎo)的NOX 非依賴性NETs 形成有助于抑制真菌擴散［22］。TNF-α、利什曼原蟲前鞭毛體、免疫復(fù)合物（immobilized immune complexes，ICs）誘導(dǎo)形成的NETs 均不依賴于ROS 途徑［5，15，23］。綜上，NETs 形成是否需ROS 參與因刺激物種類而異，而ROS 通過何種機制促進NETs形成有待進一步研究。

2.2 肽酰基精氨酸脫亞胺酶4（peptiylarginine deimidase 4，PAD4） PAD 是一種翻譯后修飾酶，可催化蛋白肽鏈中精氨酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)楣习彼釟埢?。PAD有5個亞型，其中PAD4通過介導(dǎo)組蛋白精氨酸殘基瓜氨酸化使染色質(zhì)去致密化參與NETs 形成過程，而PAD2 參與TNF-α 誘導(dǎo)的組蛋白瓜氨酸化而參與關(guān)節(jié)炎發(fā)病，與NETs形成無關(guān)［24］。G??WEIN等［25］發(fā)現(xiàn)鈣離子載體誘導(dǎo)的NETs 形成顯著依賴于PAD4，選擇性PAD4 抑制劑可阻止其誘導(dǎo)的染色質(zhì)解聚，并進一步發(fā)現(xiàn)PAD4 依賴于鈣蛋白酶蛋白水解發(fā)揮其破裂核膜和解縮染色質(zhì)能力。且氯胺啶（一種廣譜的PAD 抑制劑）或GSK484（一種選擇性的PAD4 抑制劑）也可阻止TNF-α、GM-CSF、PMA 誘導(dǎo)的組蛋白H3 瓜氨酸化［15］。趨化因子刺激PAD4-/-中性粒細胞后無法形成NETs 而喪失固有免疫防御能力［26］。PAD4 缺陷中性粒細胞在離子霉素或PMA體外刺激下無法釋放NETs，但因產(chǎn)生更多ROS而加重急性炎癥，增加心肌梗死后組織損傷［27］。此外，PAD4-/-乳腺癌小鼠因NETs 形成障礙可減小原發(fā)性腫瘤及肺轉(zhuǎn)移瘤體積和重量，且靶向抑制PAD4 表達可明顯改善克羅恩病、多發(fā)性骨髓瘤、急性胰腺炎、狼瘡模型小鼠臨床癥狀及疾病進展［28-32］。綜上，PAD4 通過參與NETs 形成而介導(dǎo)相應(yīng)疾病，那么調(diào)控PAD4 功能的相關(guān)分子又有哪些？研究表明由TNFAIP3編碼的A20去泛素酶結(jié)構(gòu)域遺傳變異通過上調(diào)PAD4 表達及由此產(chǎn)生的蛋白瓜氨酸化和NETs 形成增加SLE 易感性［33］。此外，miR-155 通過富含AU 元件的3'UTR 區(qū)而調(diào)控PAD4 mRNA 表達，因此，靶向miR-155 可能有助于抑制炎癥性疾病中過度NETs 生成［34］。但當白色念珠菌、溶組織內(nèi)阿米巴滋養(yǎng)體作為刺激物時，NETs形成也可不依賴于PAD4 活性［35-36］。故PAD4 在NETs 形成中的作用有待進一步研究，且這些刺激因子在中性粒細胞中如何活化PAD4而促進NETs形成的機制尚不明確。

