紅景天苷調(diào)節(jié)CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺纖維化及JAK2/STAT3的活化①

虢 強(qiáng) 朱美意 張 杰 許 杰 郭友祥 （石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診外科，石河子 832008）

膿毒癥是指由感染引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征，常見(jiàn)于嚴(yán)重創(chuàng)傷、多發(fā)傷和外科手術(shù)后的患者，按嚴(yán)重程度可分為膿毒癥、嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥休克。據(jù)國(guó)外流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球膿毒癥病死率高達(dá)30%～70%，由于膿毒癥治療費(fèi)用昂貴，醫(yī)療資源消耗大，嚴(yán)重影響人類(lèi)生命健康和生活質(zhì)量［1-3］。目前，臨床上針對(duì)膿毒癥的治療方法主要有液體復(fù)蘇和抗生素治療等［4］。研究表明，膿毒癥發(fā)病機(jī)制與全身性炎癥反應(yīng)、免疫功能障礙、凝血功能異常、組織損傷及外來(lái)感染源相關(guān)，與多系統(tǒng)、多器官的病理生理改變緊密聯(lián)系，而肺臟是膿毒癥并發(fā)癥中損傷最嚴(yán)重的器官之一，膿毒癥發(fā)生時(shí)，大量炎癥因子和炎癥介質(zhì)的釋放和活化，導(dǎo)致機(jī)體抗炎和促炎因子失衡，免疫功能受損，從而促進(jìn)急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展過(guò)程［5-6］。紅景天苷是紅景天根的活性成分，具有抗衰老、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化等藥理作用。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)盲腸結(jié)扎穿孔（cecal ligation and perforation，CLP）誘導(dǎo)膿毒癥小鼠模型，探究紅景天苷對(duì)膿毒癥小鼠肺纖維化、炎癥和JAK2/STAT3磷酸化的影響，為紅景天苷在膿毒癥中的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物、試劑及儀器 紅景天苷（純度≥98%）購(gòu)自四川維克奇生物科技有限公司（CAS10338-51-9）；HE試劑盒、Masson試劑盒和ELISA試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、波形蛋白（Vimentin）、Ⅰ型膠原蛋白（Col Ⅰ）、IL-4、IL-6、IL-10、JAK2、STAT3和GAPDH兔單克隆單體及HRP標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀（上海塔望智能科技有限公司，PFT-MR）；光學(xué)顯微鏡（日本尼康，Eclipse E100）；脫色搖床（Servicebio，TSY-B）；掌上離心機(jī)（Servicebio，MX-F）；病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，RM2016）；組織攤片機(jī)（浙江金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；移液 槍?zhuān)―ragon，KE0003087/KA0056573）；酶 標(biāo) 儀（Rayto，RT-6100）；臺(tái)式高速離心機(jī)（DRAGONLAB，D3024R）。

