黃毛草莓葉片愈傷組織誘導研究

錢邵函 劉倩文 武春霞

摘? ? 要：為建立黃毛草莓葉片繁殖體系，篩選誘導愈傷組織的最適培養(yǎng)基，以黃毛草莓幼嫩葉片為外植體，研究了消毒時間、激素組合、光暗條件對黃毛草莓葉片愈傷組織誘導的影響。結果表明：黃毛草莓葉片最佳的外植體消毒處理為0.1%的升汞消毒6～8 min;黃毛草莓葉片愈傷組織褐化嚴重，經15%抗壞血酸（Vc）溶液浸泡20 min可顯著降低褐化率，提高出愈率;愈傷組織誘導的最適培養(yǎng)基組合為MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA和MS+1.0 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 IBA;暗培養(yǎng)10 d出愈率最高，可達到87.5%。因此，黃毛草莓葉片愈傷組織誘導最佳培養(yǎng)方法為：MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+30 g·L-1 蔗糖+7 g·L-1 瓊脂，培養(yǎng)基pH值為 5.6，15%Vc溶液浸泡20 min，出愈率可達到95.0%。

關鍵詞：黃毛草莓;葉片;愈傷組織;誘導

中圖分類號：S668.4? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2022.06.008

Study on Callus Induction of Fragaria nilgerrensis Leaves

QIAN Shaohan， LIU Qianwen， WU Chunxia

（College of Horticulture Landscape， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China）

Abstract：? In order to establish an efficient method for plant regeneration from leaf explant of Fragaria nilgerrensis plantlet the most suitable medium for inducing callus was screened. The leaves of Fragaria nilgerrensis plantlet were used for studying the effects of disinfection time， plant growth regulator concentration and ratio， different incubation time in dark， on callus induction in leaves were studied using the young and tender leaves of Fragaria nilgerrensis as explants. The results showed that the optimal explant disinfection treatment for 0.1% of the leaves of Fragaria nilgerrensis was 0.1% mercury disinfection for 6-8 minutes， and the callus of Fragaria nilgerrensis leaf was severely browned， and the browning rate and callus induction rate could be significantly reduced by soaking in 15% ascorbic acid （Vc） solution for 20 minutes. The optimal medium combination for callus induction was MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA and MS+1.0 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 IBA for 10 d in dark， the callus induction frequency was up to 87.5%. The best cultivation method is MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA+30 g·L-1 sucrose+7 g·L-1 Agar-Agar， medium pH 5.6 and soaks in 15%Vc solution for 20 minutes， the callus induction frequency is up to 95%.

Key words： Fragaria nilgerrensis; leaf; callus; induction

黃毛草莓（Fragaria nilgerrensis Schlecht. ex Gay）是薔薇科（Rosaceae）草莓屬（Fragaria L.）多年生二倍體草本植物，具有較強的抗病抗旱抗寒能力，在世界各地廣泛栽培[1-2]。黃毛草莓中富含的氨基酸總量在野生草莓資源中相對較高，具有較高的營養(yǎng)價值，是培育具有高氨基酸含量果品的寶貴野生資源[3]。就目前草莓發(fā)展的趨勢來看，野生種質資源在改善草莓品種特性上具有極大的應用潛力。

