分子印跡技術(shù)在食品腐敗菌與致病微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

任濤濤，陳金嬡，靳雨婷，湯軼偉，王向紅，王 碩，3

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧錦州 121013 2 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定 071001 3 天津市食品科學(xué)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院 天津 300071）

由微生物引起的食品污染和腐敗是全球食品工業(yè)面臨的兩個(gè)主要問(wèn)題，也是各國(guó)政府對(duì)食品質(zhì)量安全與食品供應(yīng)保障的關(guān)注焦點(diǎn)[1]。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）報(bào)告，每年全世界約6 億人口患食源性疾病，42 萬(wàn)人因食源性疾病而死亡，其中細(xì)菌污染是引起健康問(wèn)題的主要原因[2-3]。此外，微生物腐敗還造成全球約25%的食品損失，不但給生產(chǎn)者帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)壓力，還加重了社會(huì)的環(huán)境負(fù)擔(dān)[4]。食品腐敗菌與致病微生物檢測(cè)方法的建立（如細(xì)胞培養(yǎng)、菌落計(jì)數(shù)方法[5]、ELISA[6]、表面等離子共振[7]等）可在早期預(yù)測(cè)食品微生物的污染情況，對(duì)降低食源性疾病發(fā)病率和食品腐敗具有重要意義。然而，這些方法常常繁瑣、費(fèi)時(shí)、靈敏度或特異性差，難以滿(mǎn)足當(dāng)前食品安全檢測(cè)技術(shù)的市場(chǎng)需求[8]。

分子印跡聚合物（Molecularly imprinted polymers，MIPs） 是基于分子印跡技術(shù)（Molecularimprinting technology，MIT） 制備而成的高分子聚合物，可通過(guò)三維空間結(jié)構(gòu)和分子間作用力（氫鍵作用力、范德華力、靜電作用力、疏水作用力等）與模板分子或模板分子結(jié)構(gòu)類(lèi)似物特異性識(shí)別[9]，已在食品中農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)、活性成分分離、模擬酶催化危害物降解等方面進(jìn)行了廣泛研究[10-12]。

近年來(lái)，隨著MIT 和納米技術(shù)的發(fā)展，新型功能單體的開(kāi)發(fā)以及蛋白、多糖、多肽等生物大分子印跡聚合物的成功制備大大促進(jìn)了細(xì)菌、病毒等微生物印跡技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用。本文主要綜述微生物MIPs 合成方法以及分子印跡技術(shù)在食品腐敗菌與致病微生物檢測(cè)中的應(yīng)用，為提升我國(guó)食品中有害微生物檢測(cè)能力提供參考。

1 微生物MIPs 合成方法

與化學(xué)污染物相比，細(xì)菌、病毒等微生物體積大，表面化學(xué)成分多樣（蛋白、脂多糖、肽聚糖等），構(gòu)象柔順多變，易受pH 值、有機(jī)溶劑、離子等多種因素影響[13-14]。因此，微生物MIPs 的制備多在水相體系或水-有機(jī)溶劑兩相體系中進(jìn)行。

1.1 乳液聚合法

乳液聚合是指模板分子分散在水相中在穩(wěn)定劑作用下通過(guò)攪拌水相-油相形成乳液而制備生物大分子MIPs 的方法，該方法可保證蛋白等生物大分子模板在聚合過(guò)程中構(gòu)象的穩(wěn)定，提高了生物大分子MIPs 對(duì)目標(biāo)物識(shí)別的特異性[15]?；谌橐壕酆显恚琇ong 等[16]以銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 細(xì)胞壁的特有成分脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）為模板分子，丙烯酰胺為功能單體、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，三者溶于蒸餾水為分散相（水相）；以溶有表面活性劑聚氧乙烯月桂醚、磺基琥珀酸鈉二辛酯的正己烷為連續(xù)相（油相），在過(guò)硫酸銨、N，N，N，N-四甲基乙二胺引發(fā)體系下制備了可選擇性識(shí)別銅綠假單胞菌的分子印跡聚合物（圖1）。

圖1 分子印跡納米微球特異性識(shí)別細(xì)菌的過(guò)程示意圖[16]Fig.1 Molecularly imprinted nanoparticles for specific recognition of bacteria[16]

