銀杏葉提取物通過JAK2/STAT3信號通路調控食管癌細胞EC9706增殖、凋亡、侵襲、遷移的研究

照日格吐，孫志剛，焦杰，劉悅

[1.內蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院胸外科，內蒙古 010020；2.湖北文理學院附屬醫(yī)院（襄陽市中心醫(yī)院）消化內科，湖北襄陽 441021]

食管癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤。外科手術是早期患者主要的治療方法，中晚期患者以放化療為主，但效果欠佳，且毒副作用會加重患者痛苦；中醫(yī)藥治療可幫助食管癌患者術后的調理和恢復，并能配合西醫(yī)，改善患者的生活質量、延長生命，且毒副作用小，有相輔相成之效[1-4]。銀杏葉提取物是從銀杏葉中提取的有藥理活性的混合物，主要成分包括黃酮類、萜內脂類、有機酸類等，具有保護神經(jīng)系統(tǒng)、抗氧化和抗腫瘤等作用[5-6]。有研究報道銀杏葉提取物能誘導乳腺癌MCF-7 細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖[7]；還可能通過抑制核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）信號通路抑制神經(jīng)膠質瘤U87 細胞的增殖和侵襲，促進細胞凋亡[8]；可能通過抑制胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinases, ERK）/NF-κB/基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase, MMP-2）信號通路抑制胃癌的侵襲轉移[9]。然而銀杏葉提取物對食管癌細胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡的影響及機制尚不清楚。

信號轉導子和轉錄激活子3（signal transducer and activator of transcription 3, STAT3）是一種細胞內重要的轉錄因子，在體內可被其最常見的上游激酶——酪氨酸激酶（tyrosine kinase, JAK）磷酸化激活，JAK/STAT3 信號通路的異常活化能促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，JAK/STAT3 信號通路的靶向抑制劑可抑制腫瘤發(fā)展[10-11]。有研究[12]報道LINC01535 通過激活JAK/STAT3 通路促進食管鱗狀細胞癌增殖并抑制凋亡。還有研究報道缺血性腦卒中后銀杏葉提取物可通過抑制JAK2/STAT3 通路抑制星形膠質細胞脂質2（lipocalin-2, LCN2）表達并減輕神經(jīng)炎癥損傷[13]。然而銀杏葉提取物是否通過JAK2/STAT3 信號通路影響食管癌細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移尚不清楚?；诖?，本實驗研究銀杏葉提取物對食管癌細胞EC9706 的增殖、凋亡、侵襲、遷移的影響及其機制是否與JAK2/STAT3 信號通路有關，為中藥治療食管癌提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和儀器

食管癌細胞EC9706 購自上海北諾生物科技有限公司。胎牛血清、RPMI 1640 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司，銀杏葉提取物（純度> 98%）購自上海彩佑實業(yè)有限公司，白細胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）購自上海滬震實業(yè)有限公司，RIPA 蛋白裂解液、二辛可寧酸（BCA）試劑盒、細胞計數(shù)試劑盒8（CCK-8）購自北京凱瑞基生物科技有限公司，膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙錠（PI）凋亡檢測試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司，Transwell 小室、Matrigel 膠購自美國BD 公司，一抗、二抗購自武漢維諾賽生物技術有限公司。CytoFLEX 流式細胞儀購自貝克曼庫爾特公司。

1.2 細胞處理與分組

食管癌細胞EC9706 用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。將EC9706 細胞以每孔10×104個細胞接種到6 孔板中，每孔體積100 μL，分別用100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 的銀杏葉提取物培養(yǎng)，記為不同濃度銀杏葉提取物組，用等量基礎培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞作為對照組，用400 mg/L銀杏葉提取物和20 ng/mL IL-6 培養(yǎng)的細胞為銀杏葉提取物+IL-6 組。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖活性

對照組，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 銀杏葉提取物組，銀杏葉提取物+ IL-6 組，5 組細胞以2×104個/孔接種在6 孔板中，細胞培養(yǎng)48 h，每孔添加10 μL CCK-8 溶液，在酶標儀450 nm 波長處檢測光密度（OD）值，代表細胞增殖活性。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