2.3 信號通路蛋白 細胞生長、增殖、衰老等生物學(xué)過程受大量信號蛋白分子調(diào)控，從而影響整個機體生命進程。NETs作為中性粒細胞的一種死亡形式，參與其中的信號通路蛋白是研究熱點。ZHU 等［37］研究發(fā)現(xiàn)PMA、離子霉素和MSU 刺激中性粒細胞后分別有64、97 和141 種蛋白受不同調(diào)控，進一步發(fā)現(xiàn)有931、565 和201 個磷酸化位點存在差異調(diào)節(jié)。據(jù)此發(fā)現(xiàn)抑制TAK1、p38 MAPK 及MEK通路后中性粒細胞形成的胞外染色質(zhì)細絲較短，且?guī)缀鯚o相互連接，但對染色質(zhì)的釋放影響較小，從而調(diào)控NETs早期形成。相比之下，Syk 和PI3K 蛋白抑制劑處理中性粒細胞后幾乎無染色質(zhì)排出，表明其參與NETs后期形成過程。而抑制PKC、Src家族激酶和JNK 合成及轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯過程后無法有效阻止NETs 產(chǎn)生［15］。但特異性抑制劑實驗證明JNK 和PI3K 參與綠膿素誘導(dǎo)的NETs 形成［7］。RAVINDRAN 等［38］研究發(fā)現(xiàn)，JNK 抑制劑如SP600125 顯著干擾LPS 誘導(dǎo)的NETs 形成，但不影響PMA 的刺激作用，表明兩種激動劑通過不同機制發(fā)揮其作用。此外，不同生理性刺激劑參與NETs 生成的分子機制也有差異，如抗β2-糖蛋白Ⅰ（β2GPⅠ）/β2GPⅠ復(fù)合物刺激形成的NETs 不依賴于p38、AKT、ERK1/2 或鋅信號［39］。固定化ICs 誘導(dǎo)人原代中性粒細胞釋放的NETs，由FcγRⅢb 介導(dǎo)，β2 整合素及Src/Syk、PI3K/Akt、p38 MAPK 和ERK1/2 參與通路調(diào)控［40］；此外，丙泊酚可通過抑制p-ERK 和HOCl 產(chǎn)生減少PMA 誘導(dǎo)的NETs 形成［41］。假結(jié)核耶爾森氏菌黏附蛋白invasin可誘導(dǎo)ROS 產(chǎn)生和染色質(zhì)釋放進入胞外環(huán)境，通過β1 整合素介導(dǎo)，依賴于ROS 和PI3K 信號傳遞［42］?？傊?，多種級聯(lián)蛋白通路參與NETs 形成，但又因刺激物不同而存在差異。

近年研究發(fā)現(xiàn)，多條信號通路蛋白通過調(diào)控NETs 形成而參與多種疾病發(fā)生發(fā)展。NETs 驅(qū)動銀屑病的皮膚炎癥反應(yīng)及急性肺損傷中分別依賴于TLR4/IL-36R、MyD88/NF-κB及p38 MAPK通路激活，RA患者中，IgA自身抗體復(fù)合物可通過激活FcαRⅠ誘導(dǎo)NETs形成引起關(guān)節(jié)損傷，加重疾?。?3-45］。此外，研究發(fā)現(xiàn)靶向阻斷NOX2 和p38 MAPK 信號可改善NETs引起的慢性肝病患者術(shù)后肝功能和生存率抑制STAT1、HMGB1-TLR2/TLR4、PI3K-γ、Raf1-MEK-1-Erk 激活可減輕NETs 引起腦缺血損傷、急性炎癥損傷及顯微鏡下型多血管炎等多種疾病的臨床癥狀［46-50］。綜上，靶向抑制信號通路蛋白活化可在一定程度治療NETs相關(guān)性疾病。

2.4 自噬 自噬在中性粒細胞中高度保守，不僅骨髓中參與中性粒細胞分化，且在中性粒細胞顆粒形成、脫顆粒、細胞因子產(chǎn)生、NETs釋放等方面發(fā)揮重要作用［39］。ANCA 誘導(dǎo)的自噬可促進NETs 形成，這種作用可被自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素增強，被自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）減弱［51］。ULLAH 等［52］發(fā)現(xiàn)肺炎球菌以Ⅲ型PI3K 依賴的方式誘導(dǎo)中性粒細胞自噬?？谷苊阁w膜蛋白-2 抗體（抗LAMP-2 抗體）刺激的人中性粒細胞凋亡率顯著降低，這種作用可被自噬抑制劑3-MA 和LY294002 減弱，而凋亡抑制劑ZVAD-fmk 和壞死抑制劑NEC-1 則無明顯影響。此外，抗LAMP-2抗體刺激的中性粒細胞中，LC3BⅠ轉(zhuǎn)化為LC3BⅡ的比例顯著提高，并出現(xiàn)大量空泡化，呈現(xiàn)典型自噬特征，證明自噬參與人中性粒細胞網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成［53］。自噬基因ATG5 缺陷小鼠的嗜酸性粒細胞和中性粒細胞在生理激活或暴露于低濃度PMA 時均無網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成［54］。研究發(fā)現(xiàn)，NETs依賴于自噬而參與胰腺癌發(fā)病過程，且應(yīng)激反應(yīng)蛋白REDD1通過調(diào)節(jié)自噬促進NETs形成而參與SLE 終末器官損傷和纖維化［55-56］。故通過抑制自噬可能對NETs相關(guān)性疾病起一定防治作用。