以膠體粒子為穩(wěn)定劑的乳液稱(chēng)為Pickering乳液，制備過(guò)程中不使用表面活性劑，已用于多種目標(biāo)物的MIPs 制備過(guò)程中[14]。Shen 等[17]創(chuàng)新性的以乙烯基N-丙烯酸殼聚糖修飾的細(xì)菌為粒子穩(wěn)定劑，構(gòu)建水相中穩(wěn)定的油相乳液，含有交聯(lián)劑單體的油相通過(guò)自由基引發(fā)聚合，聚合過(guò)程中細(xì)菌被印跡在聚合物微球表面。洗脫細(xì)菌后，聚合物微球表面留下模板細(xì)菌的特異性吸附位點(diǎn)（圖2）。依據(jù)同樣方法，Zhao 等[18]合成了單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）熒光MIPs。該合成方法簡(jiǎn)單，修飾物可根據(jù)細(xì)菌表面的理化性質(zhì)進(jìn)行調(diào)節(jié)，適合推廣到其它微生物MIPs 的制備。

圖2 細(xì)菌乳液聚合示意圖（a），洗脫前（b）后（c）細(xì)菌印跡聚合物掃描電鏡圖[17]Fig.2 Bacterial imprinting by Pickering emulsion polymerization（a），SEM images of bacterial imprinted polymers before（b）and after（c） removal of the template[17]

1.2 電化學(xué)聚合方法

電化學(xué)聚合方法是指在有電極浸入電解質(zhì)溶液中，利用電化學(xué)氧化或還原反應(yīng)，使功能單體、交聯(lián)劑、模板分子等在電極表面發(fā)生聚合反應(yīng)制備MIPs 膜的方法，該方法制備過(guò)程簡(jiǎn)單，聚合物膜厚度可控[19-20]。

Golabi 等[21]以表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）為模板，3-氨基苯硼酸為功能單體，以NaF 的磷酸鹽緩沖液為電解質(zhì)，在金電極表面成功合成了細(xì)菌MIPs 膜，該印跡膜厚度可通過(guò)控制電流進(jìn)行調(diào)節(jié)。印跡在MIPs 表面的細(xì)菌通過(guò)果糖的競(jìng)爭(zhēng)性吸附而分離，再用流動(dòng)的去離子水洗脫細(xì)菌模板。保存金電極前用磷酸鹽溶液浸泡以去除吸附在MIPs 中的果糖分子，并活化聚合物表面的硼酸基團(tuán)。該方法為食品腐敗菌和致病微生物的MIPs 電化學(xué)傳感器的制備奠定了基礎(chǔ)。Lachen等[22]以蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）芽孢為模板細(xì)胞，以吡咯為功能單體，在LiClO4溶液中、100mV/s 電壓下，在聚吡咯修飾的碳糊電極表面成功制備了芽孢M(jìn)IPs 膜。

1.3 微接觸印跡法

細(xì)菌微接觸印跡法是整細(xì)胞印跡的一種。Fu等[23]采用微接觸印跡法在玻璃板上制備了副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）MIPs 膜，該方法分為細(xì)菌模板制備和印跡膜制備兩個(gè)步驟（圖3）。細(xì)菌模板制備：（a）無(wú)水乙醇和去離子水將顯微鏡玻璃載玻片清洗干凈，用酸性食人魚(yú)溶液浸泡1h；（b）將福爾馬林滅活的副溶血弧菌懸浮液展涂于玻璃片上，4 ℃保持30 min 使細(xì)菌沉降于載玻片表面；（c）將載玻片置于旋轉(zhuǎn)涂布機(jī)上，1 500 r/min 下離心去除多余溶劑后用作細(xì)菌模板。印跡膜制備：（a）將聚二甲基硅氧烷溶于環(huán)己烷中，真空去除混合物中氣體；（b）取一定量的混合物展涂于干凈的玻璃載玻片上，80 ℃熱板上預(yù)固化2 min 以提高預(yù)聚物黏度；（c）將帶有細(xì)菌模板的玻璃片壓入預(yù)聚合物中，室溫過(guò)夜后再用80 ℃熱板固化1 h；（d）去離子水超聲輔助清洗壓印膜，然后在空氣中干燥；（e）為降低印跡膜的非特異性吸附，采用蒸發(fā)-沉積法制備副溶血弧菌氟化聚二甲基硅氧烷印跡膜。該印跡膜對(duì)副溶血弧菌具有較好的選擇吸附特性，捕獲率可達(dá)62.9%。