1.1.2 動(dòng)物分組、建模及給藥 50只清潔級(jí)BALB/c小鼠（雄雌不限，體質(zhì)量20～25 g）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011，使用許可證號(hào)：SYXK（京）2017-0033。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：每只小鼠給予24 h 晝夜燈光照射控制及嚴(yán)格、規(guī)范的卡片登記管理，24 ℃條件下獨(dú)立飼養(yǎng)，建模前24 h 小鼠禁食不禁水。將小鼠分為健康對(duì)照組、模型組、模型+5 mg/kg紅景天苷組、模型+10 mg/kg 紅景天苷組、模型+20 mg/kg 紅景天苷組（n=10）。模型加藥組小鼠參照文獻(xiàn)［7］分別腹腔注射5、10、20 mg/kg 紅景天苷，1 h 后模型組和模型加藥組小鼠參照文獻(xiàn)［8］采用CLP 建立膿毒癥急性肺損傷小鼠模型，腹腔注射10%水合氯醛（20 mg/kg）麻醉小鼠，腹部消毒后正中開(kāi)腹，絲線結(jié)扎盲腸的根部，用無(wú)菌絲線結(jié)扎盲腸遠(yuǎn)端1.5～1.8 cm 處，用18 號(hào)無(wú)菌針頭在已經(jīng)結(jié)扎的盲腸遠(yuǎn)端中央處貫通穿刺，擠出少量?jī)?nèi)容物后將盲腸原位推回至腹腔并縫合切口，健康對(duì)照組只開(kāi)腹、關(guān)腹并復(fù)蘇，不進(jìn)行CLP。術(shù)后10 h取血并處死大鼠，收集小鼠肺組織，組織清洗后部分組織置于4%多聚甲醛中固定用于染色實(shí)驗(yàn)，剩余組織置于液氮中保存用于分子實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 肺功能檢測(cè) 取4%多聚甲醛固定的肺組織，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HE 染色。石蠟包埋組織并切片，組織切片厚4 μm，將切片清洗后浸入二甲苯和不同濃度梯度的乙醇溶液中30 min，用無(wú)水乙醇脫水處理。然后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，最后用二甲苯和乙醇進(jìn)行透明，中性樹(shù)脂封片，隨機(jī)選取10個(gè)視野在顯微鏡下觀察拍照，并記錄組織病理變化。胞核呈藍(lán)紫色，胞質(zhì)呈紅色。參照文獻(xiàn)［9］對(duì)各組小鼠進(jìn)行肺組織損傷評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)包括間質(zhì)水腫、肺泡水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡出血和肺泡結(jié)果完整性破壞等項(xiàng)目，0分：無(wú)肺損傷；0.25～2.5分；輕度或中度肺損傷：2.6～4 分：嚴(yán)重肺損傷，40 倍顯微鏡下，每組隨機(jī)選取10 個(gè)視野進(jìn)行肺損傷評(píng)分，結(jié)果取平均值，肺損傷評(píng)分越高表示損傷程度越嚴(yán)重。采用干濕重法測(cè)定各組小鼠肺組織濕干重比值（W/D），取小鼠右肺下葉用4%多聚甲醛固定后稱(chēng)取濕重，然后置于70 ℃烘箱中烘干72 h 后稱(chēng)取干重，計(jì)算肺組織W/D，利用動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)各組小鼠肺靜息通氣量。

1.2.2 Masson 染色觀察肺纖維化 取4%多聚甲醛固定的肺組織，石蠟包埋組織并切片，脫蠟水洗處理步驟同1.2.1，經(jīng)Masson染色后，用二甲苯和無(wú)水乙醇透明，中性樹(shù)脂封片，于顯微鏡下觀察拍照并記錄分析，胞質(zhì)、肌纖維、紅細(xì)胞和纖維素呈橙紅色，胞核呈藍(lán)褐色，膠原纖維被染成藍(lán)色。

1.2.3 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 液氮中取出肺組織，自然解凍后用手術(shù)剪將組織剪成組織小塊并置于研磨儀中研磨均勻。采用RIPA 蛋白裂解液于冰上提取組織總蛋白，4 ℃、12 000 r/min條件下離心15 min 后取上清，BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白總濃度，每孔上樣20 μg，經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后，加入一抗（1∶500），4 ℃搖床孵育過(guò)夜，次日回收一抗，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶10 000），室溫下?lián)u床孵育2 h 后，采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑于暗室下曝光顯影。將膠片整理去色并存檔，分別與GAPDH 蛋白灰度值比值計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次取平均值。

1.2.4 ELISA檢測(cè)炎癥因子含量 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定外周血中iNOS、IL-4、IL-6、IL-10含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0 軟件分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料表示為±s。多組數(shù)據(jù)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD 法，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅景天苷對(duì)膿毒癥小鼠肺功能的影響 HE染色觀察各組小鼠肺組織病理?yè)p傷程度，健康對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔清晰可見(jiàn)，肺泡間間隔無(wú)水腫和炎癥浸潤(rùn)。與健康對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，無(wú)完整的肺泡結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比，5 mg/kg紅景天苷組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化，10 mg/kg 和20 mg/kg 紅景天苷組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)趨于正常，可見(jiàn)完整的肺泡結(jié)構(gòu)，肺泡間質(zhì)僅見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。顯微鏡下隨機(jī)選取10 個(gè)視野對(duì)各組小鼠進(jìn)行肺組織病理?yè)p傷評(píng)分，結(jié)果取平均值，同時(shí)檢測(cè)肺功能指標(biāo)水平，與健康對(duì)照組相比，模型組小鼠肺損傷評(píng)分、肺組織W/D 顯著升高，肺靜息通氣量顯著減少（P<0.05）。與模型組相比，5 mg/kg紅景天苷組小鼠肺損傷評(píng)分、肺組織W/D 和肺靜息通氣量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），10 mg/kg 和20 mg/kg紅景天苷組小鼠肺損傷評(píng)分和肺組織W/D 降低，肺靜息通氣量增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖1。提示紅景天苷能夠改善CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺組織病理?yè)p傷。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色及肺功能檢測(cè)（HE，×400）Fig.1 HE staining and pulmonary function test of lung tissue of mice in each group（HE，×400）

