香葉木素對Ⅱ型糖尿病小鼠的降血糖作用

江一峰，周雪雪，2，黃盈盈，張華峰，2*，王紅霞

（1 中俄食品與健康科學(xué)國際聯(lián)合研究中心 陜西省漢陰縣富有機(jī)硒食品科技創(chuàng)新試驗(yàn)示范站陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院 西安 710119 2 西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室 西安 710119）

糖尿病是威脅人體健康的重要慢性疾病，也是引起死亡的十大病因之一[1-3]。全球糖尿病患者接近4 億，而我國約為1 億，且呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢[4-5]。糖尿病以糖代謝紊亂為主要特征，常伴隨氧化應(yīng)激和脂代謝紊亂，并可能產(chǎn)生肝臟、腎臟等臟器損傷或并發(fā)癥[6]。臨床上常用的二甲雙胍、胰島素（INS）、格列美脲等藥物雖然具有明顯的降血糖效果，但是長期使用可能對患者產(chǎn)生副作用[7-8]。從藥食同源植物中獲取天然、高效、安全的降糖因子成為糖尿病相關(guān)研究的新方向[1]。

菊花是我國著名的藥食同源植物，具有降血糖、抗氧化、降血壓、抗癌、抑菌、調(diào)節(jié)腸道菌群等作用[9-12]，在飲料、藥膳、休閑食品加工中具有廣泛用途[9]。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，菊花中含有較豐富的香葉木素（diosmetin）、異綠原酸C（isochlorogenic acid C）、木犀草苷（cynaroside）和蒙花苷（buddleo side）[13]。異綠原酸C 具有清除自由基、抗炎等功效[14-15]；木犀草苷具有抗菌、保護(hù)神經(jīng)等功效[16-17]；蒙花苷具有抗氧化、抗炎等功效[18-19]；香葉木素具有抗氧化、抗癌和保護(hù)視網(wǎng)膜等功效[20-22]。目前鮮見關(guān)于這4 種酚類化合物單體降血糖作用的研究報道。為了揭示菊花降血糖作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，了解香葉木素的降血糖活性，本研究通過體外試驗(yàn)篩選活性較高的單體，在此基礎(chǔ)上利用高糖、高脂飼料結(jié)合鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的Ⅱ型糖尿病小鼠模型，探究其降血糖作用以及對脂代謝、氧化應(yīng)激等的效應(yīng)。

1 試驗(yàn)材料

4～6 周齡雄性昆明小鼠[SCXK（陜）2012-001，SPF 級]，西安交通大學(xué)；普通飼料，西安晶博公司；高糖、高脂飼料（65%小鼠維持飼料、20%蔗糖、10%豬脂肪、2.5%膽固醇、1%膽酸鈉、1%礦物質(zhì)混合物、0.5%維生素混合物），北京博愛港公司；異綠原酸C（HPLC 級，純度≥98%）、木犀草苷（HPLC級，純度≥98%）、香葉木素（HPLC 級，純度≥98%）、蒙花苷（HPLC 級、純度≥98%）、阿卡波糖（Acarbose，HPLC 級，純度≥98%）、α-淀粉酶（4 000 U/g）、α-葡萄糖苷酶（10 U/mg）、α-D-葡萄糖苷（PNPG），上海源葉公司；INS、糖原、糖化血清蛋白（GSP）、總膽固醇（TC）、總甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）檢測試劑盒或ELISA 試劑，南京建成生物工程研究所；STZ，美國Sigma 公司；格列美脲，天安公司；二甲雙胍，中美上海施貴寶公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 分子對接分析

參照周雪雪[1]的方法，選用異綠原酸C、木犀草苷、香葉木素、蒙花苷4 種酚類化合物單體，以阿卡波糖為對照，進(jìn)行α-葡萄糖苷酶蛋白分子對接分析。

2.2 α-淀粉酶抑制作用分析

參照聶坤倫等[23]的方法分析4 種酚類化合物單體對α-淀粉酶的抑制作用，以阿卡波糖為對照。用Multiskan Go 全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Electron 公司）測定吸光值。計(jì)算各單體對α-淀粉酶的抑制率以及25%抑制質(zhì)量濃度（IC25）和半抑制質(zhì)量濃度（IC50）。

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制作用分析

參照Thi 等[24]的方法分析4 種酚類化合物單體對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，以阿卡波糖為對照。用全波長酶標(biāo)儀測定吸光度。計(jì)算各單體對α-葡萄糖苷酶的抑制率以及25%抑制質(zhì)量濃度和半抑制質(zhì)量濃度。

