大氣氣溶膠微生物群落的分子生物學檢測和監(jiān)測方法的研究進展

周小軍，付瑩瑩 綜述，王紅昌，賈銳 審校

中國生物技術股份有限公司生物安全管理部，北京 100025

微生物在環(huán)境中無處不在，并且在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要功能［1］。氣溶膠是指固體或液體小質點分散并懸浮在氣體介質中形成的膠體分散體系，生物氣溶膠是指含有生物性粒子的氣溶膠，主要包括細菌、真菌、病毒、致敏花粉、霉菌孢子、蕨類孢子、寄生蟲卵以及很多抗原化合物、微生物毒素等［2］。據估計，大氣中初級氣溶膠有16% ～80%來自生物性粒子。室內或室外環(huán)境下對生物氣溶膠的暴露被認為與一系列有害健康的影響有關，如呼吸系統(tǒng)疾病、過敏和癌癥等［3-4］。

生物氣溶膠組分大小各異，通常情況下，植物花粉直徑在17 ～58 μm 之間，真菌孢子直徑在1 ～30 μm 之間，細菌直徑在0.25 ～8 μm 之間，病毒直徑一般小于0.3 μm。生物性粒子有時會形成復合體，研究顯示，內陸區(qū)域大部分細菌會與直徑大于3 μm的粒子結合，如空氣傳播的植物或動物組分、土壤顆粒、孢子等［5］。空氣傳播細菌和真菌能分別達到103和105個／ m3，氣溶膠化的細菌和真菌能達到10 ～20 km 高度的對流層，甚至能達到海上20 ～40 km高度的平流層［6］。

越來越多的證據表明，生物氣溶膠通過影響大氣的物理和化學過程進而影響大氣環(huán)境［7］，大氣中微生物群落結構隨時間的改變與大氣的物理、化學特征顯著相關［8］。但關于大氣中生物氣溶膠組分及其變化與地理或氣象條件的關系卻知之甚少。對于現場條件下空氣傳播微生物物種的準確評估很困難，影響因素包括采樣器的收集效率、不同微生物物種的活力差異、同一物種不同株的區(qū)分等。本文對生物氣溶膠對公眾健康的影響、不同采樣方法以及微生物物種鑒定的分析方法等作一綜述。

1 生物氣溶膠對人體健康的有害影響

生物氣溶膠由致病性或非致病性細菌、真菌、病毒、高分子量過敏原、細菌內毒素、霉菌毒素、肽聚糖、β（1→3）聚糖、花粉、植物纖維等成分組成［3］，其對于人體健康影響最明確的是呼吸系統(tǒng)。植物花粉、真菌孢子、細菌內毒素等均與哮喘癥狀的發(fā)生有關［3，9-10］。通常作為水質指示物的大腸埃希菌被發(fā)現存在于室內和室外空氣粉塵中［11］，表明某些經糞口途徑傳播的潛在致病性微生物還可通過空氣傳播或食物污染等方式威脅公眾健康，目前尚未發(fā)現吸入含此類病原體的粉塵會導致人體呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生［12］。

風飏粉塵是生物氣溶膠領域研究較多的一種，其起源于世界各地干旱地區(qū)，如沙哈拉沙漠、中東亞、中東地區(qū)等，且對人體健康和下風向環(huán)境均有影響［12-13］。研究表明，風飏粉塵含有一些條件致病菌，如Aspergillus fumigatus、Aspergillus niger、Staphylococcus gallinarum、Gordonia terrae［14］，但尚無報道發(fā)現風飏粉塵的長距離轉運與人體感染性疾病有關。

盡管生物氣溶膠暴露對人體健康的有害影響正引起越來越多的關注，但造成這些影響的特定組分卻不明確。由于不同種微生物在潛在致病性上差異顯著，對生物氣溶膠過敏原和病原體的鑒定需達到種甚至是株的水平。此外，有關生物氣溶膠引起疾病癥狀的發(fā)生、進展的主要機制和作用的研究仍不夠深入［15-16］。盡管世界衛(wèi)生組織（WHO）以及美國國家環(huán)境保護局（US EPA）發(fā)布的指南提供了能用于微生物危險鑒定的方法，但目前關于微生物及其有害影響的劑量效應的研究和相關閾值的認知仍不足［17］，主要原因是缺少準確、可定量、綜合的暴露評估方法以檢測生物氣溶膠中微生物病原體。病原體檢測技術上的進展較多使用的是分子生物學方法［18-19］。

