亞致死劑量的丁硫克百威和阿維菌素對柑橘大實蠅成蟲生長發(fā)育的影響

劉文茹，何章章，桂連友，石永芳，周仁迪，楊 璇，姜振宇，張國輝

（湖北省農(nóng)林病蟲害預(yù)警與調(diào)控工程技術(shù)研究中心/長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

柑橘大實蠅（Bactrocera minax）是主要分布于中國的柑橘類重要害蟲，也是對外檢疫對象之一［1］。該害蟲在湖北省一般1 年發(fā)生1 代，目前的防治策略主要包括農(nóng)業(yè)防治（收集落果裝袋悶死）、生物防治（引誘劑和誘蠅球誘集）和化學(xué)防治（噴施誘殺劑）等［2，3］。殺蟲劑施于田間后，其在環(huán)境中的毒力會隨著時間推移和狀態(tài)的改變逐漸遞減到亞致死劑量［4］。亞致死劑量殺蟲劑對昆蟲發(fā)育歷期、繁殖和子代都有很大的影響［5］。Yin 等［6］研究表明多殺菌素對小菜蛾（Plutella xylostella）亞致死效應(yīng)表現(xiàn)為隨著處理劑量的增加，幼蟲的發(fā)育歷期顯著延長。王建軍等［7］研究表明斜紋夜蛾（Spodoptera litura）3齡幼蟲經(jīng)茚蟲威LC15濃度處理后，成蟲壽命和單雌產(chǎn)卵量都明顯低于對照。歐善生等［8］報道了在LC10至LC50劑量范圍內(nèi)，氯蟲苯甲酰胺處理棉鈴蟲［Helicoverpa armigera（Hübner）］3 齡幼蟲的亞致死劑量越高，其生長發(fā)育受抑制越顯著。

阿維菌素和丁硫克百威是生產(chǎn)中防治柑橘大實蠅的2 種常用殺蟲劑［9，10］。劉雄［9］研究表明果瑞特（主要成分為0.1% 阿維菌素餌劑）防治柑橘大實蠅的效果較理想。莫廷詩等［11］試驗表明果瑞特（主要成分為0.1%阿維菌素餌劑）對柑橘大實蠅的防治效果顯著。石永芳等［12，13］報道了丁硫克百威和阿維菌素對柑橘大實蠅的室內(nèi)毒力測定結(jié)果及其對柑橘大實蠅選擇行為的影響及擊倒作用。楊璇等［14］報道了丁硫克百威和阿維菌素對柑橘大實蠅成蟲運(yùn)動行為的亞致死效應(yīng)，但亞致死劑量的阿維菌素和丁硫克百威對柑橘大實蠅成蟲的生長發(fā)育影響鮮見報道。因此，本研究通過飼養(yǎng)法和解剖法，研究LC10阿維菌素和LC10丁硫克百威對柑橘大實蠅雌雄蟲存活率、雌成蟲卵巢等級以及42 日齡雌成蟲的腹部指數(shù)、卵巢指數(shù)和卵粒長度的影響，為該蟲的預(yù)防和控制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源 2017 年10 月于湖北省松滋市陳店鎮(zhèn)（30°18′N，111°77′E）在未采取防控措施的柑橘園采集柑橘大實蠅幼蟲，并置于長江大學(xué)昆蟲生態(tài)學(xué)實驗室內(nèi)飼養(yǎng)。待其化蛹后，分期分批收集蛹轉(zhuǎn)移到盛有河沙（厚度5～7 cm）的塑料盆內(nèi)（直徑17 cm，高11 cm），保持土壤濕度20%左右。收集羽化后的成蟲置于養(yǎng)蟲籠（長、寬及高均為35 cm）中，飼以酵母菌浸粉、蔗糖和去離子水（質(zhì)量比1∶3∶30）混勻的營養(yǎng)液。選取羽化后5 日齡的成蟲用于試驗。

1.1.2 供試藥劑和試劑 丁硫克百威原藥（有效成分96.0%，江蘇常隆化工有限公司）、阿維菌素原藥（有效成分95.4%，山東濰坊潤豐化工股份有限公司）、丙酮（分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司），吐溫-80（化學(xué)純，上海滬試實驗室器材股份有限公司）和考馬斯亮藍(lán)（上海染料研究所有限公司）。

養(yǎng)蟲瓶的制作：將1 只有蓋塑料瓶（瓶口為圓形，瓶身為立方體，長10 cm、寬10 cm 和高15 cm，河南省長葛市常宏蜂具加工廠）的瓶底剪掉，用紗網(wǎng)（網(wǎng)孔直徑為2 mm）封住剪去的瓶底，并用橡皮筋固定紗網(wǎng)。飼養(yǎng)時瓶口向下。

