福建省北部地區(qū)鼠類鉤端螺旋體感染狀況及分離株分子特征研究

劉維俊，王加熊，肖方震,2，韓騰偉，劉 菁，曾志偉，徐國英,2

鉤端螺旋體病(簡稱鉤體病)是由致病性鉤端螺旋體導致的、在全球范圍內(nèi)廣泛傳播的人獸共患病，年均造成超過百萬人感染，并有接近60 000例死亡病例，給全球公共衛(wèi)生帶來極大負擔。長期以來鉤體病被認為是一種與經(jīng)濟條件低下、基礎(chǔ)設(shè)施差有關(guān)的疾病，常常受到忽視，被世界衛(wèi)生組織列為被忽視的熱帶疾病[1-3]。我國絕大多數(shù)省份都有鉤體病病例的報道，對農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)等相關(guān)行業(yè)造成了很大的危害，已納入乙類法定傳染病管理[4-5]。

鼠類是鉤端螺旋體的主要宿主，人類可通過接觸被感染的動物組織、排泄物或者接觸被污染的水體感染鉤端螺旋體[6]。對動物宿主的監(jiān)測和研究，確定當?shù)劂^端螺旋體的流行菌群，對鉤端螺旋體病的預防、診斷以及控制起著十分重要的作用[7]。

福建地處我國東南沿海，屬亞熱帶濕潤性氣候，閩北地區(qū)林業(yè)資源豐富，十分適合鼠類動物生存繁殖?，F(xiàn)有資料顯示，閩北地區(qū)是福建省鉤體病病例主要來源地之一[8]。雖然21世紀后，福建省鉤端螺旋體疫情總體穩(wěn)定，但仍有局部散發(fā)病例存在，對鉤端螺旋體病的防控依然不能放松[9]。此次調(diào)查選擇閩北地區(qū)作為調(diào)查點，旨在進一步了解閩北地區(qū)鼠類鉤端螺旋體感染情況及分子特征，為后續(xù)研究及防控提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 標本采集 2018-2020年每年5-10月，在南平市延平區(qū)、建陽區(qū)、邵武市、浦城縣、順昌縣、松溪縣6個地區(qū)設(shè)置調(diào)查點，采用籠日法捕鼠，鼠籠晚放晨收，捕獲的鼠類經(jīng)形態(tài)學鑒定及DNA條形碼鑒定鼠種后，記錄采樣時間、鼠種、性別、捕獲生境等信息，解剖取鼠腎組織置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 鉤端螺旋體菌株分離 無菌取雙側(cè)腎米粒大小組織一塊，分別接種2管EMJH培養(yǎng)基(每mL培養(yǎng)基中含250 μg的5-氟脲嘧啶)，于28 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔5～7 d，以無菌操作取培養(yǎng)物置于清潔玻片上，在暗視野顯微鏡下觀察有無鉤體生長。如有生長，即接種于新鮮培養(yǎng)基中，每管接種量為0.5 mL左右，每份標本同時接種2管，如未見鉤體生長，繼續(xù)培養(yǎng)60 d，仍不生長者作為陰性處理[10]。

1.3 核酸提取與檢測 鼠腎標本的核酸提取采用Qiagen血液和組織提取試劑盒，鉤端螺旋體分離株的核酸提取采用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒。分別采用鉤端螺旋體特異性引物(表1)進行PCR擴增，PCR體系為20 μL，其中，Premix Taq 10 μL,上下游引物各0.5 μmol/L，模板1 μL，無菌水補足至20 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共設(shè)35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并交由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 鉤端螺旋體檢測及基因種分型特異性引物Tab.1 Primers for detection and typing of Leptospira

1.4 血清群鑒定 采用暗視野顯微鏡凝集試驗(Microscopic agglutination test，MAT)對分離株進行血清群鑒定。試驗所使用的15群15型鉤端螺旋體參考菌株診斷血清來源于中國食品藥品檢定研究所。以在暗視野顯微鏡下出現(xiàn)50%及以上菌體凝集為標準鑒定分離株的血清群。

1.5 基因種鑒定 鉤端螺旋體分離株采用16SrRNA進行基因種分型，引物序列見表1，PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 15 s，50 ℃ 5 s，72 ℃ 90 s，共設(shè)35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并交由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。所得序列在NCBI平臺上進行同源性比對，選取合適的菌株序列作為參考株，在Mega 6.0軟件上進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。

1.6 多位點序列(MLST)分型 選取7種管家基因引物[11](表2)進行不同位點的擴增，擴增產(chǎn)物交由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。所得序列上傳PubMLST數(shù)據(jù)庫(https://pubmlst.org)進行等位基因的比較，明確菌株的ST型。