2 生物氣溶膠的檢測和監(jiān)測

2.1采樣方法

生物氣溶膠研究目前主要聚焦于對周圍或目標生物氣溶膠的監(jiān)測和控制，對生物氣溶膠的有效監(jiān)測需對空氣中微生物物種進行有效采集。已建立了一系列生物氣溶膠采樣方法，同時已開發(fā)許多顆粒采樣設備［2，17］。不同設備有各自的優(yōu)缺點，多數情況下研究目的決定了合適采樣方法的選擇［6］。對數據分析而言，采樣地點的準確選取也至關重要。3種主要的采樣方法（過濾式、固體撞擊式、液體撞擊式）用于生物氣溶膠采集。

2.1.1過濾式 是大氣生物氣溶膠采樣中應用最廣泛的方法之一，其原理為將空氣泵入多孔的濾膜以捕獲生物性粒子，其優(yōu)點在于廣泛適用性、高效捕獲效率、低成本性、高便攜性等。濾膜材料包括纖維素膜、尼龍膜、聚碳酸酯膜、玻璃纖維，常用孔徑為0.02 μm。過濾采樣氣流速率通常在300 ～1 000 L ／ min［2，14］，不同孔徑不同材料的濾膜對于直徑低至0.035 μm的粒子采集效率通常大于95%［20］。過濾法可用于細菌、真菌、花粉、病毒等采集，通過膜過濾法采集的生物性粒子活性不受影響，甚至能吸收空氣中水分和養(yǎng)分而生長，環(huán)境壓力改變引起的反向氣流可能導致膜上收集的生物性粒子重懸到空氣中。能形成孢子的微生物在過濾法收集后更易于被回收。為了能解決以上問題和沉積生物氣溶膠，開展新過濾材料研究十分必要。

2.1.2固體撞擊式 是通過氣泵在含營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿（也可是盒狀或條狀）捕獲生物氣溶膠粒子，通過窄縫或孔洞控制上方氣流分布均勻，同時能控制不同大小粒子的運動方向。該方法采集氣流速度在10 ～700 L ／ min［14］。孢子陷阱、玻璃平板級聯采集器、MOUDI 采集器等均成功應用于真菌和細菌采集及后續(xù)PCR 反應等［21-22］。該方法的優(yōu)點為簡便易攜帶、成本低以及可評估單位體積空氣中可培養(yǎng)的細菌和真菌數量；缺點為低氣流速率導致采樣體積小、撞擊導致活性降低、因未能吸附于瓊脂表面而導致微生物物種回收效率下降［14］。

2.1.3液體撞擊式 生物氣溶膠也可通過液體撞擊式采樣器得到收集，以常用的AGI-30 液體式采樣器為例，可實現低流速有效采集。該方法的優(yōu)點為成本不高，采樣的樣本可用于培養(yǎng)或直接計數、分子實驗等非培養(yǎng)多種分析用途［14］；缺點為玻璃容器易碎、采集速率低、成本高、因揮發(fā)或劇烈產生氣泡而損失、對病毒大小粒子的捕獲效率低、活性損失等［23］。

2.2空氣傳播微生物物種的培養(yǎng)鑒定法 傳統(tǒng)的空氣生物學研究聚焦于細菌的采集以及通過計數和培養(yǎng)的方法對樣本進行分析，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法一般通過標準方法（如國際標準化組織ISO 提供的方法）來建立并用于微生物物種的分析和微生物危害評估，主要通過選擇性液體或固體培養(yǎng)基來分離和擴增目標微生物，同時阻止其他微生物的生長。

傳統(tǒng)培養(yǎng)法的局限在于總體計數耗費時間、人力，對微生物物種的鑒定也存在問題，如在特定時間和實驗條件下，一些具有潛在健康危害的微生物物種無法實現培養(yǎng)，研究表明，大部分微生物被認為具有活性，但不在瓊脂平板上形成菌落［2］。另外，具有毒性或過敏原性的細菌碎片、死亡微生物以及其他微生物組分也無法被檢測［3，14，24］。