2.4 Ⅱ型糖尿病模型建立與分組處理

取雄性昆明小鼠100 只，用普通飼料喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常類群和模型類群。模型類群飼喂高糖、高脂飼料，正常類群仍然飼喂普通飼料[25]。4 周后，所有小鼠禁食（不禁水）12 h，給模型類群、正常類群小鼠分別注射STZ、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h 后，所有小鼠禁食（不禁水）12 h，測定空腹血糖（FBG），結(jié)合糖尿病高飲水量等典型癥狀將FBG≥11.1 mmol/L 的小鼠認(rèn)定為造模成功[26]。對未成模小鼠，繼續(xù)補(bǔ)充注射STZ。按照表1對小鼠進(jìn)行分組處理。

表1 實(shí)驗(yàn)動物分組Table 1 Group of experimental animals

2.5 生理生化指標(biāo)測定

2.5.1 小鼠攝食量、飲水量、體重和FBG 測定干預(yù)（灌胃）試驗(yàn)期間，除正常組（N 組）外，其余各組進(jìn)行高糖、高脂飼喂。連續(xù)干預(yù)30 d，期間每天觀察小鼠的飲水量、攝食量、體征變化、精神狀態(tài)、墊料潮濕程度（排尿量變化）等，每隔6 d 測量1次體重和FBG，用平均值繪圖。

2.5.2 葡萄糖耐受量（OGTT）測定 參考Liu 等[27]的方法測定小鼠的OGTT。小鼠禁食（不禁水）12 h后，測定各組小鼠的FBG（0 h）。N 組、模型組（M組）給予生理鹽水，陽性對照組1（P1 組）、陽性對照組2（P2 組）分別給予二甲雙胍、格列美脲，高劑量干預(yù)組（D50 組）、中劑量干預(yù)組（D30 組）和低劑量干預(yù)組（D15 組）分別給予高、中、低劑量的香葉木素。各組小鼠給予葡萄糖后測定0.5，2 h 的血糖值，求得曲線下面積（AUC）。

2.5.3 樣本收集與臟器指數(shù)測定 干預(yù)試驗(yàn)結(jié)束后，參照周雪雪[1]和Yuan 等[26]的方法進(jìn)行樣本收集和臟器指數(shù)測定。

2.5.4 GSP 含量測定 取-20 ℃凍存的血清樣本，化凍，參照試劑盒說明書測定GSP 含量。

2.5.5 INS 含量測定 取-20 ℃凍存的血清樣本，化凍，參照試劑盒說明書測定INS 含量，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）[28]。

2.5.6 脂代謝指標(biāo)測定 取-20 ℃凍存的血清樣本，化凍，測定小鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C含量[29-30]。

2.5.7 肝臟指標(biāo)測定

2.5.7.1 肝糖原含量測定 取-20 ℃凍存的肝臟組織樣本，化凍，測定肝糖原含量[31]。

2.5.7.2 肝功能相關(guān)酶活力測定 取-20 ℃凍存的血清樣本，化凍，測定ALT 和AST 活力[32]。

2.5.8 抗氧化指標(biāo)測定 取-20 ℃凍存的血清和肝組織樣本，化凍，按照試劑盒說明書測定小鼠血清和肝臟中抗氧化酶（SOD、GSH-Px） 活力、TAOC 與MDA 含量[30，33]。

3 結(jié)果與分析

3.1 分子對接試驗(yàn)

異綠原酸C 能夠與α-葡萄糖苷酶蛋白的氨基酸殘基ASP232、ASP357、GLU603、ASP630 形成分子間氫鍵，與 ASP469、ALA602、GLU603、ASP630 形成疏水作用力，配體與蛋白所形成的復(fù)合物結(jié)合穩(wěn)定（圖1a）；木犀草苷能夠與酶蛋白的ASP232、ASN237、MET470、ASN496、SER505、ARG552 形成分子間氫鍵，與ALA231、ILE233、ALA234、MET470、LYS506 形成疏水作用力，但是與MET470 之間產(chǎn)生了一個非特異性排斥力（圖1b）；香葉木素能夠與酶蛋白的ASP232、ASP469、ARG552、ASP630 形成分子間氫鍵，與TRP329、TRP432、MET470、ASP568、PHE601、ALA602、ALA628 形成疏水作用力，配體與蛋白所形成的復(fù)合物結(jié)合較穩(wěn)定（圖1c），相互作用能量得分較好（表1）；蒙花苷能夠與酶蛋白的ASP232、ASN237、ASP469、MET470、ASN496、ARG552、ASP568、ASP630 形成分子間氫鍵，與ILE233、ALA234、MET470、LYS506 形成疏水作用力（圖1d）。由表2可知，4 種酚類化合物單體對α-葡萄糖苷酶蛋白均有一定的親和活力，其分子對接能力依次為：異綠原酸C＞香葉木素＞木犀草苷＞蒙花苷。