圖3 細(xì)菌印跡膜制備及副溶血弧菌的PCR 檢測(cè)示意圖[23]Fig.3 The schematic diagram of bacteria-imprinted film fabrication and PCR detection of Vibrio parahaemolyticus[23]

2 檢測(cè)方法

2.1 熒光檢測(cè)方法

熒光分析法是利用熒光信號(hào)強(qiáng)弱或顏色深淺進(jìn)行定性或定量分析的檢測(cè)方法，該方法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、響應(yīng)時(shí)間短等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)[24]。

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是奶制品、水產(chǎn)品、肉制品、蔬菜等食品中一種重要污染菌，是歐美等國(guó)家食品中毒事件爆發(fā)的主要致病菌之一。Zhao 等[18]將N-丙烯酸殼聚糖修飾的CdTe 量子點(diǎn)與單增李斯特菌的復(fù)合物分散于PBS（磷酸鹽）溶液中作為乳液穩(wěn)定劑，以三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯為功能單體，以過(guò)氧化苯甲酰、N，N-二甲基苯胺為引發(fā)劑，采用Pickering 乳液聚合方法制備了細(xì)菌熒光探針。該探針特異性好，隨著目標(biāo)細(xì)菌吸附量的增加，熒光強(qiáng)度顯著降低，最優(yōu)條件下探針對(duì)單增李斯特菌的檢出限為103CFU/mL（圖4），可用于牛奶樣品中單增李斯特菌污染狀況的監(jiān)測(cè)。

圖4 印跡熒光探針選擇性吸附結(jié)果（a）及不同單增李斯特菌濃度熒光強(qiáng)度圖（b）[18]Fig.4 The selectivity adsorption of MIPs and NIPs on four bacteria mixing solutions（a），fluorescence images of MIPs adsorbing different concentrations of L.monocytogens（b）[18]

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種常見(jiàn)的食源性革蘭氏陽(yáng)性致病微生物，約5%的微生物食物中毒由該菌腸毒素引起[25]。Bezdekova等[26]以金黃色葡萄球菌為模板，多巴胺為功能單體，Tirs 緩沖液為溶劑，分別在96 孔板孔內(nèi)和Fe3O4磁性納米材料表面合成了高特異性金黃色葡萄球菌MIPs，聚合物中的模板用Tirs 緩沖液洗脫。制備的金黃色葡萄球菌MIPs 可直接與牛奶等液態(tài)樣品混合對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行吸附，去除樣品后MIPs 用去離子水洗去未結(jié)合的細(xì)菌，加入碘化丙錠后通過(guò)熒光顯微鏡觀察確定樣品中的細(xì)菌，結(jié)果表明該MIPs 在牛奶樣品中對(duì)金黃葡萄球菌的檢出限為103CFU/mL。該研究中應(yīng)用的新型功能單體多巴胺具有水溶性好、反應(yīng)條件溫和，生物相容性好等特點(diǎn)，大大促進(jìn)了食品腐敗菌及致病微生物印跡聚合物材料的發(fā)展及新型檢測(cè)方法的建立。

2.2 電化學(xué)傳感器檢測(cè)方法

電化學(xué)傳感器的開(kāi)發(fā)是電分析檢測(cè)方法的發(fā)展方向，MIPs 等選擇性電極修飾材料大大提高了電化學(xué)檢測(cè)方法的選擇性，在環(huán)境、醫(yī)藥、食品分析等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用[27]。

芽孢桿菌的孢子在環(huán)境脅迫下可長(zhǎng)時(shí)間休眠，待適合萌發(fā)時(shí)又能重新生長(zhǎng)返回營(yíng)養(yǎng)體，引起食物腐敗和食源性疾病[28]。Lachen 等[22]首次通過(guò)電化學(xué)聚合方法成功將蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）芽孢M(jìn)IPs 膜修飾于碳糊工作電極表面，建立了循環(huán)伏安法電化學(xué)傳感器檢測(cè)方法，孢子與電極的最佳孵育時(shí)間為5 min，最優(yōu)條件下該方法對(duì)蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）芽孢的檢測(cè)范圍為102～105CFU/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=3）為13%～30%，該方法可快速檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）芽孢的污染情況，為細(xì)菌芽孢電化學(xué)檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

