細(xì)粒棘球蚴通過STAT6促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化①

馮葉葉 許軍英 逯君霞 侯 雋 王良海 吳向未 陳雪玲 （石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，石河子 832002）

棘球蚴病是一種由棘球絳蟲屬絳蟲的幼蟲引起的人畜共患疾病，細(xì)粒棘球蚴（Echinococcus granu?losus）幼蟲引起的囊性棘球蚴病較為常見。中國(guó)西部是全球流行病最嚴(yán)重的地區(qū)之一，包括內(nèi)蒙古、四川、云南、西藏、陜西、甘肅、青海、寧夏、新疆和新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)等9 個(gè)省級(jí)行政區(qū)劃的370 個(gè)縣［1-2］。細(xì)粒棘球蚴的生命周期中主要包括中間宿主和終宿主，人類可以作為中間宿主，其臨床癥狀與靶器官的損傷或功能障礙有關(guān)。細(xì)粒棘球蚴的幼蟲階段主要居住在中間宿主的肝臟（70%）和肺部（20%），其余部分包括腦、脾、腎和心臟［3］。細(xì)粒棘球蚴幼蟲侵入實(shí)質(zhì)臟器后，發(fā)生免疫逃逸，形成囊腫［4］。囊腫破裂后會(huì)引起全身或局部過敏反應(yīng)，甚至死亡，治療復(fù)雜，對(duì)患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響［5］。盡管人們已經(jīng)對(duì)其進(jìn)行了廣泛地研究，然而，其相關(guān)分子機(jī)制仍不完全清楚。

巨噬細(xì)胞在不同條件下，根據(jù)其釋放的細(xì)胞因子、細(xì)胞表面標(biāo)志物等不同，分為兩種活化狀態(tài)：M1型經(jīng)典活化型和M2型替代活化型。M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子主要有CD86、TNF-α、IL-1β、IL-6 等，發(fā)揮清除細(xì)菌病毒、促進(jìn)炎癥等效應(yīng)。M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子主要包括CD206、IL-10、精氨酸酶1（argi?nase，ARG1）、IL-4、TGF-β等，從而發(fā)揮抑制炎癥、參與組織修復(fù)等效應(yīng)［6］。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子STAT 家族包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b 和STAT6［7］。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6（signal trans?ducer and activator of transcription 6，STAT6）在機(jī)體的各種生理病理過程中發(fā)揮重要作用，包括參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等［8］。STAT6 的激活是巨噬細(xì)胞發(fā)揮功能的關(guān)鍵信號(hào)通路，是M2 型巨噬細(xì)胞激活所必需的，IL-4 和IL-13 是M2 型巨噬細(xì)胞的關(guān)鍵因子，通過STAT6 發(fā)揮作用，誘導(dǎo)其磷酸化并促進(jìn)STAT6 參與基因的轉(zhuǎn)錄［9］。棘球蚴病作為一種感染性疾病，對(duì)于STAT6的表達(dá)研究尚未見報(bào)道。因此，本研究探討細(xì)粒棘球蚴感染是否可影響巨噬細(xì)胞向M2 型極化，進(jìn)一步采用STAT6 抑制劑探討STAT6 在細(xì)粒棘球蚴誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2 型極化中的作用，為進(jìn)一步研究治療囊性棘球蚴病的潛在分子靶標(biāo)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)粒棘球蚴囊液來源 細(xì)粒棘球蚴囊液（Echinococcus granulosuscyst fluid，EgCF）采集于新疆維吾爾自治區(qū)石河子市屠宰場(chǎng)病羊肝臟。

1.1.2 細(xì)胞來源 巨噬細(xì)胞系Raw264.7 購(gòu)自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。

