異染色質相關蛋白TRIM28調控鋅指蛋白和原鈣黏蛋白家族基因的轉錄

張翔宇 卜佳晨

（中國科學院生物物理研究所，生物大分子國家重點實驗室，北京 100101）

TRIM28 （TRIpartate motif?containing protein 28），又稱為KAP1（KRAB?associated protein1）或者TIF1β（transcription intermediary factor 1β），它由N 端的RBCC 區(qū)域和C 端的PHD、BROMO 和NHD等結構域組成［1］。既往研究發(fā)現(xiàn)，TRIM28具有E3 活性，通過SUMO 通路招募SETDB1 和HP1等異染色質相關因子，在靶基因上建立H3K9me3修飾，抑制基因的轉錄［2］。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，TRIM28 通過調控RNA 聚合酶II 在Hspa1b 等 基 因啟動子區(qū)域的轉錄延伸活性調控基因的表達［3］。

為了更深入地研究TRIM28的功能，本文通過建立Trim28 基因敲除細胞系，發(fā)現(xiàn)Trim28 主要抑制內源表達量較低基因的轉錄，進一步分析發(fā)現(xiàn)Trim28抑制鋅指蛋白家族基因和原鈣黏蛋白β家族基因的轉錄，ChIP?seq 數(shù)據(jù)證明TRIM28 通過影響染色質高級結構的改變調控鋅指蛋白家族基因和原鈣黏蛋白β家族基因的轉錄。

原鈣黏蛋白家族基因（protocadherin，PCDH）分為PCDHα、PCDHβ和PCDHγ 3個類別，在神經(jīng)細胞中具有較高的表達水平。原鈣黏蛋白對神經(jīng)元突觸的發(fā)育具有重要作用，能夠影響神經(jīng)細胞對“自我”和“非我”身份識別過程［4］。已有文章報道，染色質高級結構的改變能夠影響原鈣黏蛋白家族基因的表達［5?6］，但是對于特定的激活PCDHα基因、PCDHβ基因或者PCDHγ基因的轉錄活性機制并不清楚。

本文通過生物組學的方法首次發(fā)現(xiàn)了TRIM28與原鈣黏蛋白家族基因轉錄調控之間的關系，并證明了兩者之間的聯(lián)系，對于TRIM28的分子機理的進一步的研究提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 Trim28基因敲除細胞系和Trim28回補細胞系的構建

根據(jù)實驗室之前設計向導RNA（gRNA）的方法［7?9］，設計靶向Trim28基因第一個外顯子起始密碼子下游的兩對小向導RNA（sgRNA），gRNAF1：5'?caccgggcctccgcggcggcagcct?3'和gRNAR1：5'?aaa?caggctgccgccgcggaggccc?3'；gRNAF2：5'?caccggcg?acccgagagggagcccc?3'和gRNAR2：5'?aaacggggctccc?tctcgggtcgcc?3'。 將 經(jīng) 過 退 火 的 引 物 連 接 到pLentiCas9V2質粒上，原核培養(yǎng)提取質粒。根據(jù)轉染試劑Vigofect 說明書轉染質粒至HEK293F 細胞中，96 孔板分單克隆。使用DNA 提取液快速提取細胞DNA，DNA 提取液成分是：100 mmol/L Tris?HCl、500 mmol/L KCl、0.01% 明 膠、0.45%NP?40、0.45%吐溫。設計引物檢測陽性克隆，引物序列是Test F：5'?agttggccgtgccgtagcagcgtcc?3'和Test R：5'?gccctaagcaggcactacaggccg?3'。PCR 產(chǎn) 物送測序公司測序，測序結果和野生型相比較，有DNA序列的突變即是陽性克隆。

利用pCMV?cTrim28?mCherry 載體和轉座子轉染體系，在Trim28 基因敲除細胞系中共轉Piggyback 轉座酶表達載體，轉座酶可促使pCMV?cTrim28-mCherry 上相應Trim28cDNA 片段整合到轉染的細胞基因組中，轉座成功的細胞，通過CMV 啟動子表達mCherry 熒光，使用流式細胞分選儀分選出對應的細胞。

