1例宏基因二代測(cè)序提示鉤端螺旋體感染患者的實(shí)驗(yàn)室診斷

孫愛猛 ,周信云 ,羅瀅娟 ,朱端昊 ,熊長輝

鉤端螺旋體病(簡稱鉤體病)是由致病性鉤端螺旋體引起的一種急性全身感染性疾病,屬于自然疫源性疾病[1]。鉤端螺旋體病在發(fā)病早期有高熱、全身酸痛、軟弱無力等癥狀,隨著病程延長,會(huì)引起肺彌漫性出血、心肌炎、呼吸功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥,甚至威脅患者生命[2]。由于鉤端螺旋體病臨床表現(xiàn)多樣性和鉤端螺旋體實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的特殊性,很多病例被漏診,現(xiàn)就對(duì)一不明原因發(fā)熱伴呼吸困難患者實(shí)驗(yàn)室診斷為鉤端螺旋體感染病例進(jìn)行闡述。

1 資料與方法

1.1 病例資料 2021年7月一患者,男,58歲,因乏力、咳嗽伴發(fā)熱自行口服感冒類藥物,癥狀無緩解,2 d后癥狀加重并出現(xiàn)呼吸困難住進(jìn)ICU。胸部X 線片示:雙肺紋理增多,呈毛玻璃樣改變,可見分布均勻、大小一致的斑片狀陰影,密度低,邊界模糊。采集呼吸道標(biāo)本做新型冠狀病毒特異性核酸片段,結(jié)果為陰性。采集呼吸道標(biāo)本和血液標(biāo)本做常規(guī)實(shí)驗(yàn)室病原分離培養(yǎng),未培養(yǎng)出可疑致病菌。根據(jù)?中國宏基因組學(xué)第二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)感染病原體的臨床應(yīng)用專家共識(shí)?[3]和?宏基因組高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病病原檢測(cè)中國專家共識(shí)?[4],采集患者肺泡灌洗液進(jìn)行m NGS檢測(cè)提示有鉤端螺旋體感染的可能,繼而采集患者血液和尿液做病原分離培養(yǎng)和特異性核酸片段檢測(cè),結(jié)果均為陰性,但患者血清抗體檢測(cè)(MAT 法)出致病性鉤端螺旋體澳洲型滴度為1∶800,患者被確診為致病性鉤端螺旋體澳洲型感染。臨床及時(shí)采用抗鉤端螺旋體藥物(用藥包括青霉素、氫化可的松等)治療后患者病情好轉(zhuǎn)。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查,該患者于7月初在自家附近的小河捕過魚,并且該地區(qū)往年鉤端螺旋體監(jiān)測(cè)中在老鼠體內(nèi)分離到過陽性菌株,該患者這次發(fā)病可能是接觸疫水感染所致。

1.2 方 法

1.2.1 肺泡灌洗液m NGS檢測(cè) 分析采集患者肺泡灌洗液送予果生物科技(北京)有限公司做m NGS檢測(cè),采用QIAseq Ultralow Input Library Kit構(gòu)建文庫,采用Illumina Nextseq550Dx測(cè)序平臺(tái)對(duì)構(gòu)建好的文庫測(cè)序,使用SNAP軟件篩除測(cè)序數(shù)據(jù)中的人源序列;最終獲得的數(shù)據(jù)使用Burrow-Wheeler Aligner軟件進(jìn)行分析,評(píng)估樣本中微生物的種類和是否有致病性病原微生物存在的可能。

1.2.2 Real-time PCR檢測(cè)根據(jù)肺泡灌洗液m NGS檢測(cè)分析結(jié)果的提示,用Real-time PCR 檢測(cè)方法對(duì)患者肺泡灌洗液、血液和尿液進(jìn)行鉤端螺旋體特異性基因檢測(cè)。核酸提取采用天根生化科技(北京)有限公司的核酸提取試劑盒進(jìn)行提取,提取方法參考試劑盒說明書。鉤端螺旋體特異性基因Real-time PCR 擴(kuò)增采用深圳市生科源技術(shù)有限公司試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考檢測(cè)試劑盒說明書。