1.1.3 主要儀器與試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基（貨號(hào)：C11995500BT）、特級(jí)胎牛血清FBS（貨號(hào)：04-001-A）、青鏈霉素（貨號(hào)：SV30010）、ACK 紅細(xì)胞裂解液（貨號(hào)：A1049201）、磷酸鹽緩沖液PBS（貨號(hào)：c20012500bt）購(gòu)自美國(guó)Life-Gibco 公司；二甲基亞砜DMSO（貨號(hào)：＃D8370）購(gòu)自北京索萊寶生物公司；總RNA 提取試劑盒（貨號(hào)：R6834-01）購(gòu)自美國(guó)Omega 生物技術(shù)公司；Nanodrop2000 購(gòu)自Thermo Fisher Scientific，USA；逆 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒（貨 號(hào)：K1622）購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；熒光染料SYBR Green Ⅱ（貨號(hào)：RR820A）購(gòu)自TaKaRa；PE anti-mouse CD206（貨號(hào)：85-12-2061-80）、PE antimouse TNF-α（貨號(hào)：12-7321-81）、Intracellular Fixa?tion/Permeabilization Buffer（貨 號(hào)：88-8824-00）、Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set（貨號(hào)：00-5523-00）、Cell Stimulation Cocktail（plus protein transport inh）（貨號(hào)：00-4975-93）購(gòu)自eBioscience 公司；重組Anti-STAT6 抗體（貨號(hào)：ab32520）購(gòu)自Abcam 公司；STAT6 抑制劑AS1517499（貨號(hào)：HY-100614）購(gòu)自美國(guó)MCE 生物科技公司；FITC 標(biāo)記山羊抗兔（貨號(hào)：ZF-0311）購(gòu)自北京中杉金橋公司；Mouse IL-6 ELISA Kit（貨號(hào)：70-EK2062/2）購(gòu)自聯(lián)科集團(tuán)有限公司。

逆轉(zhuǎn)錄儀器（TaKaRa，11007136）；熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad 公司，785BR11656）；流式細(xì)胞儀（安捷倫科技有限公司，45-2-2005-3352-1）；酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技有限公司，3001-2140）。

1.1.4 引物 根據(jù)Genebank 中小鼠β-actin、STAT6、CD206、IL-4、ARG1、TGF-β、TNF-α、IL-1β、IL-6 的基因序列，應(yīng)用Blast 進(jìn)行分析和比較，選取合適的區(qū)域合成引物，所有引物由上海生工生物工程公司合成（表1）。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers

1.2 方法

1.2.1 EgCF 的采集及制備 采用清水沖洗、乙醇消毒感染細(xì)粒棘球蚴病的新鮮羊肝臟，50 ml潔凈注射器抽取包囊中清澈無污染的單囊型包囊囊液，注入無菌容器，移入無菌操作臺(tái)，用0.22 μm濾菌器過濾囊液，分裝備用。

1.2.2 巨噬細(xì)胞系Raw264.7的培養(yǎng) 配制DMEM完全培養(yǎng)基（50 ml 離心管中加入1 ml 青鏈霉素、5 ml 特級(jí)胎牛血清FBS、44 ml DMEM 高糖培養(yǎng)基）。細(xì)胞以1×106個(gè)/孔鋪于6 孔板，并加入適量DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.3 STAT6 抑制劑使用濃度的配制 取20 μl STAT6 抑制劑原液（10 mmol/L），加入180 μl DMEM高糖培養(yǎng)基中充分溶解混勻，吸出20 μl再加入180 μl DMEM高糖培養(yǎng)基中充分溶解混勻，吸出20 μl再加入180 μl DMEM 高糖培養(yǎng)基中充分溶解混勻，即倍比稀釋1 000 倍，再分別取4.2 μl、20 μl 稀釋液加入DMEM 完全培養(yǎng)基與EgCF 混合液中，共2 ml，其最終濃度為21 nmol/L、100 nmol/L［10］。

1.2.4 EgCF 處理巨噬細(xì)胞 各孔加入1.75 ml DMEM 完全培養(yǎng)基。0 h 組：加入0.25 ml DMEM 完全培養(yǎng)基；24 h 組：加入0.25 ml EgCF。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，在24 h收集細(xì)胞（各設(shè)3個(gè)復(fù)孔）及細(xì)胞培養(yǎng)上清液備用［檢測(cè)細(xì)胞因子前6 h加入Cell Stimulation Cocktail（plus protein transport inh）］。