1.2 方法

1.2.1 藥劑濃度和測試前處理 基于長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院昆蟲生態(tài)學(xué)實驗室前期室內(nèi)毒力測定的結(jié)果配制藥液，具體操作步驟如下：先將稱量后的96.0%丁硫克百威原藥和95.4%阿維菌素原藥用1～2 mL 丙酮和吐溫-80 完全溶解后，再加入一定量的蔗糖和1%考馬斯亮藍(lán)染液，最后用去離子水稀釋至對應(yīng)濃度，即丁硫克百威15.66 mg/L（LC10）、阿維菌素2.04 mg/L（LC10）、正常（CK）0 mg/L（LC0），并確保各濃度藥劑中蔗糖和考馬斯亮藍(lán)含量分別為10%、0.5%［15］。

將待測藥液浸漬30 s 后的濾紙片（2 cm×2 cm）置于培養(yǎng)皿（直徑9.0 cm、高1.8 cm）中，將饑餓24 h后的柑橘大實蠅成蟲（6 日齡）放于濾紙片邊緣，待其取食20 s 后，接著將成蟲按性別分類分別轉(zhuǎn)移到改造的塑料養(yǎng)蟲瓶中，最后將塑料瓶置于溫度（25±1）℃、相對濕度（65±5）%、光周期L∶D=14 h∶10 h 的智能人工氣候箱（RXZ 型，寧波江南儀器廠）中保存，以供測試。供試實蠅成蟲是否正常取食，可通過觀察其腹部是否呈亮藍(lán)色來判定，如果成蟲腹部不出現(xiàn)亮藍(lán)色，則該成蟲不進(jìn)入下一步試驗。

1.2.2 柑橘大實蠅成蟲飼養(yǎng) 試驗在長江大學(xué)昆蟲生態(tài)學(xué)實驗室進(jìn)行，溫度（25±2）℃，相對濕度（65±5）%，自然光照。飼養(yǎng)方法參照He 等［16］的方法，并進(jìn)行少許修改。取亞致死濃度藥劑處理后（包含正常）1 h 的成蟲，每4 頭同樣性別的成蟲為1 組，每組置于1 只自制的塑料瓶中飼養(yǎng)，每瓶為1 個處理。飼以酵母菌浸粉、蔗糖和去離子水（質(zhì)量比1∶3∶30）混勻的營養(yǎng)液。每天9：00 更換食物1 次，為了避免食物污染，3 d 更換1 次飼養(yǎng)瓶。使用注射器將自來水噴在瓶子頂部紗網(wǎng)外側(cè)的雙層濕潤餐巾紙（長2 cm，寬5 cm）上，每天早晚各供1 次水。

①正常飼養(yǎng)（CK）。雌成蟲重復(fù)18 次，雄成蟲重復(fù)15 次，供試成蟲共132 頭；②阿維菌素處理。雌成蟲重復(fù)21 次，雄成蟲重復(fù)16 次，供試成蟲共148頭；③丁硫克百威處理。雌蟲共重復(fù)21 次，雄蟲共重復(fù)15 次，供試成蟲共144 頭。

在3 種方法飼養(yǎng)過程中，每天9：00 記錄柑橘大實蠅成蟲死亡情況，并收集死蟲，其中死亡的雌成蟲轉(zhuǎn)移到2 mL 離心管中，每只離心管裝1 頭成蟲，貼上標(biāo)簽，再置于-4 ℃冰箱中，供當(dāng)天確定卵巢級別的解剖使用。在3 種方法飼養(yǎng)結(jié)束時，使用上述同樣保持方法，將收回的所有活體雌成蟲（42 日齡）保存。供測定其卵巢發(fā)育級別、腹部指數(shù)、卵巢指數(shù)和卵粒長度使用。

1.2.3 雌成蟲卵巢發(fā)育級別時間動態(tài) 在體視顯微鏡（DMDZM 型，寧波舜宇儀器有限公司）下，將每天收集的雌成蟲整個腹部剪下，放入已加有少量清水的蠟盤中，用昆蟲針固定住其腹部的一邊，用解剖針清除整個腹部的表皮，直到露出卵巢，判斷和記錄其卵巢發(fā)育級別［15］。