1.2.3 病原體分離培養(yǎng) 按照WS290-2008?端螺旋體病診斷標(biāo)準(zhǔn)?[5]采集患者血液和尿液培養(yǎng)分離鉤端螺旋體的病原:通過無菌操作采集患者血液接種3管EMJH 培養(yǎng)基中,每管接種1～3滴,通過無菌操作采集患者中段尿50 m L于4 000 r/min離心1 h后取沉渣接種4 管EMJH 培養(yǎng)基中,每管0.3 m L,血培養(yǎng)管和尿培養(yǎng)管均于28 ℃培養(yǎng),每隔5～7 d取培養(yǎng)物于暗視野顯微鏡下觀察有無鉤端螺旋體生長。

1.2.4 顯微鏡凝集實(shí)驗(yàn)(MAT) 按照WS290-2008?端螺旋體病診斷標(biāo)準(zhǔn)?[5]采集患者血清進(jìn)行鉤端螺旋體MAT 檢測(cè),以檢測(cè)患者血清抗體滴度和鉤端螺旋體感染型別:患者血清于56℃水浴箱中滅活30 min后作定性試驗(yàn),即以生理鹽水做1∶50稀釋,分別取稀釋好的血清50μL與50μL 15個(gè)代表株的培養(yǎng)液混勻后于37 ℃孵育1.5～2 h,用生理鹽水做對(duì)照。取孵育后的反應(yīng)液于暗視野顯微鏡下觀察凝集情況。若患者稀釋血清與某一群鉤端螺旋體抗原發(fā)生凝集則說明血清中該群鉤端螺旋體抗體滴度是1∶100,則需要進(jìn)一步稀釋患者血清檢測(cè)該群鉤端螺旋體抗體的滴度。

2 結(jié)果

2.1 肺泡灌洗液m NGS 檢測(cè)結(jié)果 肺泡灌洗液m NGS檢測(cè)結(jié)果提示有鉤端螺旋體感染的可能。m NGS結(jié)果顯示鉤端螺旋體屬序列數(shù)51,問號(hào)鉤端螺旋體特異系列數(shù)51,置信度高,相對(duì)豐度1.43%,覆蓋度0.08%。

2.2 Real-time PCR 檢測(cè)結(jié)果 用Real-time PCR檢測(cè)方法對(duì)患者肺泡灌洗液、血液和尿液進(jìn)行鉤端螺旋體特異性基因檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

2.3 病原體分離培養(yǎng)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)室對(duì)患者血液、尿液進(jìn)行鉤端螺旋體的分離培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。

2.4 顯微鏡凝集實(shí)驗(yàn)(MAT)結(jié)果 血清抗體檢測(cè)(MAT)致病性鉤端螺旋體澳洲型滴度為1∶800(見圖1)。

圖1 致病性鉤端螺旋體澳洲型MAT結(jié)果(200×)Fig.1 Results of the MAT of pathogenic Leptospira australis type(200×)