1.2.5 EgCF 與STAT6 抑制劑處理巨噬細(xì)胞0 nmol/L組：加入1.75 ml DMEM完全培養(yǎng)基、0.25 ml EgCF；21 nmol/L 和100 nmol/L 組：加 入0.25 ml EgCF，STAT6抑制劑AS1517499分別以21 nmol/L 和100 nmol/L 濃度加入，補(bǔ)充加入DMEM 完全培養(yǎng)基至2 ml；溶劑組：加入DMSO。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞備用。

1.2.6 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)STAT6、CD206、IL-4、ARG1、TGF-β、IL-6、TNF-α、IL-1β 的表達(dá) 使用總RNA 提取試劑盒提取巨噬細(xì)胞中的RNA，Nanodrop2000 檢測(cè)各組樣品濃度。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒在逆轉(zhuǎn)錄儀器中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（70 ℃5 min，4 ℃2 min）、擴(kuò)增（42 ℃60 min，70 ℃5 min，4 ℃∞）得到cDNA。使用熒光定量PCR 儀檢測(cè)，反應(yīng)體系總體積20 μl：cDNA 1.6 μl，正向引物0.8 μl，反向引物0.8 μl，熒光染料SYBR Green Ⅱ10 μl，ddH2O 6.8 μl；反應(yīng)條件：95 ℃30 s 預(yù)變性；95 ℃5 s 變性，60 ℃30 s退火/延伸，共39個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。結(jié)果用Bio-Rad CFX96 Manager進(jìn)行分析。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)STAT6、CD206、TNF-α 的表達(dá) 棄培養(yǎng)上清液，PBS 洗1遍，加入適量PBS，采用細(xì)胞刮輕柔刮掉細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 ml 離心管，2 000 r/min離心5 min，棄PBS，進(jìn)行如下處理。

細(xì)胞胞漿內(nèi)CD206、TNF-α 染色組處理：使用Intracellular Fixation/Permeabilization Buffer，每管加入100 μl PBS、200 μl IC Fixation Buffer 固定液固定細(xì)胞，室溫孵育30 min，2 000 r/min 離心5 min，棄上清；每 管 加 入1 ml 1×Permeabilization，室 溫 孵 育15 min，2 000 r/min 離心5 min，棄上清；逐管加入1×Permeabilization 配好的抗體PE anti-mouse CD206（1∶200）、PE anti-mouse TNF-α（1∶20），懸浮振蕩細(xì)胞，室溫避光孵育30 min；每管加入1 ml 1×Permea?bilization，2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入300 μl PBS懸浮振蕩細(xì)胞，在1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