對照組，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 銀杏葉提取物組，銀杏葉提取物+IL-6 組，5 組細胞以2×104個/孔接種在6 孔板中，細胞培養(yǎng)48 h，室溫下1 000 r/min 離心5 min，收集細胞；用預冷的PBS重懸細胞2 次，1 000 r/min 離心5 min，洗滌細胞；加入300 μL 的1×Binding Buffer 懸浮細胞；重懸后加入10 μL Annexin V-FITC，混勻后4℃避光孵育10 min， 再加入5 μL PI， 避光染色5 min。CytoFLEX 流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 Western blotting 檢測Ki-67、Cleavedcaspase-3、MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對表達量

細胞裂解液提取對照組，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 銀杏葉提取物組，銀杏葉提取物+IL-6 組的細胞總蛋白，用BCA 試劑盒定量。分別取50 μL 各組蛋白，煮沸10 min 變性后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳結束后通過電轉移法將蛋白質轉移至PVDF 膜上，封閉1 h；分別加稀釋的一抗，4℃孵育過夜，次日取出PVDF 膜，PBST 充分漂洗（5 min×3 次），加入稀釋的二抗，室溫孵育60 min，PBST 充分漂洗（5 min×3 次）后，加入化學發(fā)光試劑顯影。β-actin 為內參。用Image J 軟件分析各蛋白條帶的灰度值，蛋白相對表達量=目的條帶/β-actin條帶。其中，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 銀杏葉提取物組檢測Ki-67、Cleaved-caspase-3 蛋白相對表達量；對照組、400 mg/L 銀杏葉提取物組、銀杏葉提取物+IL-6 組檢測MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3 蛋白相對表達量。

1.6 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲

采用8.0 μm 聚碳酸酯膜Transwell 小室進行實驗。遷移實驗：對照組、400 mg/L 銀杏葉提取物組、銀杏葉提取物+IL-6 組細胞用無血清培養(yǎng)基以1×104個/mL 的密度懸浮，將100 μL 懸浮液添加到上室，將600 μL 含血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液添加到下室，溫育48 h 后，用棉簽小心地擦去聚碳酸酯膜表面上未遷移的細胞；4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色30 min，用PBS 輕輕清洗2 次。倒置顯微鏡下觀察細胞計數(shù)。侵襲實驗：用Matrigel膠包被Transwell 小室的上室，其余與細胞遷移實驗步驟相同。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較行t檢驗或方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組EC9706細胞OD值比較

對照組，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 銀杏葉提取物組，銀杏葉提取物+IL-6 組，5 組細胞的OD 值分別為（1.246±0.08）、（1.015±0.09）、（0.602±0.05）、（0.418±0.04）及（1.108±0.11），5 組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=181.344，P=0.000）；進一步兩兩比較，與對照組比較，不同濃度銀杏葉提取物組EC9706 細胞的OD 值均降低（P<0.05），細胞活性降低，且呈濃度依賴性；銀杏葉提取物+IL-6 組與400 mg/L 銀杏葉提取物組比較，銀杏葉提取物+IL-6組EC9706 細胞活性升高（t=17.895，P=0.000）。見圖1。

圖1 各組EC9706細胞OD值的比較

2.2 各組EC9706細胞凋亡率的比較

對照組，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 銀杏葉提取物組，銀杏葉提取物+IL-6 組，5 組的細胞凋亡率分別為（6.29±0.52）%、（10.03±0.91）%、（19.12±1.72）%、（25.09±2.13）%及（9.13±0.82）%，5 組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=301.217，P=0.000）。進一步兩兩比較，與對照組比較，不同濃度銀杏葉提取物組EC9706 細胞凋亡率升高（P<0.05），且呈濃度依賴性；銀杏葉提取物+IL-6 組與400 mg/L 銀杏葉提取物組比較，銀杏葉提取物+ IL-6 組EC9706 細胞凋亡率降低（t=21.639，P=0.000）。見圖2。