表2 酚類化合物單體與α-葡萄糖苷酶蛋白的分子對接結(jié)果Table 2 Molecular docking results of phenolic compounds to α-glucosidase protein

圖1 酚類化合物單體與α-葡萄糖苷酶的分子對接模式Fig.1 Molecular docking mode of phenolic compounds to α-glucosidase

3.2 酶學(xué)試驗(yàn)

3.2.1 α-淀粉酶抑制活性 如圖2所示，4 種酚類化合物單體對α-淀粉酶的抑制率均隨著其濃度的增大而增加。由表3可得，4 種單體濃度與α-淀粉酶抑制率擬合方程的相關(guān)系數(shù)（R2）在0.9006～0.9605 之間，反映出較好的量效關(guān)系。4 種單體對α-淀粉酶的抑制能力依次為：木犀草苷＞香葉木素＞蒙花苷＞異綠原酸C。

圖2 酚類化合物單體對α-淀粉酶的抑制率Fig.2 Inhibitory rate of phenolic compounds against α-amylase

3.2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性 如圖3所示，4種酚類化合物單體對α-葡萄糖苷酶的抑制率均隨著濃度的增大而增加。4 種單體濃度與α-葡萄糖苷酶抑制率擬合方程的R2在0.9165～0.9626 之間，反映出較好的量效關(guān)系（表3）?？梢钥闯?，4 種單體對α-葡萄糖苷酶均表現(xiàn)出抑制活性，但弱于阿卡波糖。不同單體對α-葡萄糖苷酶的抑制能力依次為：香葉木素＞木犀草苷＞異綠原酸C＞蒙花苷。綜合分析4 種單體的分子對接以及α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶試驗(yàn)結(jié)果，選擇香葉木素進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探究其體內(nèi)降血糖作用。

表3 酚類化合物單體對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性及其量效關(guān)系數(shù)學(xué)模型Table 3 Inhibitory activities of phenolic compounds against α-amylase and α-glucosidase and mathematical model of dose-effect relationship

圖3 酚類化合物單體對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.3 Inhibitory rate of phenolic compounds againist α-glucosidase

3.3 小鼠攝食量、飲水量與體重變化分析

觀測發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型糖尿病模型小鼠行動遲緩，精神萎靡，墊料易濕且臭味明顯，而N 組小鼠體型健碩，行動敏捷。干預(yù)30 d 后，除D15 組外，其余各干預(yù)組小鼠的上述不良狀況均有所緩解。由圖4可知，造模成功后，小鼠攝食量、飲水量增加，體重減輕。干預(yù)30 d 后，與M 組相比，D15、D30、D50、P1、P2 組小鼠的攝食量和飲水量皆有所降低；除D15 組外，其余各干預(yù)組小鼠體重減輕的趨向也逐漸減緩。可見，香葉木素對Ⅱ型糖尿病小鼠高攝食量、高飲水量和低體重的病征具有一定的緩解作用。

圖4 香葉木素對小鼠攝食量、飲水量和體重的影響Fig.4 Effect of diosmetin on food intake，water intake and body weight of mice

3.4 香葉木素對小鼠FBG、HOMA-IR 和INS含量的影響

由表4可知，隨著時間的延長，N 組小鼠的FBG 一直遠(yuǎn)低于11.1 mmol/L，而M 組的FBG 則持續(xù)上升。D15、D30、D50 組小鼠的FBG 在干預(yù)12 d 后開始出現(xiàn)不同程度的下降，在干預(yù)12，18，24，30 d 的FBG 均顯著低于M 組（P＜0.05）。D15、D30、D50 組小鼠的FBG 隨著香葉木素濃度的增大而降低，呈現(xiàn)出較好的量效關(guān)系。由圖5和圖6可見，與N 組相比，M 組小鼠的INS 含 、HOMA-IR 均極顯著提高（P＜0.01），說明Ⅱ型糖尿病小鼠出現(xiàn)了胰島素抵抗癥狀[34]。干預(yù)30 d后，與M 組相比，D15、D30、D50 組小鼠的INS 含量、HOMA-IR 均顯著降低（P＜0.05），并且INS 含量、HOMA-IR 均隨著香葉木素濃度的增大而降低，顯示出較好的劑量依賴性。可以看出，香葉木素能夠降低Ⅱ型糖尿病小鼠的FBG，緩解其胰島素抵抗癥狀。