表2 MLST分型引物序列Tab.2 Primers for MLST analysis

1.7 脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型 鉤端螺旋體菌株P(guān)FGE按照參考文獻[12]所述方法進行，鉤端螺旋體參考菌株來源于中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，并由本研究室進行傳代保存。電泳圖譜采用BioNumerics軟件進行處理與分析。

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，感染率的比較采用χ2檢驗。檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 鼠種構(gòu)成 此次調(diào)查共捕獲鼠類227只，其中家棲鼠134只，野棲鼠93只；雄性鼠114只，雌性鼠113只。家棲鼠中褐家鼠69只，占比51.49%(69/134)；黃胸鼠65只，占比48.51%(65/134)。野棲鼠以針毛鼠為主，占44.09%(41/93)，其次為黑線姬鼠、黃毛鼠、社鼠，分別占比為13.98%(13/93)、12.90%(12/93)和11.83%(11/93)。

2.2 鉤端螺旋體檢出情況 227只捕獲鼠中共檢出感染鉤端螺旋體的鼠類27只，檢出率為11.89%。不同鼠種的檢出情況各不相同，閩北地區(qū)野外優(yōu)勢鼠種黑線姬鼠與針毛鼠的感染率分別為46.15%(6/13)和41.46%(17/41)，見表3。134只家棲鼠中僅檢出1只褐家鼠感染鉤端螺旋體，93只野棲鼠中共檢出26只鼠類感染鉤端螺旋體，檢出率分別為0.75%和27.96%，二者差異有統(tǒng)計學意義(χ2=38.788，P<0.01)。此外，雄性鼠的鉤端螺旋體感染率(16.67%，19/114)高于雌性鼠(7.08%，8/113)(χ2=4.977，P<0.05)。

表3 不同鼠種鉤端螺旋體感染狀況Tab.3 Leptospira infection status in various rodent species

2.3 病原分離培養(yǎng) 從野棲鼠腎中共分離培養(yǎng)獲得4株鉤端螺旋體菌株，分離率為1.76%。分離到的菌株在暗視野顯微鏡下觀察呈現(xiàn)游離狀態(tài)，兩端或一端彎曲呈鉤狀、運動非?；顫?。

2.4 血清群鑒定 4株分離株經(jīng)MAT鑒定均為黃疸出血群(表4)。

2.5 基因種鑒定 測序所得序列分別與GenBank收錄的核苷酸序列進行比對。如圖1所示，采集自建陽市的JY19、JY37和采集自浦城縣PC29、PC30的16SrRNA片段與登錄號為JQ988857.1的Leptospirainterrogans相似性最高，分別為97.93%、99.38%、98.10%和99.38%。構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹顯示，該4株鉤端螺旋體的16SrRNA基因分型均為Leptospirainterrogans型與同屬于致病性鉤端螺旋體的Leptospiraalexanderi、Leptospirasantarosai、Leptospiraweilii等及非致病性鉤端螺旋體的Leptospirabiflexa、Leptospirameyeri歸屬于不同分支。

圖1 基于鉤端螺旋體16S rRNA構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on Leptospira 16S rRNA

2.6 MLST分型 4株鉤端螺旋體分離株中，共分為2個ST型，其中分離自建陽的2株鉤端螺旋體為ST17型，分離自浦城的2株鉤端螺旋體為ST1型，ST型的分布表現(xiàn)出一定程度上的地域差異(表4)。

表4 鉤端螺旋體分離株分型結(jié)果Tab.4 Typing results of Leptospira isolates

2.7 PFGE分型 4株鉤端螺旋體分離株及8株福建省常見鉤端螺旋體血清群標準菌株經(jīng)限制性內(nèi)切酶NotI酶切后，產(chǎn)生11～12條條帶的PFGE圖譜(圖2)。4株分離株共產(chǎn)生2種PFGE帶型，其中分離自浦城鼠腎標本的分離株P(guān)C29、PC30與本研究室傳代保存的鉤端螺旋體黃疸出血群參考菌株56601帶型完全一致。分離自建陽鼠腎標本的分離株JY19、JY37帶型一致，但與黃疸出血群參考菌株56601的帶型有明顯的區(qū)別，與波摩那群參考菌株56608聚類關(guān)系較近，相似性達到61.9%，見圖3。4株分離株的PFGE帶型呈現(xiàn)出地域差異。

注：H為沙門菌株H9812，I為鉤端螺旋體黃疸出血群參考菌株56601。圖2 閩北地區(qū)鉤端螺旋體分離株P(guān)FGE電泳圖譜Fig.2 PFGE electrophoresis maps of Leptospira isolates from northern Fujian