1.2.4 雌成蟲腹部和卵巢發(fā)育差異性 雌成蟲的卵巢發(fā)育級別、腹部指數(shù)、卵巢指數(shù)和卵粒長度測定參照文獻(xiàn)［16］進(jìn)行。在徠卡體視顯微鏡（Leica，M205A 型）下，首先將柑橘大實蠅成蟲的整個腹部一起剪下并放入已加有少量清水的蠟盤中，然后測量和記錄其腹部指數(shù)（正面長度×腹部正面寬度×腹部側(cè)面寬度），接著用昆蟲針固定住柑橘大實蠅成蟲腹部的一邊，用解剖針清除整個腹部的表皮，直到露出卵巢，判斷和記錄其卵巢發(fā)育等級，最后測量和記錄其卵巢指數(shù)（卵巢長度×卵巢寬度）和卵粒長度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用DPS 統(tǒng)計軟件處理［17］。采用配對兩處理t檢驗比較3 種飼養(yǎng)方法（正常、LC10阿維菌素和LC10丁硫克百威）中的不同性別之間和不同飼養(yǎng)方法之間的柑橘大實蠅成蟲平均存活率差異，以及采用完全隨機(jī)單因子方差分析在3 種飼養(yǎng)方法中柑橘大實蠅雌蟲的腹部指數(shù)、卵巢指數(shù)和卵粒長度之間的差異，其平均值差異采用Tukey 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藥劑處理對柑橘大實蠅成蟲平均存活率的影響

結(jié)果表明，在正常條件下雌、雄成蟲存活率分別為（54.95 ± 4.28）%、（61.59 ± 3.58）%，LC10阿維菌素處理后雌、雄成蟲存活率分別為（42.43 ± 3.70）%、（47.43 ± 2.93）%，LC10丁硫克百威處理后雌、雄成蟲存活率分別為（46.89± 3.83）%、（52.19± 3.23）%。3種處理中，每種處理的柑橘大實蠅雌成蟲的平均存活率均極顯著低于雄成蟲（圖1）。在3 種飼養(yǎng)方法之間，柑橘大實蠅成蟲平均存活率均存在極顯著差異，其平均存活率高低表現(xiàn)為正常＞丁硫克百威＞阿維菌素（圖1）。但在3 種飼養(yǎng)方法之間，柑橘大實蠅雌、雄成蟲平均存活率變化趨勢均相似（圖2）。

圖1 三種飼養(yǎng)方法下柑橘大實蠅雄蟲（1）、雌蟲（2）及雌雄之間（3）的平均存活率差異

圖2 三種飼養(yǎng)方法下柑橘大實蠅成蟲平均存活率的時間動態(tài)

2.2 柑橘大實蠅的雌成蟲卵巢發(fā)育級別時間動態(tài)

結(jié)果（圖3）表明，在正常飼養(yǎng)和LC10阿維菌素、LC10丁硫克百威處理后飼養(yǎng)中，死亡的柑橘大實蠅雌成蟲4 級卵巢出現(xiàn)最早時間分別是20 日齡、24 日齡和19 日齡，4 級卵巢出現(xiàn)最遲時間均是42 日齡；其卵巢均達(dá)到了4 級或4 級以上的時間分別是在29日齡、31 日齡和30 日齡。

圖3 三種飼養(yǎng)方法下柑橘大實蠅死亡（左）和存活（右）雌成蟲的卵巢級別

在正常飼養(yǎng)和LC10阿維菌素、LC10丁硫克百威處理后飼養(yǎng)中，飼養(yǎng)36 d 后收回的柑橘大實蠅活雌蟲中，其卵巢均達(dá)4 級或5 級；42 日齡中卵巢達(dá)4 級和5 級的比例分別為66.67%和33.33%、45.45%和54.55%、92.86%和7.14%。

2.3 柑橘大實蠅的雌成蟲腹部和卵巢發(fā)育差異性

結(jié)果（圖4）表明，在正常飼養(yǎng)和LC10阿維菌素、LC10丁硫克百威處理后飼養(yǎng)中，飼養(yǎng)回收的柑橘大實蠅活的雌蟲（42 日齡）中，就腹部指數(shù)而言，正常飼養(yǎng)為57.77±7.44，阿維菌素為54.03±2.85，丁硫克百威為65.72±4.04，3 種方法之間無顯著差異；就卵巢指數(shù)而言，正常飼養(yǎng)為10.66±1.38，阿維菌素為8.88±0.53，丁硫克百威為10.47±1.00，3 種方法之間無顯著差異；就卵粒長度而言，正常飼養(yǎng)為（1.77±0.04）mm，阿維菌素為（1.67 ± 0.02）mm，丁硫克百威為（1.71±0.03）mm，3 種方法之間無顯著差異。