1.2 mRNA反轉錄與實時熒光定量PCR

根據(jù)說明書推薦的使用方法，用TRIzol?裂解液（ThermoFisher，15596?026）裂解細胞提取RNA，NanoDrop 2000C 分光光度計（Thermo Scientific 公司）測定RNA 濃度，采用HiScript?II RT SuperMix for qPCR試劑盒（南京諾唯贊生物公司，R122?01）的操作步驟，大約1～2 μg RNA 作為模板，反轉錄完成后稀釋10 倍。PCR 反應體系是：10 μl 2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物公司，Q712?02），0.4 μl 10 mmol/L引物，5 μl cDNA模板，4.2 μl dd H2O。在7500 Fast Real?Time PCR System（ABI 公司）儀器上按照預變性95℃30 s，循環(huán)反應95℃10 s，60℃30 s，40周期，溶解曲線95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s 設定程序，進行熒光定量PCR反應。引物序列見表1。

Table 1 Primers for real-time quantitative PCR

1.3 免疫印跡

根據(jù)細胞的數(shù)量加入適量的細胞裂解液和蛋白酶抑制劑混勻后充分裂解細胞，細胞裂解液成分是：100 mmol/L Tris?HCl pH 6.8，4% SDS，20%甘油，200 mmol/L DTT，0.2%溴酚藍。利用蛋白質濃度檢測試劑盒（碧云天公司，P0012S）測出各個樣品濃度，將樣品調至相同濃度，20 mA電泳1.5～2 h，250 mA 轉PVDF 膜，一 抗 過 夜 孵 育，TBST洗膜3次，每次15 min，二抗孵育1 h，加顯影液（Millipore 公司），利用X光片（Kodak公司）經(jīng)過洗片機（102型，Kodak公司）處理后顯影。

1.4 細胞超聲和染色質免疫共沉淀

細胞超聲和染色質免疫共沉淀所需要的試劑及配制方法參考文獻［9］配制。取適量細胞，向培養(yǎng)基中加入37%甲醇溶液至終濃度為1%，室溫孵育10 min， 加入2 mol/L 甘氨酸至終濃度為0.125 mol/L，室溫孵育10 min，終止交聯(lián)。用冷的PBS 溶液清洗細胞3 遍，加入適量裂解緩沖液1（140 mmol/L NaCl，50 mmol/L HEPES pH 7.9，1 mmol/L EDTA， 0.5% NP?40， 0.25% Trition?X100，10%甘油），冰上孵育10 min，離心；加 入 適 量 裂 解 緩 沖 液2 （10 mmol/L Tris?HCl pH 7.9， 200 mmol/L NaCl， 1 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L EGTA），冰上孵育10 min；用裂解緩沖液3 （10 mmol/L Tris?HCl pH 7.9， 100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L EGTA，0.1%脫氧膽酸鈉，0.5%月桂?；被幔┲貞?。用Covaris M220超聲儀進行細胞超聲30 min。取適量染色質加入適量抗體，4℃搖床結合過夜。取適量protein A 或 者protein G Dynabeads （Invitrogen，10002D），用裂解緩沖液（50 mmol/L HEPES pH 7.9，150 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA，1%Triton X?100，0.5%脫氧膽酸鈉）重懸。4℃搖床孵育1～2 h。依次用高鹽緩沖液（50 mmol/L HEPES pH 7.9，500 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA，1%Triton X?100，0.5%脫氧膽酸鈉）、LiCl 緩沖液（10 mmol/L Tris?HCl pH 7.9，250 mmol/L LiCl，2 mmol/L EDTA，N0.5%P?40，0.5%脫氧膽酸鈉）、TE 緩沖液（10 mmol/L Tris?HCl pH 7.9，2 mmol/L EDTA）沖洗Dynabeads，再用洗脫液（0.1%十二烷基磺酸鈉，10 mmol/L NaHCO3）重懸，60℃振蕩孵育1 h，解交聯(lián)保存，用KAPA Hyper Prep Kit（KAPA biosystems，KK8504）建ChIP?seq庫。

1.5 DNA文庫構建

根據(jù)KAPA Hyper Prep Kit 推薦的使用方法［10］分為末端修復和末端加“A”、連接“Y”形接頭、片段純化及片段大小篩選、PCR 擴增、純化DNA片段、DNA PAGE膠檢測文庫質量步驟。文庫構建完成，公司測序，ChIP?seq文庫采用雙端測序獲得數(shù)據(jù)。

1.6 Surveyor 實驗

Surveyor 核酸內切酶對于DNA 雙鏈中的堿基錯配情況具有很強的特異識別能力，在含有錯配的DNA 雙鏈經(jīng)過Surveyor 核酸酶處理后，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)出兩條大小不同的條帶，當基因組被gRNA 在特異位點編輯后，擴增該區(qū)域經(jīng)解鏈?退火步驟則會在重新隨機退火后新的DNA 雙鏈中形成堿基錯配現(xiàn)象，用Surveyor核酸內切酶處理退火后的產(chǎn)物可以對Cas9蛋白的切割效率作出評估。