圖3 閩北地區(qū)鉤端螺旋體分離株P(guān)FGE聚類分析圖Fig.3 PFGE cluster dendrogram of Leptospira isolates from northern Fujian

3 討 論

鼠類分布廣泛，與人類活動關(guān)系密切，是鉤端螺旋體的重要宿主。對鼠類的鉤端螺旋體監(jiān)測有助于了解當?shù)厥箝g病原攜帶情況，幫助防控人員開展有針對性的風險評估和滅鼠工作。閩北地區(qū)作為福建省鉤端螺旋體病的老疫源地之一，在早期的文獻資料中已有鉤端螺旋體病的記載，但近幾年相關(guān)數(shù)據(jù)較少，在一定程度上影響了疾病風險評估的準確性。

21世紀以來，福建省人間鉤體病疫情趨于下降或平穩(wěn)，但鼠血清鉤端螺旋體抗體檢測陽性率仍處于較高水平，且以閩北為最，提示福建省鉤體病仍存在局部暴發(fā)流行的可能[13]。此次調(diào)查結(jié)果表明閩北地區(qū)鼠類動物中普遍存在鉤體感染，野棲鼠的感染率高于家棲鼠，閩北地區(qū)優(yōu)勢鼠種針毛鼠和黑線姬鼠有較高的鉤端螺旋體感染率，說明閩北地區(qū)仍然存在鉤端螺旋體暴發(fā)的可能性，應進一步加強對鼠類鉤端螺旋體病的監(jiān)測工作，防止鉤端螺旋體疫情的發(fā)生和反彈。

鉤端螺旋體菌株分子特征的研究對于實施有效的預防措施，降低疾病傳播的風險至關(guān)重要[14]。張翠彩等[14-15]在對江西省鼠類攜帶鉤端螺旋體的調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)，L.interrogans為江西省最主要的基因種，在與閩北地區(qū)相鄰的上饒市，該基因種的占比高達95%。MLST分型結(jié)果表明，ST1型為江西省鼠類鉤端螺旋體的優(yōu)勢ST型別。李世軍等[16-17]報道貴州省2007-2011年間的7株鉤端螺旋體分離株的基因種均為L.interrogans。Izquierdo-Rodríguez等[18]在法國科嘉西島嚙齒動物中發(fā)現(xiàn)L.interrogans感染。Schmidt等[19]報道德國西北部地區(qū)感染鉤端螺旋體的田鼠中L.interrogans占83.3%，L.kirschneri占11.5%，L.borgpetersenii占5.2%，并且L.interrogans均為ST24型，L.kirschneri均為ST110型，L.borgpetersenii均為ST197型，當?shù)厥箢愩^端螺旋體的基因種與ST型呈現(xiàn)高度的一致性。綜上所述，L.interrogans可能是國內(nèi)及國際鼠類攜帶的鉤端螺旋體常見基因種，且不同地區(qū)和國家還存在其特定的基因種。

PFGE作為一種對細菌完整基因組進行圖譜分析的分子分型手段，以其分辨力高，可重復性好等優(yōu)點，在分子流行病學研究中得到廣泛的應用，被譽為細菌分子分型技術(shù)的“金標準”[20]。Herrmann等[21]的研究表明鉤端螺旋體的PFGE分型與血清學分型有較高的一致性。雖然本研究中JY19、JY37兩株分離株在PFGE帶型上與波摩那群參考株聚類較近，但相似度僅為61.9%。根據(jù)嚴杰等[10]提出的相似度大于75%可判定為同一個血清群的標準，JY19、JY37兩株分離株與波摩那群參考株不可判定為同一血清群，這與劉英等[22]對貴州省鼠中分離株黃疸出血群PFGE帶型的多樣性研究結(jié)果一致，也符合同一血清群菌株間的PFGE帶型的多樣性。

本研究應用多種分子分型手段對閩北地區(qū)鼠類鉤端螺旋體的分子特征做了描述，但仍存在一定的不足。一是閩北地區(qū)鼠類多樣性高，但本研究中部分鼠種的樣本數(shù)量不多，其鉤端螺旋體感染情況與檢測結(jié)果可能存在一定偏差。二是鉤端螺旋體分離率較低，導致部分鼠種的鉤端螺旋體分子特征無法得知。今后將繼續(xù)擴大鼠類樣本量，提高陽性樣本的菌株分離率，爭取對閩北地區(qū)鉤端螺旋體的分子特征有更系統(tǒng)的掌握。

利益沖突：無

引用本文格式：劉維俊，王加熊，肖方震，等.福建省北部地區(qū)鼠類鉤端螺旋體感染狀況及分離株分子特征研究[J]．中國人獸共患病學報，2022，38(9)：807-812.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.123