圖2 各組EC9706細胞凋亡的流式細胞圖

400 mg/L 銀杏葉提取物能顯著抑制EC9706 細胞增殖和促進細胞凋亡，故選取400 mg/L 銀杏葉提取物為后續(xù)實驗濃度。

2.3 各組細胞Ki-67、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3 蛋白相對表達量的比較

對照組，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 銀杏葉提取物組，銀杏葉提取物+IL-6 組細胞的Ki-67、Cleaved-caspase-3 蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較，100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 銀杏葉提取物組Ki-67 蛋白相對表達量較對照組均降低（P<0.05），銀杏葉提取物+IL-6 組Ki-67 蛋白相對表達量較400 mg/L 銀杏葉提取物組升高（t=23.255，P=0.000）；100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L 銀杏葉提取物組Cleaved-caspase-3 蛋白相對表達量較對照組均升高（P<0.05），銀杏葉提取物+ IL-6 組Cleavedcaspase-3 蛋白相對表達量較400 mg/L 銀杏葉提取物組降低（t=15.363，P=0.000）。對照組、400 mg/L銀杏葉提取物組、銀杏葉提取物+ IL-6 組細胞MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3 蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較，400 mg/L 銀杏葉提取物組較對照組均降低（P<0.05），銀杏葉提取物+IL-6 組較400 mg/L 銀杏葉提取物組均升高（P<0.05）。見圖3、4 和表1、2。

圖3 對照組及不同濃度銀杏葉提取物組細胞Ki-67、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達

圖4 400 mg/L銀杏葉提取物組與銀杏葉提取物+IL-6組細胞Ki-67、Cleaved-caspase-3、MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3蛋白的表達

表1 各組細胞Ki-67、Cleaved-caspase-3蛋白相對表達量的比較 （±s）

表1 各組細胞Ki-67、Cleaved-caspase-3蛋白相對表達量的比較 （±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與100 mg/L 銀杏葉提取物組比較，P <0.05；③與200 mg/L 銀杏葉提取物組比較，P <0.05；④與400 mg/L銀杏葉提取物組比較，P<0.05。

Cleaved-caspase-3 0.29±0.02 0.39±0.03①0.62±0.05①②0.79±0.07①②③0.37±0.03④200.719 0.000組別對照組100 mg/L銀杏葉提取物組200 mg/L銀杏葉提取物組400 mg/L銀杏葉提取物組銀杏葉提取物+IL-6組F 值P 值Ki-67 0.92±0.09 0.82±0.08①0.52±0.05①②0.35±0.03①②③0.88±0.06④130.856 0.000

表2 3組細胞MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對表達量的比較 （±s）

表2 3組細胞MMP-2、MMP-9、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對表達量的比較 （±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與400 mg/L銀杏葉提取物組比較，P<0.05。

組別對照組400 mg/L銀杏葉提取物組銀杏葉提取物+IL-6組F 值P 值p-STAT3 0.72±0.07 0.32±0.03①0.65±0.06②131.075 0.000 MMP-2 0.86±0.08 0.42±0.04①0.82±0.08②111.000 0.000 MMP-9 0.78±0.06 0.30±0.03①0.70±0.06②220.444 0.000 p-JAK2 0.80±0.07 0.42±0.04①0.79±0.07②111.079 0.000

2.4 3組EC9706細胞遷移數(shù)和細胞侵襲數(shù)的比較

對照組、400 mg/L 銀杏葉提取物組及銀杏葉提取物+ IL-6 組EC9706 細胞遷移數(shù)、細胞侵襲數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；進一步兩兩比較，400 mg/L 銀杏葉提取物組EC9706 細胞遷移數(shù)、細胞侵襲數(shù)較對照組減少（t=19.004 和15.264，均P=0.000），銀杏葉提取物+ IL-6 組EC9706 細胞遷移數(shù)、細胞侵襲數(shù)較400 mg/L 銀杏葉提取物組增多（t=18.264 和10.619，均P=0.000）。見表3和圖5。