2.2 紅景天苷對(duì)膿毒癥小鼠肺組織纖維化的影響 如圖2所示，健康對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)藍(lán)色的膠原纖維。與健康對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，可見(jiàn)大量藍(lán)色膠原纖維和組織損傷。與模型組相比，5 mg/kg紅景天苷組小鼠肺組織纖維化程度無(wú)明顯差異，10 mg/kg 和20 mg/kg紅景天苷組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，可見(jiàn)少量的藍(lán)色膠原纖維。提示紅景天苷可減輕CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺組織纖維化。

圖2 小鼠肺組織Masson染色圖（×400）Fig.2 Masson staining image of mice lung tissue（×400）

2.3 紅景天苷對(duì)膿毒癥小鼠肺組織纖維化蛋白水平的影響 與健康對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織中α-SMA、FN、Vimentin、ColⅠ蛋白水平均顯著上調(diào)（P<0.05）。與模型組相比，5 mg/kg紅景天苷組小鼠肺組織中α-SMA、FN、Vimentin 和ColⅠ蛋白水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），10 mg/kg和20 mg/kg紅景天苷組小鼠肺組織中α-SMA、FN、Vimentin 和ColⅠ蛋白水平均顯著下調(diào)（P<0.05），見(jiàn)圖3。提示紅景天苷能夠抑制CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺組織纖維化。

圖3 小鼠肺組織纖維標(biāo)志蛋白表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of fibrous marker proteins in mice lung tissue

2.4 紅景天苷對(duì)膿毒癥小鼠炎癥因子含量的影響 與健康對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織中誘導(dǎo)型iNOS、IL-6、IL-4 和IL-10 含量均顯著升高（P<0.05）。與模型組相比，5 mg/kg紅景天苷組小鼠炎癥因子水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），10 mg/kg 和20 mg/kg紅景天苷組小鼠肺組織中iNOS、IL-6 水平顯著降低，IL-4 和IL-10 水平顯著升高（P<0.05），見(jiàn)圖4。提示紅景天苷可能通過(guò)調(diào)節(jié)CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺組織炎癥因子水平緩解肺損傷。

圖4 小鼠肺組織炎癥因子水平Fig.4 Levels of inflammatory factors in mice lung tissue

2.5 紅景天苷對(duì)膿毒癥小鼠肺組織JAK2和STAT3磷酸化的影響 如圖5所示，與健康對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織中p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平顯著上調(diào)（P<0.05）。與模型組相比，5 mg/kg紅景天苷組小鼠肺組織中p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），10 mg/kg 和20 mg/kg 紅景天苷組小鼠肺組織中p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平均顯著下調(diào)（P<0.05）。提示紅景天苷可能通過(guò)JAK2/STAT3 信號(hào)通路調(diào)節(jié)CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺纖維化和炎癥。

圖5 小鼠肺組織p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)水平Fig.5 Protein expression levels of p-JAK2 and p-STAT3 in mice lung tissue

3 討論

研究表明，紅景天苷在急性肺損傷中具有保護(hù)作用，如紅景天苷通過(guò)上調(diào)SIRT1 表達(dá)抑制NF-κB和HMGB1 通路的活化，緩解CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠急性肺損傷和炎癥反應(yīng)［10］。紅景天苷通過(guò)調(diào)節(jié)肺上皮細(xì)胞中miRNA-146 外泌體的分泌抑制脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠炎癥反應(yīng)，還可通過(guò)抑制NF-κB 磷酸化保護(hù)急性肺損傷大鼠肺損傷等［11-12］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)紅景天苷給藥治療后，CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺損傷得到顯著改善，肺功能明顯好轉(zhuǎn)。提示紅景天苷在膿毒癥小鼠肺損傷中具有保護(hù)作用。