2.5 代謝相關(guān)分子 除調(diào)控NETs 形成的蛋白外，NETs 形成的代謝特征也引發(fā)廣泛關(guān)注。PMA 刺激形成NETs 時葡萄糖攝取和糖酵解速率增加，糖酵解抑制劑2-脫氧葡萄糖抑制NETs 形成，說明NETs形成依賴于葡萄糖。中性粒細胞在無糖培養(yǎng)基中暴露于PMA 3 h時，失去其特有細胞核形態(tài)，但不釋放NETs，加入葡萄糖后，幾分鐘內(nèi)就會發(fā)生凈釋放，表明NETs 形成在代謝上分為兩個階段：第一階段獨立于外源葡萄糖（染色質(zhì)解聚），第二階段嚴格依賴于外源葡萄糖和糖酵解，且葡萄糖通過磷酸戊糖途徑參與NETs 形成［57］。ZHU 等［37］研究顯示磷酸化細胞色素b-245 輕鏈（p22phox）在PMA 和離子霉素處理的中性粒細胞中分別上調(diào)11.7 倍和3.9 倍。此外，磷酸化中性粒細胞胞漿因子4（p40phox）在PMA 處理的中性粒細胞表達比未經(jīng)處理的對照細胞高6 倍。病原體被特異性受體識別后，通過細胞內(nèi)Ca2+濃度升高而啟動NETosis，因此，Ca2+離子載體A23187 被認為是NETs 的半生理學(xué)模型，透射電鏡觀察A23187 處理的中性粒細胞，線粒體基質(zhì)腫脹，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，進一步發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)的NETs 由線粒體產(chǎn)生的ROS 介導(dǎo)［6］。AWASTHI 等［58］采用PMA和A23187分別作為NOX依賴和非依賴性NETs誘導(dǎo)劑，評估NETs形成的代謝需求，發(fā)現(xiàn)兩種誘導(dǎo)劑均導(dǎo)致細胞外酸化率、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性增加，丙酮酸激酶M2 因二聚化而活性降低，通過Warburg 效應(yīng)促進乳酸形成。有趣的是，外源性乳酸處理也誘導(dǎo)了人中性粒細胞NETs 形成，而LDH 活性的抑制顯著減少了這兩種途徑的NETosis，證明了乳酸和糖酵解在NETs形成中的作用以及揭示了NOX 依賴和非依賴NETs形成的共同代謝途徑。但隨后的研究觀察到的分子和動態(tài)差異證實其是生物學(xué)上不同過程的結(jié)果，LPS 和PMA 可誘導(dǎo)細胞早期Ca2+聚集，而使細胞內(nèi)鈣濃度升高，直至質(zhì)膜破裂［22］，但A23187 是由鈣激活的小電導(dǎo)鉀通道成員SK3 和線粒體ROS 介導(dǎo)的［59］。此 外，ATP 通 道pannexin1（Panx1）參 與 了A23187 及PMA 體外誘導(dǎo)的NETs 形成，且Panx1-/-小鼠分離的中性粒細胞表現(xiàn)出減少或延遲誘導(dǎo)的NETs產(chǎn)生［60］。

3 結(jié)語

自發(fā)現(xiàn)NETs 參與多種疾病的發(fā)生以來，諸多學(xué)者致力于研究其形成的分子機制，發(fā)現(xiàn)ROS、PAD4以及一些蛋白通路和代謝分子均調(diào)控了NETs形成，進而推動了與NETs 相關(guān)疾病的分子靶點藥物的研究。盡管近年來關(guān)于NETs 形成方面的研究取得了進展，但參與NETs 形成的關(guān)鍵物質(zhì)及其在患者體內(nèi)如何發(fā)揮作用尚未完全闡明。故對NETs的深入研究才能使人們更好地了解NETs 相關(guān)疾病進而在防治方面取得突破。盡管一些有希望的治療藥物正在研究中，但NETs 在宿主防御中過程起關(guān)鍵作用，故任何針對其形成的治療均需考慮避免損傷其生理功能。