在Trim28 基因組的第一個外顯子上下游600 bp 設 計 引 物SUVRYOR?F：5'?cagcagttggcgg?cgagcgcgtct?3' 和SUVRYOR?R： 5'?tcctctcgcccagg?tggcatcctcat?3'。 使 用 常 規(guī)PCR 擴 增 方 法 和JumpStartTMTaq Ready Mix（Sigma 公司）分別在WT、gRNA1+gRNA2 pool、gRNA3+gRNA4 pool基因組DNA 樣品中擴增目的條帶，設計退火程序：-0.3℃/s，從95℃退火至25℃，使用Surveyor?Mutation Detection Kits （Integrated DNA Technologies公司）加入0.5 μl Surveyor Enhancer S和Surveyor Nuclease S，放于42℃水浴鍋孵育30 min，利用瓊脂糖凝膠電泳評估gRNA 切割效果。

1.7 生物信息學分析

野生型和基因敲除型RNA?seq樣品各有3個生物學重復，生物信息學分析的標準化參數(shù)在每個IGV 示意圖的左上部分。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過FastQC［11］檢驗后，經(jīng)過Trimmol/Lomatic［12］軟件處理去掉接頭及低質量序列。RNA?seq 數(shù)據(jù)通過Tophat［13］軟件比對到人hg38 基因組，ChIP?seq 數(shù)據(jù)通過Bowtie2［14］軟 件比 對 到 人hg38 基 因 組。Htseq?count［15］軟件用來計算RNA?seq數(shù)據(jù)中各樣品比對上的序列數(shù)目，DESeq2［16］和R用來計算差異表達基因和基因的RPKM（reads kilobases per million reads） 值。差異表達倍數(shù)2 倍以上并且padj（p?adjusted）＜0.05 的基因被定義為顯著上調或下調的差異基因。ChIP?seq數(shù)據(jù)比對后，取唯一比對的序列，并且去掉冗余的序列進行后續(xù)的分析。IGV［17］軟件用來數(shù)據(jù)的可視化，MACS2［18］軟件進行數(shù)據(jù)峰值計算。文中熱圖（Heatmap）及線圖通過R軟件繪制。

實驗中使用到的抗體及貨號：TRIM28 抗體（Active Motif，61174）、H3K27ac 抗體（Abcam，ab4729）、 H3K4me1 抗 體（Abcam， ab8895）、H3K4me3抗體（Abcam，ab8580）、H3K9me3抗體（Abcam， ab8898）、 PCDHB14 抗 體（Abgent，A?AP12321a） 、 TUBULIN 抗 體 （ABclonal，AC008）、ZNF93抗體（Abgent，A?AP20006A）。

2 結 果

2.1 成功構建Trim28基因敲除細胞系和TRIM28回補細胞系

利用CRISPR/Cas9 技術，設計靶向Trim28 起始密碼子下游第一位外顯子分別切割不同位置的gRNA1、gRNA2、gRNA3 和gRNA4。將4 種不同的gRNA 分為兩組，gRNA1 和gRNA2 為一組，gRNA3和gRNA4為一組，兩組HEK293F細胞系分別轉染兩組gRNA 質粒（圖1a），分別提取野生型HEK293F細胞系、gRNA1+gRNA2 pool和gRNA3+gRNA4 pool 細胞系的基因組DNA，Surveyor 實驗檢測gRNA 切割效率。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結果，與野生型HEK293F 細胞系比較，發(fā)現(xiàn)gRNA1+gRNA2 pool 和gRNA3+gRNA4 pool 細胞系DNA 條帶底部具有箭頭所示的彌散狀條帶（圖1b），證明Cas9?gRNA切割DNA片段導致基因組DNA堿基產(chǎn)生錯配。96 孔板分單克隆，利用SUVRYOR?F 和SUVRYOR?R 引物進行常規(guī)PCR，PCR 產(chǎn)物進行Sanger 測序，測序結果和野生型對比，獲得兩株Trim28基因組產(chǎn)生移碼突變的細胞系，其中一株堿基缺失193 bp，稱為TRIM28 KO1細胞系，另一株堿基缺失412 bp，稱為TRIM28 KO2 細胞系（圖1c）。利用免疫印跡技術對比野生型HEK293 細胞系TRIM28蛋白表達量，結果證明在Trim28基因缺失的細胞系中Trim28 完全敲除，蛋白質表達顯著降低（圖1d）。通過構建Trim28 cDNA 質粒在Trim28 基因敲除細胞系中回補Trim28 基因，免疫印跡結果證明回補的TRIM28 蛋白量和野生型HEK293F細胞系TRIM28蛋白表達量基本一致（圖1e），這些結果表明Trim28 基因敲除細胞系和TRIM28回補細胞系被成功構建。