大腸桿菌（Escherichia coli）是一種革蘭氏陰性無(wú)芽孢細(xì)菌，常存在于飲用水和食品中，是引起腸胃炎的主要原因[29]。Chen 等[30]以大腸桿菌O157：H7 為模板，多巴胺為功能單體，通過(guò)電化學(xué)方法直接在玻璃電極表面成功合成了MIPs 膜，該印跡膜可特異性的吸附目標(biāo)細(xì)菌，與偶聯(lián)大腸桿菌多克隆抗體的摻氮石墨烯量子點(diǎn)（pAb-NGQDs）的溶液結(jié)合后，可形成MIPs-EscherichiacoliO157：H7-pAb-N-GQDs 復(fù)合物，該復(fù)合物在K2S2O8作用下能發(fā)生電化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，吸附的目標(biāo)細(xì)菌越多，發(fā)光強(qiáng)度越大，基于該原理建立了大腸桿菌O157：H7 的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法（圖5）。最優(yōu)條件下，該方法的檢測(cè)范圍為101～107CFU/mL，檢出限為8 CFU/mL。

圖5 電化學(xué)發(fā)光傳感器構(gòu)建與檢測(cè)過(guò)程示意圖[30]Fig.5 Schematic presentation of fabrication procedure of electrochemiluminescence biosensor and detection process[30]

Idil 等[31]以N-甲基丙烯酰-L-組氨酸甲酯、甲基丙烯酸-2-羥乙基酯為功能單體，以乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，大腸桿菌為模板，采用微接觸紫外引發(fā)印跡聚合方法在成功制備了大腸桿菌MIPs 金電極傳感器，并建立了電容式電化學(xué)檢測(cè)方法。最優(yōu)條件下，該方法對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)范圍為102～107CFU/mL，檢出限為70 CFU/mL，實(shí)際水樣品的檢測(cè)回收率為81%～97%。Wu 等[32]以大腸桿菌為模板，吡咯為單體，采用電化學(xué)聚合方法制備了玻璃電極MIPs 電化學(xué)傳感器，并建立了阻抗型電化學(xué)檢測(cè)方法。該方法可在1 h 內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌O157：H7 的檢測(cè)，定量限為103CFU/mL，在實(shí)際水樣、蘋(píng)果汁及牛奶樣品中性能穩(wěn)定，檢測(cè)回收率為96%～107.9%，RSD 小于4%。

2.3 表面等離子共振檢測(cè)方法

表面等離子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）檢測(cè)是一種基于金屬介質(zhì)波導(dǎo)表面等離子的無(wú)損傷、無(wú)標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，具有樣品使用量少、靈敏度高、快捷方便、可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[33]。

Yilmaz 等[34]以甲基丙烯酸-2-羥乙基酯、N-甲基丙烯酰-L-組氨酸甲酯為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，大腸桿菌為模板，采用微接觸印跡方法在SPR 傳感器表面制備大腸桿菌MIPs 膜，并建立了SPR 檢測(cè)方法。最優(yōu)條件下，該方法的最低檢出限和定量限分別為1.54×106CFU/mL 和5.13×106CFU/mL，響應(yīng)為113 s。為增強(qiáng)SPR 傳感器相應(yīng)信號(hào)，提高SPR 檢測(cè)方法的靈敏度，?zgür 等[35]在SPR 傳感器表面合成MIPs 時(shí)加入Ag 納米粒子，結(jié)果顯示該SPR 傳感器檢測(cè)大腸桿菌的靈敏度顯著提高，最優(yōu)條件下檢出限達(dá)到0.57 CFU/mL。

糞腸球菌（Enterococcus faecalis）隸屬于腸球菌屬，常作為食物中糞便污染指示菌，也是一種重要的機(jī)會(huì)性人畜共患致病菌[36]。Erdem 等[37]首先將模板糞腸球菌與功能單體N-甲基丙烯酰-L-組氨酸甲酯混合形成復(fù)合體，將乳液穩(wěn)定劑聚乙烯醇，表面活性劑十二烷基硫酸鈉溶于水相（NaHCO3調(diào)水溶液pH 值），將聚乙烯醇、十二烷基硫酸鈉、第二功能單體甲基丙烯酸羥乙酯、交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯溶于有機(jī)相，水相-有機(jī)相攪拌成乳液后加入糞腸球菌-功能單體復(fù)合體，混合體系在NaHSO3和（NH4）2S3O8引發(fā)劑作用下（40 ℃，24 h，500 r/min）制備糞腸球菌聚合物微球。經(jīng)NaCl 溶液洗脫模板后的MIPs 微球經(jīng)旋涂系統(tǒng)將其均勻涂蓋于等離子體傳感器表面，然后將制備的MIPs-SPR 傳感器分別在紫外燈（100 W，365 nm）和烘箱（40 ℃）中固化MIP s（圖6）。試驗(yàn)結(jié)果表明，該SPR 傳感器對(duì)目標(biāo)菌具有較高的選擇性，對(duì)大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌的響應(yīng)信號(hào)弱，檢測(cè)的線(xiàn)性范圍為2×104～1×108CFU/mL，最低可檢測(cè)出～100 細(xì)菌/mL。該研究通過(guò)涂抹技術(shù)將乳液聚合的細(xì)菌印跡納米顆粒作為識(shí)別元件固定于SPR 傳感器表面，為其它微生物的廣泛檢測(cè)提供了技術(shù)支撐。