2.3 空氣傳播微生物物種的非培養(yǎng)依賴鑒定法 非培養(yǎng)依賴法已應用于空氣微生物學研究的諸多領域［25-28］，在微生物多樣性評估方面可提高細菌鑒定的特異性和環(huán)境研究的敏感性，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比具有一定的優(yōu)勢［29］。分子生物學方法的高靈敏性和特異性以及快速的特點使其在環(huán)境質量和空氣病原微生物監(jiān)測中得到應用［30-31］。

PCR 是微生物物種檢測的一種標準方法，通過特定引物和熱穩(wěn)定的DNA 聚合酶實現對目標DNA區(qū)域的對數級擴增［32］，由于是對目標DNA 而非信號的擴增，更不易產生假陽性。PCR 法為霧霾成分PM10 和PM2.5 中有機成分的描述、公共衛(wèi)生研究中感染性和過敏性物質的追蹤以及大氣微生物生態(tài)學研究提供了具體的生物量信息［2］。

其他分子生物學工具，如變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、末端限制性片段長度多態(tài)性（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）等，也越來越多地用于生物氣溶膠PCR 的后續(xù)分析［33-35］。生物化學方法，如酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、鱟變形細胞溶解物（limulus amebocyte lysate，LAL）試驗也應用于生物氣溶膠研究［36］。為了克服傳統(tǒng)培養(yǎng)法的局限，Sanger 測序法、DGGE、T-RFLP 被用于大多數生物氣溶膠研究中微生物群落多樣性的評估［37-38］。但這些方法對于詳細研究微生物群落結構的能力仍不足，Sanger 測序法在大基因片段的直接測序上存在時間長、成本高等問題；T-RFLP 由于數據庫中報道的16S rRNA 基因序列有限，可能誤判為新序列或容易返回許多未知序列，其對于微生物多樣性的評估會受測序位置的影響等［39］；DGGE 對于稀有細菌多樣性的評估能力不足，適用性寬泛引物用于細菌分類鑒定時往往會丟失稀有細菌組別［40］。

由于微生物豐度和活性會影響公眾健康和下風向生態(tài)系統(tǒng)，熒光原位雜交（fluorescence in-situ hybridization，FISH）和流式細胞術（flow cytometry，FCM）也被用于生物氣溶膠樣本活性分析［41-42］。FISH能同時檢測可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)微生物物種，有助于了解環(huán)境中的實際微生物污染情況。由于可同時進行微生物可視化、鑒定、計數以及定位等，FISH 在微生物學各領域均有很多應用［43］。將熒光技術與FCM 結合應用可區(qū)分生物和非生物物質，也可區(qū)分微生物不同生理狀態(tài)。盡管熒光染料和FCM 被廣泛用于水生環(huán)境中原核和真核微生物的總濃度及活性評估，但該技術尚未大規(guī)模應用于生物氣溶膠的評價研究［44］。

2.4 實時定量PCR（real-timequantitativePCR，qPCR）技術 qPCR 技術廣泛應用于微生物生態(tài)學中不同環(huán)境樣本的分類學和功能基因標記物的豐度定量［45］，通過在PCR 反應過程中對熒光標記的擴增產物的連續(xù)實時監(jiān)測，可對目標DNA 進行準確定量［46］。與PCR 法相比，qPCR 具有結果獲取更快、變異度更小、靈敏度更高、可定量等優(yōu)點。由于技術上的迅速進步，qPCR 目前已成為水源性或食物源性細菌、病毒等病原體鑒定的標準方法之一［46］。雙標記熒光探針，如TaqMan 探針，因其更高的特異性，在環(huán)境樣本病原體檢測中最受歡迎。同時，內參基因和探針的使用可對核酸提取、逆轉錄過程（對RNA樣本而言）以及是否存在PCR 抑制劑等情況進行監(jiān)測。除TaqMan 探針法外，另一種可選的qPCR 方法是SYBR green 熒光法，SYBR green 熒光染料在與雙鏈DNA 結合時，會有更高的發(fā)光強度。使用SYBR green 熒光法時，引物的恰當選擇以及引物濃度的優(yōu)化對于目的基因的有效擴增，避免非特異性產物是必要的［45］。