圖5 香葉木素對小鼠胰島素含量的影響Fig.5 Effect of diosmetin on insulin content in mice

圖6 香葉木素對小鼠HOMA-IR 的影響Fig.6 Effect of diosmetin on HOMA-IR in mice

表4 香葉木素對Ⅱ型糖尿病小鼠FBG 的影響Table 4 Effect of diosmetin on FBG in type Ⅱdiabetic mice

3.5 香葉木素對小鼠GSP 含量的影響

GSP 可以反映糖尿病患者在過去1～2 周內(nèi)血糖的控制情況[29]。由圖7可見，M 組小鼠血清中GSP 含量極顯著地高于N 組（P＜0.01）。干預(yù)30 d后，與M 組相比，D15 組小鼠的GSP 含量略有下降（P＞0.05），D30、D50、P1、P2 組GSP 含量顯著下降（P＜0.05）。

圖7 香葉木素對小鼠GSP 含量的影響Fig.7 Effect of diosmetin on GSP content in mice

3.6 香葉木素對小鼠OGTT 的影響

OGTT 主要反映機(jī)體血糖調(diào)節(jié)能力和胰島素敏感性[35]。由表5可知，與N 組對比，M 組小鼠的血糖值在給予葡萄糖前（0 h）和給予葡萄糖后（0.5，2 h）均極顯著增高（P＜0.01）；與M 組對比，D30、D50 組小鼠在0.5，2 h 的血糖值皆顯著降低（P＜0.05）；D15 組在0.5 h 的血糖值與M 組相比沒有顯著差別（P＞0.05），而在2 h 的血糖值顯著低于M 組（P＜0.05）。由圖8可見，M 組小鼠的AUC 極顯著高于N 組小鼠（P＜0.01）；D30、D50 組小鼠的AUC 顯著低于M 組（P＜0.05），D15 組的AUC 略低于M 組（P＞0.05）?？梢?，香葉木素可以緩解小鼠OGTT 異常。

表5 香葉木素對Ⅱ型糖尿病小鼠OGTT 的影響Table 5 Effect of diosmetin on OGTT in type Ⅱdiabetic mice

圖8 香葉木素對小鼠AUC 的影響Fig.8 Effect of diosmetin on AUC of mice

3.7 香葉木素對小鼠臟器指數(shù)的影響

糖尿病往往會引起肝、腎等臟器的傷害，通常臟器指數(shù)增大說明臟器可能出現(xiàn)了損傷[27，32]。由表6可知，與N 組對比，M 組小鼠肝、脾和腎的臟器指數(shù)皆顯著提高（P＜0.05）。干預(yù)30 d 后，與M 組相比，D30、D50 組小鼠肝、脾和腎的臟器指數(shù)皆顯著降低（P＜0.05）；D15 組的腎臟指數(shù)與M 組相比無明顯差異（P＞0.05），肝臟、脾臟指數(shù)皆顯著低于M 組（P＜0.05）。由此推測，香葉木素具有緩解Ⅱ型糖尿病小鼠肝、脾和腎損傷的作用。

表6 香葉木素對Ⅱ型糖尿病小鼠臟器指數(shù)的影響Table 6 Effect of diosmetin on organ index of type Ⅱdiabetic mice

3.8 香葉木素對小鼠脂代謝指標(biāo)的影響

糖代謝與脂代謝密切關(guān)聯(lián)，糖尿病患者容易出現(xiàn)脂代謝紊亂，隨著病情加重甚至?xí)饎用}粥樣硬化[36-37]。由圖9可知，與N 組對比，M 組小鼠TG、TC、LDL-C 含量均極顯著上升（P＜0.01），HDL-C 含量極顯著降低（P＜0.01）。干預(yù)30 d 后，與M 組相比，D30、D50 組小鼠血清中TG、TC、LDL-C 含量皆明顯降低（P＜0.05），HDL-C 含量明顯提高（P＜0.05）；D15、D30、D50 組小鼠的TG、TC、LDL-C 含量均隨著香葉木素劑量的增大而降低，HDL-C 含量隨著香葉木素劑量的增大而升高，顯示出較好的量效關(guān)系?？梢钥闯?，香葉木素對小鼠脂代謝紊亂表現(xiàn)出較好的緩解作用。