表3 3組EC9706細胞遷移數(shù)和細胞侵襲數(shù)的比較（個，±s）

表3 3組EC9706細胞遷移數(shù)和細胞侵襲數(shù)的比較（個，±s）

組別對照組400 mg/L銀杏葉提取物組銀杏葉提取物+IL-6組F 值P 值細胞遷移數(shù)152.22±13.15 61.02±5.86 141.06±11.23 200.428 0.000細胞侵襲數(shù)112.43±10.08 56.49±4.39 96.06±9.14 109.255 0.000

圖5 3組EC9706細胞的遷移和侵襲 （倒置顯微鏡×200）

3 討論

中醫(yī)藥在防治食管癌術后的并發(fā)癥、減輕放化療的毒副作用等方面起重要作用，能延長患者的生存期、提高患者的生活質量，提高患者的綜合治療效果[14-16]。有研究[17]報道銀杏葉提取物能夠抑制甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲、遷移能力，還能通過調控凋亡相關蛋白p53、Bcl-2、Bax 的表達而促進細胞凋亡，且呈現(xiàn)濃度依賴性。銀杏葉提取物還可通過調控PI3K/Akt 信號通路抑制甲狀腺癌TPC-1 細胞株的增殖[18]。銀杏葉提取物可抑制小鼠黑素瘤B16 細胞增殖，使細胞周期阻滯于G0/G1期，并誘導細胞凋亡[19]。銀杏葉提取物可能通過抑制蛋白激酶B（protein kinase B, Akt）和p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases, p38 MAPK）通路下調熱休克蛋白27（heat-shock protein 27, HSP27）的表達，從而降低非小細胞肺癌細胞系A549 和H441 的遷移能力[20]。本研究結果顯示，不同濃度銀杏葉提取物組食管癌細胞EC9706 與對照組比較，Ki-67、MMP-2、MMP-9 蛋白表達降低，Cleavedcaspase-3 蛋白表達升高，細胞活性降低，細胞凋亡率升高，細胞遷移數(shù)和細胞侵襲數(shù)降低。表明銀杏葉提取物可抑制食管癌細胞EC9706 增殖、侵襲、遷移，并促進細胞凋亡。

JAK/STAT3 信號通路是細胞信號通路中重要的信號傳導通路之一，對細胞凋亡和增殖有關鍵作用，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[21]。有研究[22]表明中醫(yī)藥可通過調節(jié)JAK/STAT3 信號通路影響腫瘤的進展，如姜黃素可以通過抑制JAK/STAT3 信號通路促進骨巨細胞瘤的凋亡，抑制其遷移、侵襲。竹節(jié)香附素通過抑制JAK/STAT3 信號轉導通路抑制人子宮內膜癌HEC-1-B 細胞的侵襲轉移[23]。黃芪多糖可能通過沉默JAK2/STAT3/c-myc 信號通路抑制口腔鱗癌細胞SCC-25 移植瘤的生長[24]。本研究結果顯示，銀杏葉提取物處理的食管癌細胞EC9706 中p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達降低，這提示銀杏葉提取物可抑制JAK2/STAT3 信號通路的激活。有研究[25]表明IL-6可激活JAK/STAT3 信號通路，因此本研究用IL-6 和銀杏葉提取物同時作用食管癌細胞EC9706，研究激活JAK/STAT3 信號通路是否影響銀杏葉提取物對食管癌細胞EC9706 的作用。本研究結果顯示，經(jīng)過IL-6 處理后，EC9706 細胞活性升高，凋亡率降低，細胞遷移數(shù)、細胞侵襲數(shù)增多，表明IL-6 可以逆轉銀杏葉提取物對EC9706 細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響。經(jīng)過IL-6 處理后，細胞中Ki-67、MMP-2、MMP-9 蛋白表達均升高，Cleaved-caspase-3、p-JAK2、p-STAT3 蛋白表達均降低，表明IL-6 可通過激活JAK2/STAT3 信號通路作用于食管癌細胞EC9706。

綜上所述，銀杏葉提取物可能通過阻斷JAK2/STAT3 信號通路抑制食管癌細胞EC9706 增殖、侵襲、遷移，促進細胞凋亡。