Fig.1 Generation of Trim28 gene knockout cell line and TRIM28 rescue cell line(a) Schematic representation of the knockout targeting strategy, the targeting region located in exon 1. (b) Surveyor assay result shows Cas9 gRNA efficiency.Arrows at the bottom of main band indicate the smear band reflecting the efficiency of Cas9 gRNA.(c)Trim28 genomic DNA was deleted in Trim28 KO1 and Trim28 KO2 cell lines. (d) Knockout efficiency was detected by Western blot in HEK293 cell line. (e) Rescue efficiency was detected by Western blot.

2.2 TRIM28抑制內源表達量較低的基因的轉錄

為了深入研究TRIM28 的功能，本文使用mRNA?seq 測序技術分析野生型HEK293F 細胞系和Trim28 基因敲除細胞系中轉錄組的變化。根據(jù)結果發(fā)現(xiàn)，和野生型HEK293F 細胞系相比，在Trim28基因敲除細胞系中大部分基因的轉錄水平上升（圖2a）。將HEK293F 野生型細胞系和Trim28基因敲除細胞系中基因的RPKM 值取對數(shù)處理后分別分為3 個小組，其中All WT 和All KO 表示在野生型細胞系和Trim28 基因敲除細胞系中所有基因的表達水平，Down KO 和Down WT 表示在Trim28基因敲除細胞系中轉錄水平下降的那些基因和它們在野生型中的表達水平，Up KO 和Up WT表示在Trim28 基因敲除細胞系中轉錄水平上升的那些基因和它們在野生型中的表達水平。將Up KO和Up WT組進行比較，發(fā)現(xiàn)在Trim28基因敲除細胞系中轉錄水平上升的那些基因在野生型屬于低表達基因（圖2b），這些結果說明TRIM28 主要抑制內源表達水平較低的基因轉錄。

Fig.2 Up regulated genes by Trim28 KO are low expressed genes in HEK293F cells(a)The heatmap shows the up and down genes in Trim28 KO cell line.(b)Box plot shows the up regulated genes in WT(Up WT)are low expressed genes compared to other groups.

2.3 TRIM28抑制鋅指蛋白和原鈣黏蛋白基因的轉錄

為了進一步研究TRIM28的功能，將Trim28基因敲除細胞系中轉錄水平上升的基因進行分類，根據(jù)GO 分類結果發(fā)現(xiàn)，TRIM28 主要抑制兩類基因的轉錄，一類是鋅指蛋白（ZNF）基因，另一類是原鈣黏蛋白β（PCDHβ）基因（圖3a）。鋅指蛋白指的是由一類含有大約30 個氨基酸的環(huán)和一個與環(huán)上的4 個半胱氨酸或2 個半胱氨酸和2 個組氨酸配位的鋅離子構成的結構像手指狀的蛋白質，鋅指蛋白通過和DNA或者RNA相互作用在生物體內參與細胞分化、信號傳導、細胞遷移等多種生物學功能［19］。在鋅指蛋白家族中，有一類N 端由KRAB（Kruppel?associated box） 結 構 域組 成 的 鋅 指 蛋白［20］。既往報道發(fā)現(xiàn)，TRIM28在B細胞中能夠抑制含有KRAB 結構域的鋅指蛋白轉錄［21］，這和本文的實驗結果一致（圖3a）。

原鈣黏蛋白分為α、β 和γ 3 個亞單元，根據(jù)mRNA?seq 和GO 分 析 結果（圖3a，b） 發(fā)現(xiàn)，TRIM28 能夠抑制原鈣黏蛋白β 基因的轉錄，敲除Trim28基因后轉錄水平顯著升高的主要是β家族基因。原鈣黏蛋白在神經(jīng)細胞中高表達，是一種依賴鈣離子的黏附分子，分布于神經(jīng)細胞膜表面，主要是參與信號傳導作用，幫助神經(jīng)細胞參與識別“自我”和“非我”功能［22］。原鈣黏蛋白群在大腦神經(jīng)網(wǎng)絡發(fā)育中起到重要作用，若通過基因敲除或下調原鈣黏蛋白，可導致神經(jīng)細胞發(fā)育異常、彼此不分，并誘發(fā)凋亡［4］。既往研究集中在DNA 甲基化和染色質高級結構與原鈣黏蛋白轉錄調控之間的關系［6，23］，這是首次發(fā)現(xiàn)TRIM28 和PCDHβ 家族轉錄調控之間的聯(lián)系。