圖9 香葉木素對小鼠脂代謝的影響Fig.9 Effect of diosmetin on lipid metabolism in mice

3.9 香葉木素對小鼠肝糖原的影響

肝糖原的合成與分解可以反映機(jī)體對葡萄糖的吸收和利用情況[27]。由圖10可見，與N 組對比，M 組小鼠肝糖原含量極顯著降低（P＜0.01）。干預(yù)30 d 后，與M 組對比，D15、D30、D50 組小鼠的肝糖原含量皆明顯提高（P＜0.05）；隨著香葉木素劑量的提升，小鼠肝糖原積累量逐漸增多。

圖10 香葉木素對小鼠肝糖原含量的影響Fig.10 Effect of diosmetin on liver glycogen in mice

3.10 香葉木素對小鼠肝功能的影響

AST 和ALT 是衡量肝功能的重要標(biāo)志物[1]。由圖11可見，與N 組對比，M 組小鼠血清中AST、ALT 活力極顯著升高（P＜0.01）。干預(yù)30 d 后，與M組對比，D15、D30、D50 組小鼠AST、ALT 活力皆明顯下降（P＜0.05）。小鼠ALT、AST 活力隨著香葉木素劑量的增大而減弱，顯示出較好的量效關(guān)系。香葉木素可以減弱Ⅱ型糖尿病小鼠血清AST、ALT 活力，降低小鼠肝臟指數(shù)（表6），提示其能夠緩解糖尿病小鼠的肝功能損傷。

圖11 香葉木素對小鼠肝功能相關(guān)酶活力的影響Fig.11 Effect of diosmetin on enzymes related to liver function in mice

3.11 香葉木素對小鼠抗氧化能力的影響 由圖12、13 可見，與N 組相比，M 組小鼠血清和肝臟中MDA 含量極顯著上升（P＜0.01），T-AOC 以及SOD、GSH-Px 活力極顯著降低（P＜0.01）。30 d 干預(yù)后，與M 組對比，D15、D30、D50 組小鼠肝臟和血清中T-AOC 明顯提升（P＜0.05），T-AOC 隨著香葉木素濃度的增大而升高；D30、D50 組小鼠血清和肝臟中MDA 含量均明顯低于M 組（P＜0.05），D15 組小鼠血清和肝臟中MDA 含量略低于M 組（P＞0.05），MDA 含量隨著香葉木素劑量的增大而變少；D30、D50 組小鼠血清和肝臟的抗氧化酶（SOD、GSH-Px）活力皆明顯高于M 組（P＜0.05），D15 組抗氧化酶活力略高于M 組。氧化應(yīng)激與糖尿病緊密聯(lián)系[38]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)血糖濃度過高時，會刺激組織細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），可能破壞胰島B 細(xì)胞功能，使胰島素分泌不足[38-39]。香葉木素有助于改善小鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)，對于Ⅱ型糖尿病防治具有積極作用。

圖12 香葉木素對小鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Fig.12 Effect of diosmetin on oxidative stress of serum in mice

圖13 香葉木素對小鼠肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Fig.13 Effect of diosmetin on oxidative stress of liver in mice

4 結(jié)論

本研究分析了香葉木素與α-葡萄糖苷酶的分子對接能力及其對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制活性，在此基礎(chǔ)上通過Ⅱ型糖尿病小鼠模型研究了香葉木素的降血糖活性，并探究了其對脂代謝、氧化應(yīng)激等的效應(yīng)。香葉木素干預(yù)30 d 后，糖尿病小鼠多食、多飲和體重減輕等病征得到緩解，同時，香葉木素還可降低小鼠的FBG 與GSP含量，緩解OGTT 異常與胰島素抵抗。MDA、TAOC 和SOD 等分析結(jié)果證明，香葉木素具有緩解糖尿病氧化應(yīng)激的作用。TC 和HDL-C 等分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，香葉木素可以改善小鼠的脂代謝紊亂。肝臟指數(shù)和AST、ALT 分析結(jié)果顯示，香葉木素可以緩解Ⅱ型糖尿病引起的肝功能受損。綜上，香葉木素對Ⅱ型糖尿病小鼠具有較好的降血糖作用，但其具體機(jī)制尚需通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步探究。