細(xì)胞核內(nèi)STAT6 染色組處理：使用Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set，每 管 加 入100 μl PBS、200 μl Fixation/Permeabilization 固定液固定細(xì)胞，室溫避光孵育30 min，2 000 r/min 離心5 min，棄上清；每管加入1ml 1×Permeabilization，室溫孵育15 min，2 000 r/min 離心5 min，棄上清；逐管加入1×Permeabilization 配制好的抗體Anti-STAT6（1∶30），懸浮振蕩細(xì)胞，室溫避光孵育1 h；每管加入1 ml 1×Permeabilization，2 000 r/min 離心5 min，棄上清；逐管加入1×Permeabilization 配好的抗體FITClabeled goat anti-rabbit（1∶100），懸浮振蕩細(xì)胞，室溫避光孵育1 h；每管加入1 ml 1×Permeabilization，2 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入300 μl PBS 懸浮振蕩細(xì)胞，在1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.8 ELISA 檢測(cè)上清液中IL-6 的量 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，4 ℃、300 g 離心10 min 去除沉淀物，離心后的上清液直接用來檢測(cè)。參照Mouse IL-6 ELISA Kit 說明書，倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，第一排每孔按照稀釋后的濃度梯度依次加入100 μl；每個(gè)樣本孔加入100 μl細(xì)胞培養(yǎng)上清液，再向所有孔中加入50 μl稀釋的檢測(cè)抗體（1∶100），300 r/min 振蕩并于室溫孵育1.5 h。棄液體洗板6 次并甩干。每孔加100 μl稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素（1∶100），300 r/min 振蕩并于室溫孵育30 min。棄液體洗板6 次并甩干。每孔加入100 μl 顯色底物TMB，室溫避光孵育15 min左右（肉眼觀察第5孔有淡藍(lán)色，空白孔無藍(lán)色）。加入終止液終止反應(yīng)，30 min內(nèi)使用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（A450和A570），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算各樣品濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，3 組及以上組間的差異采用One-Way ANOVA 檢驗(yàn)，兩組間的差異采用t檢驗(yàn)，P<0.05 代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ns 代表差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EgCF 抑制M1 型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)為了研究細(xì)粒棘球蚴對(duì)巨噬細(xì)胞的影響，采用EgCF和巨噬細(xì)胞系Raw264.7 進(jìn)行體外研究，EgCF 的最終濃度為0.5 mg/ml。EgCF 處理巨噬細(xì)胞24 h，通過qRT-PCR 檢測(cè)M1 型巨噬細(xì)胞分泌的促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α 的mRNA 表達(dá)水平（圖1A～C），ELISA 檢測(cè)IL-6 蛋白表達(dá)水平（圖1D），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TNF-α蛋白表達(dá)水平（圖1E）。結(jié)果顯示：與0 h相比，EgCF 處理巨噬細(xì) 胞24 h 后，M1 型標(biāo)志物IL-6、IL-1β、TNF-α 的mRNA 和蛋白表達(dá)均下降（P<0.01）。

圖1 EgCF對(duì)M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)分子表達(dá)的影響Fig.1 Effect of EgCF on expressions of M1 polarization related molecules

2.2 EgCF 促進(jìn)M2 型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)qRT-PCR 檢測(cè)M2 型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD206 以及分泌的抑炎因子IL-4、ARG1、TGF-β 的mRNA 表達(dá)水平（圖2A～D），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD206 蛋白表達(dá)水平（圖2E）。結(jié)果顯示：與0 h 相比，EgCF 處理巨噬細(xì)胞24 h 后，M2 型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子CD206、IL-4、ARG1、TGF-β 的表達(dá)均上升（P<0.05）。提示EgCF可促進(jìn)巨噬細(xì)胞表型向M2型極化。

圖2 EgCF對(duì)M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)分子表達(dá)的影響Fig.2 Effect of EgCF on expressions of M2 polarization related molecules

2.3 EgCF 促進(jìn)Raw264.7 細(xì)胞中STAT6 的表達(dá)qRT-PCR 檢測(cè)巨噬細(xì)胞中STAT6 的mRNA 表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，STAT6表達(dá)呈升高趨勢(shì)（圖3A，P<0.01）；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞中STAT6 的蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其與mRNA 表達(dá)水平一致（圖3B，P<0.001）。提示EgCF可促進(jìn)巨噬細(xì)胞中STAT6表達(dá)。但EgCF是否通過促進(jìn)STAT6 的表達(dá)促使巨噬細(xì)胞向M2 型極化需進(jìn)一步研究。

圖3 EgCF對(duì)Raw264.7細(xì)胞中STAT6表達(dá)的影響Fig.3 Effect of EgCF on STAT6 expression in Raw264.7 cells