圖4 三種飼養(yǎng)方法下柑橘大實蠅活的雌蟲（42 日齡）的腹部指數(shù)、卵巢指數(shù)和卵粒長度的比較

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果表明，與正常對照組（CK）相比，LC10阿維菌素和LC10丁硫克百威處理后，柑橘大實蠅雌、雄成蟲的平均存活率分別極顯著降低了12.52 個百分點(diǎn)和14.16 個百分點(diǎn)、8.06 個百分點(diǎn)和9.40 個百分點(diǎn)。梁立成［5］研究表明，與對照相比，LC10阿維菌素處理稻縱卷葉螟卵后，其當(dāng)代幼蟲存活率顯著降低了13.98%。王小強(qiáng)等［18］研究認(rèn)為LC10阿維菌素處理F1代綠色型豌豆蚜10 d 后，其存活率明顯低于對照。以上研究結(jié)果與本研究結(jié)果類似。李海強(qiáng)等［19］研究認(rèn)為綠盲蝽經(jīng)LC10丁硫克百威處理24 h后，存活率與對照差異不明顯。本研究結(jié)果也表明，LC10阿維菌素處理后的柑橘大實蠅雌、雄成蟲平均存活率均極顯著低于LC10丁硫克百威處理后的柑橘大實蠅雌、雄成蟲平均存活率。本研究結(jié)果與石永芳等［13］研究LC50阿維菌素對柑橘大實蠅雌、雄成蟲的毒力分別高于LC50丁硫克百威的結(jié)果類似。本研究結(jié)果還表明，LC10阿維菌素和LC10丁硫克百威處理后的柑橘大實蠅雌蟲平均存活率分別極顯著低于其雄蟲平均存活率5.00 個百分點(diǎn)和5.30 個百分點(diǎn)。石永芳等［13］研究認(rèn)為LC10阿維菌素和LC10丁硫克百威處理的柑橘大實蠅雌、雄成蟲之間的毒力差異不顯著，這可能與亞致死劑量存在差異有關(guān)。

產(chǎn)生亞致死效應(yīng)與丁硫克百威和阿維菌素這2種農(nóng)藥作用機(jī)理有關(guān)。阿維菌素干擾昆蟲的神經(jīng)生理活動，刺激昆蟲釋放更多的抑制神經(jīng)傳導(dǎo)信號的γ-氨基丁酸（Gamma-amino-butyricacid，GABA），使昆蟲產(chǎn)生長時間的高強(qiáng)度神經(jīng)抑制效應(yīng)，導(dǎo)致其麻痹甚至死亡［14，20］。阿維菌素對昆蟲和螨類具有觸殺和胃毒作用［21］。丁硫克百威抑制昆蟲乙酰膽堿酶的活性，造成昆蟲體內(nèi)乙酰膽堿的積累，從而影響正常的神經(jīng)傳導(dǎo)，最終達(dá)到殺蟲目的［14，22］。

劉穎等［15］認(rèn)為處于23～33 日齡的柑橘大實蠅雌蟲卵巢達(dá)4 級，33～45 日齡的卵巢達(dá)5 級，4 級和5 級的成蟲已達(dá)到性成熟，4 級為產(chǎn)卵盛期，5 級為產(chǎn)卵末期。He 等［16］研究認(rèn)為在27～39 日齡，野外板栗雄花花序套袋飼養(yǎng)的柑橘大實蠅雌蟲腹部指數(shù)、卵巢指數(shù)以及卵的長度均極顯著低于正常對照（酵母菌浸粉∶蔗糖1∶3）的腹部指數(shù)、卵巢指數(shù)以及卵的長度；其套袋飼養(yǎng)死亡和活體的柑橘大實蠅的雌成蟲3 級和3 級以上的卵巢發(fā)育級別比例均明顯低于正常飼養(yǎng)，產(chǎn)生這些差異與營養(yǎng)有關(guān)。有研究表明阿維菌素類似物MK-243（4″-epi-methylamino-4″-deoxyavermectin B1）抑制硬蜱（Ambtyomma hebraeumKoch）的卵巢成熟和卵黃發(fā)生［23］。本試驗結(jié)果表明，LC10阿維菌素促進(jìn)了柑橘大實蠅雌蟲的性成熟，在正常飼養(yǎng)和LC10阿維菌素、LC10丁硫克百威處理后飼養(yǎng)，飼養(yǎng)36 d 后收回的柑橘大實蠅活雌蟲中，其卵巢均達(dá)4 級和5 級，其比例分別為66.67% 和33.33%、45.45%和54.55%、92.86%和7.14%。表明LC10阿維菌素刺激了其雌成蟲的性成熟，LC10丁硫克百威抑制了其雌成蟲的性成熟，但在其腹部指數(shù)、卵巢指數(shù)和卵粒長度之間均無顯著差異。

綜上所述，亞致死劑量的阿維菌素和丁硫克百威影響了柑橘大實蠅成蟲的存活率與性成熟時間，但其體內(nèi)物質(zhì)代謝變化及其分子機(jī)理還需深入研究。