圖6 糞腸球菌印跡等離子共振傳感器制備示意圖[37]Fig.6 The preparation of E.faecalis-imprinted plasmonic sensor[37]

食源性病毒是導(dǎo)致食源性疾病的重要病原之一，檢測(cè)技術(shù)是開(kāi)展食源性病毒監(jiān)測(cè)與防控工作的基礎(chǔ)[38]。Altintas 等[39]將固定于戊二醛處理的玻璃球表面噬菌體MS2 作為模板，以N-異丙基丙烯酰胺、N-叔丁基丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、丙烯酸為功能單體，功能單體與模板混合后再加入N-（3-氨基丙基）甲級(jí)丙烯酰胺鹽酸鹽，在過(guò)硫酸銨、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺引發(fā)下室溫聚合2 h，然后用雙餾水洗脫（60 ℃）高親和力的MIPs 納米微球。1，1-巰基十一酸修飾的SPR傳感器芯片經(jīng)NHS 和EDC 活化后與MIPs 反應(yīng)，使其固定于傳感器表面，乙醇胺封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。該方法制備噬菌體MS2 MIPs 聚合物納米顆粒直徑為200～230 nm，最優(yōu)條件下，SPR 檢測(cè)方法的檢出限為5×106PFU/mL。該研究為食源性病毒分子印跡SPR 傳感器的構(gòu)建及檢測(cè)方法的推廣奠定了基礎(chǔ)。

2.4 石英晶體微天平檢測(cè)方法

石英晶體微天平是一種質(zhì)量傳感器裝置，具有簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、高分辨等特點(diǎn)，可根據(jù)傳感器表面吸附物質(zhì)引起的質(zhì)量變化進(jìn)行定量分析[40]。

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）具鞭毛，是引起肉品和水產(chǎn)品的一種重要革蘭氏陰性腐敗菌，給食品安全帶來(lái)巨大隱患[41]。Tokonami等[42]首先通過(guò)等離子蝕刻技術(shù)處理石英晶體微天平的鍍金芯片，再以吡咯為功能單體、銅綠假單胞菌為模板，通過(guò)電聚合技術(shù)在芯片表面聚合形成含有菌體的聚吡咯（PPy）膜。然后，制備的聚吡咯經(jīng)過(guò)氧化處理（OPPy）去除模板細(xì)菌，包括溶菌酶處理（消除菌體細(xì)胞壁多糖與聚合物表面的強(qiáng)相互作用） 和氧化納溶液洗脫銅綠假單胞菌模板兩部分（圖7）。以醋酸鈣不動(dòng)桿菌（Acinetobacter calcoaceticus），大腸桿菌（Escherichia coli），粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）為模板菌的形狀類(lèi)似菌進(jìn)行選擇性試驗(yàn)，結(jié)果表明制備的MIPs 對(duì)銅綠假單胞菌具有高選擇性；最優(yōu)條件下，建立的微天平檢測(cè)方法對(duì)目標(biāo)菌的信號(hào)響應(yīng)范圍為103～109CFU/mL。

圖7 基于過(guò)氧化聚吡咯細(xì)菌電極示意圖（a），聚吡咯（b）和過(guò)氧化聚吡咯（c）電鏡圖[42]Fig.7 Schematic illustration of electrode arrangement for bacterial detection with OPPy film（a），SEM images of target bacteria and prepared PPy（b） and OPPy（c） films[42]