2.5 微陣列技術 微陣列技術可用于多核酸分子的平行、高通量檢測，在適合的探針庫可用情況下，微陣列技術可在單次實驗中同時完成大量微生物株、種、屬或更高層級水平的檢測與鑒定［47］。其優(yōu)點為將核酸擴增策略與分子雜交、微陣列大樣本篩選能力相結合，從而實現高特異性、高靈敏度以及高通量檢測。通過對保守區(qū)域設計高特異性和高靈敏度的探針，可用于大量環(huán)境樣本的檢測。盡管微陣列技術已成功應用于許多環(huán)境研究中基因表達分析，但該技術的應用仍存在許多障礙，如探針的合理設計、探針的周期性更新、目標序列的覆蓋度、實驗的特異性與靈敏性等［48-50］。

由于基因數據庫（GenBank）的快速發(fā)展，高密度的系統(tǒng)發(fā)生或功能分析微陣列可同時用于復雜環(huán)境樣本中微生物群落分析［51］。新微陣列技術的應用，如PhyloChip 和GeoChip，也應用于微生物群落結構和功能基因分析。PhyloChip 以16S rRNA 基因內已知多態(tài)性為靶標，可同時分析成千分類單元中的任何一個，其現行版本可同時檢測多達50 000 個細菌、古生菌和微藻分類單元的檢測。GeoChip 包含28 000 個探針，能覆蓋約57 000 個目標基因及其變異體的分析［52］。PhyloChip 和GeoChip 均成功應用于環(huán)境生物修復過程中細菌種群的監(jiān)測、病原微生物檢測以及特殊環(huán)境樣本的微生物溯源分析等［53-54］。

2.6高通量測序技術（454 pyrosequencing and Illumina MiSeq，HiSeq） 在過去幾十年間，Sanger 測序在包括臨床、環(huán)境、食品、工業(yè)等領域被廣泛應用，盡管技術上取得了一些進展，但許多方面仍存在局限［55］。下一代測序技術（next-generation sequencing，NGS）的快速發(fā)展，如以454 焦磷酸測序、Illumina MiSeq 和HiSeq 測序為代表的測序系統(tǒng)的出現，大大提升了PCR 擴增子讀取容量［56-58］。目前商業(yè)化應用廣泛的下一代DNA 測序系統(tǒng)主要包括羅氏公司的Roche’s（454）GS FLX Genome Analyzer 和Illumina 公司的MiSeq 和HiSeq 測序系統(tǒng)。

作為第一個高通量大規(guī)模平行測序平臺，454焦磷酸測序對象為與微珠（micro bead）吸附的、采用乳糜化（emulsion）PCR 反應擴增的DNA 文庫片段。GS FLX Titanium 平臺可完成百萬個包裹著DNA 克隆片段微珠的平行測序。該系統(tǒng)的持續(xù)改進使單個讀取序列的測序長度增加至400 ～800 個堿基，單次運行可產生1 Gb 的數據信息（表1），讀取長度的增加使得對細菌群體結構的解讀達到更高分辨率水平［59］。環(huán)境樣本中的次要細菌種群也能被檢測到［60］，而且測序過程中不發(fā)生抑制性物質的積聚。研究表明，454 焦磷酸測序可依據16S rRNA擴增子序列信息確定空氣傳播細菌種群大小、多樣性以及潛在致病性等，更利于明確個體序列的系統(tǒng)分類［61-63］。此外，由于454 焦磷酸測序可提供最長的讀取序列長度，可能尤其適合基因組從頭組裝。其缺點為同聚重復序列測序的準確性，插入序列是最常見的錯誤類型。

表1 不同的下一代測序平臺信息比較Tab.1 Comparison of different NGS platforms

Solexa ／ Illumina Genome Analyzer 廣泛應用于許多環(huán)境學研究［64-66］，該平臺同樣能實現百萬數量堿基的平行高通量測序，與454 焦磷酸測序系統(tǒng)使用磁珠不同，克隆DNA 簇是通過在玻璃表面的橋式擴增形成的。Solexa ／ Illumina 測序技術所使用的可逆轉終止化學反應克服了同源聚合重復序列中的堿基數量不確定性問題。與454 焦磷酸測序系統(tǒng)相比，Solexa ／ Illumina 平臺的測序成本低10%，而產出更高［65］。MiSeq 平臺在成本相對較低的情況下可提供2 × 250 堿基長度、最高8.5 Gb 測序數據產出，而HiSeq 平臺則能提供2 × 150 堿基長度、最高200 Gb 測序數據產出。HiSeq 平臺已成為全基因組鳥槍法（whole-genome shotgun sequencing）測序的標準方法。由于讀取長度更長、分辨率更高、經濟性更好等優(yōu)點，MiSeq 平臺在16S rRNA 測序研究中的應用潛力更大。