2.4 在Trim28基因敲除細胞系中鋅指蛋白家族和原鈣黏蛋白家族的蛋白質水平升高

本文發(fā)現(xiàn)在Trim28 基因敲除細胞系中部分鋅指蛋白和原鈣黏蛋白β的轉錄水平顯著上升，選擇鋅指蛋白ZNF93 和原鈣黏蛋白PCDHβ14 這兩個基因作為代表，檢測它們的蛋白質表達水平是否發(fā)生變化。免疫印跡（圖4a）的結果表明，和野生型HEK293F細胞系中ZNF93和PCDHβ14的蛋白質表達水平相比，在Trim28 基因敲除細胞系中這兩種蛋白質的表達水平顯著上升。由于mRNA?seq數(shù)據(jù)的RPKM 值（圖4b）在一定程度上能夠發(fā)映出mRNA水平，因此認為TRIM28抑制鋅指蛋白和原鈣黏蛋白的轉錄活性。當Trim28 基因敲除后，這兩類基因的轉錄水平顯著上升，蛋白質表達水平和野生型相比顯著升高。

Fig.3 TRIM28 mainly suppresses the transcription of ZNF family genes and PCDHβ family genes(a)GO analysis shows up?regulated genes.(b)RNA?seq signal shows the increased of PCDHβ family genes in Trim28 KO cell line.

2.5 Trim28基因敲除導致基因組組蛋白修飾發(fā)生改變

已經(jīng)證明TRIM28抑制基因的轉錄，在Trim28基因敲除細胞系中轉錄水平上升的基因數(shù)量大于轉錄水平下降的基因。為了更深入地研究TRIM28與組蛋白修飾的染色質高級結構之間的關系，本文進行了H3K4me1修飾、H3K4me3修飾、H3K9me3修飾、H3K27ac 修飾、RNA Pol II 和TRIM28 的染色質免疫共沉淀實驗。根據(jù)實驗結果（圖5b）發(fā)現(xiàn)，TRIM28 主要富集在有H3K9me3 修飾、H3K4me3修飾和H3K27ac 修飾的位點上。H3K9me3 修飾是異染色質的標志，和基因沉默具有相關性，H3K4me3 修飾和H3K27ac 修飾是啟動子與增強子的標志物［24］，這說明TRIM28 不僅參與異染色質的建立，還通過遠端調控元件調控基因的轉錄。根據(jù)這些修飾在野生型細胞系和Trim28 基因敲除細胞系中的變化（圖5a），發(fā)現(xiàn)TRIM28 主要參與異染色質的建立過程，敲除Trim28 導致全基因組范圍的H3K9me3修飾大幅度降低，H3K4me1修飾和H3K4me3 修飾只有部分降低。根據(jù)實驗結果，認為TRIM28 不僅參與其位點的H3K9me3 修飾的建立也會參與H3K4me3修飾的建立。

Fig.4 The protein levels of ZNF and PCDHB increased in Trim28 knockout cell lines(a) Protein level was detected by Western blot in HEK293 cell line and Trim28 KO cell line. (b) RPKM of ZNF93 and PCDHβ14 are shown in WT and Trim28 KO cell line.

Fig.5 TRIM28 KO-mediated histone changes at TRIM28 binding sites(a) Line plots show the histone modification enrichment at TRIM28 binding sites. (b) The heatmap shows the histone modification enrichment at TRIM28 binding sites.