3 討論

鉤端螺旋體病是熱帶亞熱帶地區(qū)常見的傳染病,尤其是以農(nóng)業(yè)為主以及洪澇災(zāi)害多發(fā)的地區(qū),對(duì)老百姓的身體健康危害非常大,是我國南方省份需要重點(diǎn)防治的傳染病之一[6]。鉤端螺旋體病臨床表現(xiàn)復(fù)雜,臨床型別多,從輕微的感冒癥狀到嚴(yán)重的多器官衰竭并無典型的特異性,這給臨床診斷帶來極大困難,很多病例被漏診,所以鉤端螺旋體病的診斷在一定程度上需要依靠實(shí)驗(yàn)室的輔助檢測(cè)。目前實(shí)驗(yàn)室的病原分離培養(yǎng)和MAT 仍是診斷和監(jiān)測(cè)鉤體的金標(biāo)準(zhǔn)[7-8]。但是病原體培養(yǎng)法培養(yǎng)時(shí)間較長,對(duì)鉤端螺旋體活菌培養(yǎng)一般需要2周以上;MAT 則需要將鉤端螺旋體標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)至一定濃度,再將活的標(biāo)準(zhǔn)菌株與待檢血清一起孵育培養(yǎng),且需要人工借助暗視野顯微鏡觀察[9]。因此,培養(yǎng)法和MAT 都不能對(duì)人群行大規(guī)模的快速篩查,也不能對(duì)鉤端螺旋體病進(jìn)行早期診斷。

隨著分子檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展,采用普通PCR[10]和Taq Man Real-time PCR[11-12]技術(shù)檢測(cè)鉤端螺旋體特異性核酸在一定程度提高了鉤端螺旋體病的診斷水平。PCR 檢測(cè)對(duì)樣本采集、實(shí)驗(yàn)環(huán)境和條件要求較高,并且一對(duì)PCR 擴(kuò)增引物只能獲取某一特定目的DNA 片段,如果病例懷疑有哪些病原感染的可能,PCR 檢測(cè)就要選擇相對(duì)應(yīng)病原的引物進(jìn)行擴(kuò)增,這在不明原因引起的病例檢測(cè)中對(duì)某種病原某種引物的選擇較難。特別是像鉤端螺旋體病臨床表現(xiàn)復(fù)雜,侵犯的人體臟器多、臨床型別多、病原種群多的這種病原感染無論是臨床醫(yī)師的初診還是實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)都帶來了很大的挑戰(zhàn)。Wilson等[13]在2014 年對(duì)一例患者的腦脊液進(jìn)行高通量測(cè)序提示該患者可能為鉤端螺旋體感染,實(shí)驗(yàn)室通過PCR 和血清抗體檢測(cè)也證實(shí)了該患者為鉤端螺旋體感染,這是較早將高通量測(cè)序應(yīng)用病原感染的檢測(cè)。2019 年Xie等[14]應(yīng)用m NGS 診斷管圓線蟲嬰兒嗜酸性腦膜炎的病例顯示m NGS 是一種新的精確度較高的診斷技術(shù),能幫助實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)出更多的病原體。Zhang等[15]2019 年也將m NGS 技術(shù)應(yīng)用于腦膜炎的診斷中,檢測(cè)出了人皰疹病毒。此外,還有學(xué)者探討了病原微生物m NGS 在局灶性感染中的應(yīng)用價(jià)值,發(fā)現(xiàn)其檢測(cè)的陽性臨床符合率明顯高于常規(guī)檢測(cè)法及培養(yǎng)法,且可能不受標(biāo)本采集前抗菌藥物使用的影響[16]。

在本文病例的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中,常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)均不能提示是何種病原感染,經(jīng)對(duì)患者肺泡灌洗液進(jìn)行m NGS檢測(cè)提示有鉤端螺旋體感染的可能,繼而采集患者血液和尿液做病原分離培養(yǎng)和特異性核酸片段檢測(cè),但結(jié)果均為陰性,后經(jīng)患者血清抗體檢測(cè)(MAT)確診為致病性鉤端螺旋體澳洲型感染。這提示我們?cè)趯?duì)鉤端螺旋體的實(shí)驗(yàn)室診斷中新型的檢測(cè)技術(shù)和傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)有機(jī)結(jié)合,互相驗(yàn)證,才能提高鉤端螺旋體病的診斷。

利益沖突:無

引用本文格式:孫愛猛,周信云,羅瀅娟,等.1例宏基因二代測(cè)序提示鉤端螺旋體感染患者的實(shí)驗(yàn)室診斷[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào),2022,38(6):478-480,485.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.092