2.7宏基因組學方法（16S rRNA 擴增子測序法和全基因組鳥槍測序法） 以NGS 測序為基礎的宏基因組學方法（如16S rRNA 擴增子測序法和全基因組鳥槍測序法）是深入挖掘環(huán)境中混合微生物群落信息的合適方法［67］，其研究對象是自然環(huán)境下直接采集的非培養(yǎng)樣本。該方法可用于微生物多樣性及構成的分類學和功能學研究，以及微生物種群與人類健康有關環(huán)境因素時空改變相關性研究。宏基因組學方法是研究復雜微生物群落特性（尤其是生物氣溶膠中微生物總體威脅）的重要工具，而且隨著NGS 技術的應用取得了長足進步。由于現有方法所限，環(huán)境中99%的微生物無法進行培養(yǎng)，宏基因組技術可為微生物群落結構、系統(tǒng)構成、物種多樣性、代謝特性、功能多樣性等方面研究提供新的可能性。

自20 世紀90 年代中期開始，16S rRNA 測序作為所有宏基因組項目的第一步，廣泛應用于復雜環(huán)境樣本中微生物多樣性鑒定［68-69］。NGS 測序技術靶向16S rRNA 高變區(qū)（V1-V9），盡管最佳區(qū)域仍存在爭議，但測序錯誤概率最小的高變區(qū)分別是V4-V5（454 焦磷酸測序）和V4（Illumina MiSeq）。隨著16S rRNA 數據庫的快速發(fā)展，如SILVA、GreenGenes、RDP（Ribosomal Database Project）等，諸多環(huán)境樣本中微生物多樣性及組成結構信息可在更高分辨率下更快、更容易地被獲?。?0-71］。另外，16S rRNA 測序技術可用作病原菌分類的初步篩選，以快速鑒定未培養(yǎng)的微生物、不尋常分離株以及環(huán)境或臨床背景下特定表型的分離株的鑒定等［72-73］。16S rRNA 測序技術也存在如分類學上的分辨率和種水平上的進化和功能機制研究能力等方面的局限，同時，其分析會受諸多因素影響，如PCR 擴增引入的嵌合序列、引物或標簽錯配引起的測序錯誤。

全基因組鳥槍測序法是用于微生物群落多樣性及構成分析的另一種方法，其研究對象是環(huán)境樣本中獲取的隨機DNA 片段，首先破碎成小片段后進行測序，再應用許多軟件（如SOAPdenovo、Velvet、CLC assembly、ALLPATHs-LG）進行拼接，在完成空白填充后組成完整基因組序列。相比于16S rRNA 擴增子測序法，該方法在研究一些多細胞微生物以及其進化相關環(huán)境背景時能更加深入［74］。全基因組鳥槍測序法近年來已廣泛應用于包括人類宏基因組、污水環(huán)境、土壤宏基因組、霧霾環(huán)境、抗生素抗性基因相關微生物群落的分析［75-77］。盡管全基因組鳥槍測序法不受測序偏向和固有錯誤率等影響，但對于整個微生物群落相對豐度的宏基因組數據隨著DNA提取和所用測序工具不同而差異較大。另外，全基因組鳥槍測序法需要相對復雜的分析過程，如高分辨率組裝、數據篩選、注釋等。由于缺少參比數據庫，宏基因組測序數據的準確性評價也需充分考慮。

3 結語和展望

關于生物氣溶膠中微生物群落結構的研究可采用許多不同的方法，這些方法的應用范圍和解決不同問題的能力各有特點。對生物氣溶膠釋放以及其中病原微生物引發(fā)疾病的擔憂，促使可用于病原體檢測的分子生物學方法在技術上取得了長足進步。選擇何種分析方法，取決于所需信息是否定量和特異以及范圍是否寬泛等。相關技術方法的聯合應用使含有細菌、真菌和病毒復雜多變的大氣背景條件下對特定目標微生物的檢測更易實現，同時也將增進對于氣溶膠化的微生物群落結構、存活和轉運特性的認知。生物氣溶膠相關研究仍處于起步階段，許多問題的闡明有待對技術的持續(xù)開發(fā)和研究成果的創(chuàng)新應用。