2.6 Trim28基因敲除導致鋅指蛋白和原鈣黏蛋白基因組蛋白修飾發(fā)生改變

為了更深入地研究TRIM28抑制鋅指蛋白和原鈣黏蛋白的機制，本文分析了這兩類基因上組蛋白修飾的變化，發(fā)現(xiàn)H3K9me3 修飾和野生型HEK293F 相比大幅度降低，在鋅指蛋白家族基因上H3K4me1、H3K4me3 和H3K27ac 都 大幅 度升高，這說明染色質的狀態(tài)由致密變得松散，還發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白是TRIM28的直接靶基因。根據(jù)實驗結果（圖6a）認為，TRIM28 通過參與鋅指蛋白基因區(qū)域H3K9me3 修飾的建立抑制其轉錄活性，當敲除Trim28 后H3K9me3 修飾降低，染色質狀態(tài)由致密變得松散，提高了鋅指蛋白的轉錄活性。本文發(fā)現(xiàn)在PCDHβ 基因上，H3K9me3 修飾大幅度減少，H3K4me3 修飾顯著上升， H3K4me1 修飾和H3K27ac修飾沒有明顯的變化（圖6b）。之前對于原鈣黏蛋白基因的研究集中在染色質構架蛋白CTCF通過影響染色質高級結構激活特定的原鈣黏蛋白啟動子調控原鈣黏蛋白的轉錄［15?16］，本文認為，敲除Trim28 導致染色質結構松散，染色質高級結構發(fā)生改變，原鈣黏蛋白β的轉錄活性也隨之上升。

2.7 在Trim28敲除細胞系中回補Trim28會部分抑制鋅指蛋白和原鈣黏蛋白的轉錄活性

本文在Trim28 基因敲除細胞系中回補了Trim28，認為在Trim28 基因敲除細胞系中染色質的結構已經(jīng)發(fā)生了改變，染色質結構的變化會導致一些染色質相關因子的定位發(fā)生變化，即使回補Trim28 基因，染色質相關因子的定位可能不會完全恢復，因此在Trim28 回補的細胞系中只能部分抑制鋅指蛋白和原鈣黏蛋白的轉錄（圖7）。

Fig.7 Reintroduction of TRIM28 full length in Trim28 KO cell line could partially suppress the expression of ZNF family and PCDHβ familyRT?qPCR of PCDHβ and ZNF genes in WT,Trim28 KO and TRIM28 rescue(TRIM28KO+TRIM28FL)cell lines.

3 討 論

TRIM28 最早被鑒定能夠抑制鋅指蛋白的轉錄［1］，隨后的研究發(fā)現(xiàn)TRIM28通過和異染色質相關蛋白HP1、SETDB1相互作用，在靶基因上建立H3K9me3 修 飾 從 而 抑 制 基 因 的 轉 錄［17?18］。對 于TRIM28的其他生物學功能并不清楚，為了更深入地研究TRIM28的功能，本文首先建立了Trim28基因敲除細胞系，通過RNA?seq發(fā)現(xiàn)TRIM28主要是抑制內源表達較低基因的轉錄。然后，通過GO分析發(fā)現(xiàn)，TRIM28能夠抑制兩類基因的轉錄，鋅指蛋白基因和原鈣黏蛋白β基因。為了進一步解釋其中的機理，本文又進行了染色質免疫共沉淀實驗，發(fā)現(xiàn)組蛋白修飾和TRIM28之間的關系，在Trim28基因敲除細胞系中，H3K9me3 修飾下降，導致染色質結構松散，使得基因的轉錄活性增強。在鋅指蛋白基因區(qū)域，TRIM28 直接參與異染色質的建立，維持基因的沉默。TRIM28通過間接作用調控原鈣黏蛋白基因的轉錄活性。

既往對于原鈣黏蛋白基因的研究集中在，染色質構架蛋白CTCF通過影響染色質高級結構，激活特定的原鈣黏蛋白啟動子，調控原鈣黏蛋白的轉錄［25?26］。根據(jù)實驗結果推測，在Trim28 基因敲除細胞系中染色質高級結構的改變導致染色質相關因子CTCF在原鈣黏蛋白區(qū)域的分布發(fā)生變化，從而引起啟動子區(qū)域H3K4me3 修飾的變化，增強原鈣黏蛋白的轉錄活性。

4 結 論

本文利用CRISPR/Cas9 技術，通過在HEK293 F細胞系中建立Trim28基因敲除型細胞作為實驗材料，通過綜合運用生物信息學和蛋白質組學的方法，鑒定出TRIM28抑制鋅指蛋白家族基因和原鈣黏蛋白家族基因，初步探討了組蛋白修飾和TRIM28 轉錄抑制基因之間的關系，發(fā)現(xiàn)TRIM28主要是通過在基因組范圍內建立H3K9me3 修飾抑制基因的轉錄，為更深入地研究TRIM28和染色質高級結構以及原鈣黏蛋白家族基因之間的分子機制提供了新的思路。