2.4 STAT6 抑制劑AS1517499 可有效抑制STAT6的表達(dá) 進(jìn)一步探討EgCF 是否通過STAT6 影響巨噬細(xì)胞的極化類型。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，STAT6抑制劑與EgCF處理巨噬細(xì)胞24 h后，加入21 nmol/L STAT6抑制劑組與DMSO 組相比STAT6的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4A，P>0.05），而加入100 nmol/L STAT6抑制劑組與DMSO 組相比STAT6表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4B，P<0.01）。qRT-PCR 結(jié)果顯示，100 nmol/L STAT6 抑制劑抑制了STAT6 的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4C，P<0.05）。提示100 nmol/L STAT6抑制劑可有效抑制STAT6表達(dá)。

圖4 STAT6 抑制劑對(duì)Raw264.7 細(xì)胞中STAT6 表達(dá)的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of STAT6 inhibitor on expression of STAT6 in Raw264.7 cells

2.5 STAT6抑制劑抑制M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá) 進(jìn)一步使用100 nmol/L STAT6 抑制劑與EgCF 處理巨噬細(xì)胞24 h，qRT-PCR 檢測(cè)M1 型和M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子CD206、TGF-β、IL-4 的表達(dá)被抑制（圖5A～C，P>0.05），而M1 型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子IL-6的表達(dá)被促進(jìn)（圖5D，P>0.05）。提示100 nmol/L STAT6 抑制劑可逆轉(zhuǎn)EgCF 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化類型轉(zhuǎn)變，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1 型極化、抑制其向M2型極化。

圖5 STAT6抑制劑對(duì)EgCF誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化的作用Fig.5 Effect of STAT6 inhibitor on EgCF induced macro?phage polarization

3 討論

棘球蚴病的常見受累器官為肝臟。在炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中，固有免疫是防御的第一道防線，是肝臟受到損傷刺激后首先發(fā)生的，巨噬細(xì)胞在固有免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用［11］。巨噬細(xì)胞極化是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的重要機(jī)制［12］。有文獻(xiàn)報(bào)道，肝臟浸潤(rùn)的M2 型巨噬細(xì)胞具有免疫抑制作用［13］。已有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)粒棘球蚴能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 型極化［14］。課題組猜測(cè)其可能與細(xì)粒棘球蚴發(fā)生免疫逃逸有關(guān)。

有研究發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子對(duì)巨噬細(xì)胞的極化起重要作用。CD11b+細(xì)胞中的STAT6 信號(hào)通過促進(jìn)IL-4 分泌，并增加M2 型巨噬細(xì)胞促進(jìn)肺癌進(jìn)展［15］。敲除STAT6 能夠阻止M2 型巨噬細(xì)胞的極化和葉酸腎病中單核細(xì)胞向成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，從而減緩腎纖維化進(jìn)程［16］。STAT6 能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2 型極化以抑制動(dòng)脈粥樣硬化[17]。但在細(xì)粒棘球蚴上未見相關(guān)研究。因此，課題組在體外研究了感染細(xì)粒棘球蚴時(shí)STAT6 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化。研究證實(shí)STAT6抑制劑可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化。

本實(shí)驗(yàn)中EgCF處理巨噬細(xì)胞24 h后，STAT6和M2 型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子IL-4、ARG1、TGF-β 表達(dá)水平升高，同時(shí)M1 型巨噬細(xì)胞相關(guān)因子IL-6、IL-1β、TNF-α 表達(dá)水平降低。使用STAT6抑制劑后，M1型相關(guān)因子的表達(dá)水平均被提升，M2型相關(guān)因子的表達(dá)水平均被抑制。提示在細(xì)粒棘球蚴感染中STAT6可促進(jìn)巨噬細(xì)胞表型向M2型極化。

綜上所述，課題組猜測(cè)細(xì)粒棘球蚴促進(jìn)STAT6表達(dá)，使巨噬細(xì)胞向抑炎的M2 型極化，因此課題組采用STAT6 抑制劑抑制了STAT6 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其可減少EgCF 誘導(dǎo)的M2 極化，可能對(duì)逆轉(zhuǎn)EgCF 的免疫逃逸具有重要作用。本研究也揭示了STAT6 可能作為治療細(xì)粒棘球蚴感染的一個(gè)新靶點(diǎn)。