肺纖維化是指成纖維細(xì)胞增殖及大量細(xì)胞外基質(zhì)聚集并伴隨炎癥損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞等的一系列病理變化［13-14］。α-SMA 是肌成纖維細(xì)胞增殖、分化及膠原蛋白形成的標(biāo)志蛋白。FN 是細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白成分，是成纖維細(xì)胞的活化因子，與肺纖維化密切相關(guān)。Vimentin 是中間絲中的一種蛋白質(zhì)，為微管和肌動(dòng)蛋白提供彈性，是維持細(xì)胞骨架完整性的重要蛋白。ColⅠ是上皮細(xì)胞活化、膠原酶形成及骨結(jié)構(gòu)完整性的膠原蛋白。張翠影等［15］發(fā)現(xiàn)，α-SMA、FN、ColⅠ在急性肺損傷小鼠肺組織中的高表達(dá)與肺纖維化和肺損傷呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)紅景天苷治療后，膿毒癥小鼠肺纖維化程度明顯改善，α-SMA、FN、Vimentin和ColⅠ蛋白表達(dá)水平顯著降低，且20 mg/kg紅景天苷治療效果最佳，此結(jié)果與張翠影等［15］的研究結(jié)果相符，說(shuō)明紅景天苷對(duì)CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺纖維化具有抑制作用。

肺部炎癥和免疫功能障礙是膿毒癥小鼠肺功能損傷的主要因素，膿毒癥發(fā)生時(shí)，炎癥因子和免疫因子大量釋放，導(dǎo)致肺組織發(fā)生免疫失調(diào)和過(guò)度炎癥反應(yīng)，從而發(fā)生急性肺損傷［16］。iNOS、IL-4、IL-6、IL-10 是重要的炎癥和免疫調(diào)節(jié)因子，iNOS 和IL-6在炎癥反應(yīng)中促進(jìn)炎癥發(fā)生，而IL-4和IL-10是炎癥和免疫抑制因子［17-19］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)紅景天苷給藥治療后，膿毒癥小鼠肺組織中iNOS、IL-6 含量顯著降低，IL-4 和IL-10 含量顯著升高，結(jié)果提示紅景天苷通過(guò)調(diào)節(jié)CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺組織中炎癥因子水平緩解小鼠肺損傷。

為進(jìn)一步明確紅景天苷調(diào)節(jié)膿毒癥小鼠肺組織纖維化和炎癥的作用機(jī)制，課題組檢測(cè)了JAK2和STAT3的磷酸化水平，JAK2是非受體型酪氨酸蛋白激酶家族成員，STAT3 是信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子，JAK2/STAT3 信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化和免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用［20］。當(dāng)機(jī)體受外界炎癥因子刺激時(shí)，胞外信號(hào)蛋白與膜上受體結(jié)合并激活JAK2，活化的JAK2 使受體多位點(diǎn)酪氨酸殘基磷酸化，吸引STAT3 與受體結(jié)合并磷酸化，磷酸化的JAK2誘導(dǎo)p-STAT3二聚體化或異二聚體化，并從復(fù)合物上脫離易位至細(xì)胞核內(nèi)，與相應(yīng)的反應(yīng)元件結(jié)合，最后介導(dǎo)目的基因和炎癥因子的表達(dá)，炎癥因子又激活JAK2/STAT3 通路加重機(jī)體組織損傷［21］。王國(guó)全等［22］發(fā)現(xiàn)，膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織中高表達(dá)JAK2 和STAT3，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺組織中高表達(dá)p-JAK2 和p-STAT3，經(jīng)紅景天苷治療后，膿毒癥小鼠肺組織中p-JAK2 和p-STAT3 表達(dá)水平顯著降低。結(jié)合前期結(jié)果提示，紅景天苷通過(guò)下調(diào)JAK2 和STAT3 表達(dá)抑制CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺炎癥反應(yīng)。

綜上所述，紅景天苷對(duì)CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肺纖維化、炎癥具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路有關(guān)。