2.5 共振光散射檢測(cè)方法

共振光散射是指當(dāng)電子吸收電磁波頻率與散射頻率相同時(shí)，電子因共振而強(qiáng)烈吸收光能量并再次發(fā)生散射的過(guò)程稱(chēng)為共振光散射[43]。基于共振光散射光譜建立的檢測(cè)方法具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，已廣泛用于食品中危害物殘留檢測(cè)[44]。

甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus，HAV）是一種重要的食源性病毒，可引起大規(guī)模疾病爆發(fā)。Yang 等[45]以制備的SiO2納米粒子為核，以多巴胺為功能單體、HAV 為模板，在Tris 緩沖液中（25 ℃）通過(guò)自組裝制備了分子印跡納米微球，去離子水洗去聚合物微球表面反應(yīng)的功能單體和病毒模板，然后分別用乙酸和十二烷基硫酸鈉溶液洗脫印跡的HAV（圖8）。聚合物微球共振光散射光譜強(qiáng)度隨著結(jié)合HAV 數(shù)量的增加而增強(qiáng)，最優(yōu)條件下該方法對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)濃度為0.04～6.0 nmol/L，檢出限為8.6 pmol/L。Liu 等[46]以氨基修飾的SiO2納米微球?yàn)楹?，N-異丙基丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺為功能單體，HAV 為模板，過(guò)硫酸銨為引發(fā)劑，室溫反應(yīng)2 h 制備了HAV 印跡聚合物，最后以甲醇/乙酸混合溶劑為洗脫溶劑去除HAV 模板。最優(yōu)條件下，基于該聚合物納米微球建立的共振光散射檢測(cè)方法對(duì)HAV 的線(xiàn)性范圍為5～25 pmol/L，檢出限為1.1 pmol/L。

圖8 病毒印跡聚合物和檢測(cè)方法示意圖[45]Fig.8 Principle of preparation of the virus-MIPs and detection of virus[45]

3 結(jié)語(yǔ)與展望

分子印跡技術(shù)作為合成具有特異識(shí)別性能合成材料的技術(shù)，已成為一種新的研究方向。近年來(lái)，MIPs 在從小分子識(shí)別到生物大分子及微生物的高效識(shí)別過(guò)程中取得了很大進(jìn)展，逐漸成為天然受體的完美代替品。準(zhǔn)確、快速監(jiān)測(cè)食品中微生物的污染狀況對(duì)降低食物浪費(fèi)和食源性疾病爆發(fā)具有重要意義。當(dāng)前針對(duì)細(xì)菌、病毒等微生物形態(tài)結(jié)構(gòu)和表面化學(xué)基團(tuán)開(kāi)發(fā)的新型功能單體及合成方法顯著提高了MIPs 在水相環(huán)境中對(duì)微生物的識(shí)別性能，基于MIPs 建立的新型檢測(cè)方法也為食品腐敗菌和致病微生物的監(jiān)測(cè)提供了新的技術(shù)支撐。然而，當(dāng)前基于分子印跡技術(shù)對(duì)食品腐敗菌及致病微生物的檢測(cè)仍處于發(fā)展階段，依然存在以下問(wèn)題需要深入研究：1） 多巴胺作為新的功能單體促進(jìn)了食品腐敗菌及治病微生物印跡聚合物的發(fā)展，但是聚多巴胺表面的官能團(tuán)密度大，致使聚多巴胺印跡材料的非特異性吸附問(wèn)題突出?？赏ㄟ^(guò)利用多巴胺衍生物或采用進(jìn)一步通過(guò)物理或化學(xué)方法改性聚多巴胺膜的方法降低非特異性吸附，提高選擇性；2）開(kāi)發(fā)新的功能單體或優(yōu)化功能單體組合以提高M(jìn)IPs 對(duì)目標(biāo)微生物的特異性吸附，開(kāi)發(fā)新的微生物印跡方法以適應(yīng)不同食品微生物MIPs 的制備；3）目前只有細(xì)菌細(xì)胞壁的脂多糖作為特征識(shí)別基團(tuán)用于制備MIPs，這大大限制了MIT 的應(yīng)用范圍，探索新的微生物特征組成MIPs；4）食品樣品基質(zhì)對(duì)微生物MIPs 選擇吸附性能及檢測(cè)靈敏度的影響較大，研究消除基質(zhì)影響的方法對(duì)加快MIT 在食品腐敗菌及致病微生物污染檢測(cè)中應(yīng)用有重要意義。