匍匐莖分株法普遍用于草莓的無性繁殖，這種方法繁殖系數(shù)較低、速度較慢，并且特別容易感染病毒而使種苗退化[4]，導致草莓的產量和品質下降，不利于優(yōu)良品種的推廣，不能滿足大范圍生產的需要。此外，在黃毛草莓引進后，其大規(guī)模種苗生產技術還不夠完善，加上作物多倍體的特性，制約了傳統(tǒng)的育種方法。草莓的組培技術則可以獲得無毒苗以保持其品種的優(yōu)良特性[5-6]。目前，關于國內草莓的組培研究大多集中于草莓的莖尖培養(yǎng)[7-9]，對于葉片繁殖的研究較少，不少草莓生產基地對草莓組培和擴繁等進行了系統(tǒng)的研究。晁慧娟等[10]以‘甜查理’草莓葉片為試驗材料，對其進行組培，得出一組適宜葉片誘導愈傷組織的激素組合水平，試驗結果表明：葉片誘導愈傷培養(yǎng)基最佳組合為MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA出愈率92.5%。劉玲等[11]用TDZ與IBA激素的不同濃度組合誘導黃毛草莓離體葉片愈傷組織形成。試驗結果表明，誘導葉片愈傷組織形成得最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 IBA出愈率95.4%。本試驗設置了2種植物激素組合，6-BA和 NAA為一組、TDZ和IBA為一組，研究黃毛草莓葉片不同消毒處理、不同水平激素組合和添加15%抗壞血酸以及不同暗處理時間下愈傷組織誘導的狀況，以期得到適合黃毛草莓葉片誘導出愈傷組織的植物激素組合水平，為黃毛草莓快速繁殖和育種奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗材料為當年生的黃毛草莓葉片，采集地點為天津農學院西校區(qū)（39°16' N，116°97' E）。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的消毒 摘取幼嫩的黃毛草莓葉片放入干凈的燒杯中，滴入幾滴洗潔靈，將表面附帶的灰塵等雜物用清水沖洗干凈，再將洗凈的葉片放置于超凈工作臺上進行消毒滅菌。用濃度為75%的酒精浸泡30 s后用無菌水清洗1遍，轉入0.1%的升汞溶液分別消毒4，6，8，10 min，再用無菌水沖洗葉片4～5次，最后用消毒好的剪刀去除掉葉片的邊緣，將其剪成約0.5 cm×0.5 cm的外植體（保留主脈）備用。

1.2.2 不同激素組合水平培養(yǎng)基的接種 以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加7 g·L-1瓊脂、30 g·L-1蔗糖，將pH 值調為5.8。6-BA和NAA為一組，TDZ和IBA為一組，并設定濃度6-BA為0.5，1.0，1.5 mg·L-1，NAA為0.05，0.10，0.15 mg·L-1，TDZ為0.5，1.0，1.5 mg·L-1，IBA為0.1，0.2，0.3 mg·L-1。將處理好的黃毛草莓葉片接種于含有不同6- BA和NAA、TDZ和IBA濃度組合的MS培養(yǎng)基中，接種時將葉子的背面朝下與培養(yǎng)基接觸，每瓶接種5個外植體，50 d后統(tǒng)計出愈率;為了使褐化現(xiàn)象減小，將處理好的葉片放于配制好的15%的抗壞血酸（Vc）溶液中浸泡20 min，然后按照上述的方法重新接種。

1.2.3 暗培養(yǎng)時間的設置 設置暗培養(yǎng)天數(shù)5，10，15，20 d ，暗培養(yǎng)結束后將其轉入到光照下培養(yǎng);將已經接種好黃毛草莓葉片的培養(yǎng)基直接置于光照下培養(yǎng)（暗培養(yǎng)0 d）設對照。每個處理接種8瓶（培養(yǎng)基為 MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA），每瓶培養(yǎng)基接種5個處理好的葉片。接種后30 d觀察并記錄草莓葉片愈傷組織的誘導情況，統(tǒng)計出愈率。

1.2.4 培養(yǎng)條件 光照強度2 500 lx，溫度25 ℃。每天觀察并記錄黃毛草莓葉片的變化，50 d后統(tǒng)計出黃毛草莓愈傷組織的誘導情況。

1.2.5 數(shù)據統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據均采用Excel 2007和SPSS19.0進行數(shù)據統(tǒng)計與統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同消毒時間長度對外植體的影響

從表1可以看出，當消毒時間為4 min時，褐變率為20%，葉片受到的損傷比較小，顏色發(fā)綠，但是在培養(yǎng)基中污染比較嚴重，污染率為85%，說明消毒不夠充分，使菌類物質抑制愈傷組織的發(fā)生;當消毒時間為10 min時，褐變率為24%，葉片受到的損傷比較嚴重，顏色變成黑褐色，但是沒有污染的情況，說明消毒時間過長;當消毒時間為6～8 min時，葉片在培養(yǎng)基上萌發(fā)的數(shù)目比較多，污染相對較少。

2.2 暗培養(yǎng)對葉片愈傷組織的誘導

從表2可以看出，隨著暗培養(yǎng)時間的遞增，產生愈傷組織的數(shù)量逐漸增加，出愈率也逐漸增高，第10天出愈率達到最高，為87.5%，極顯著高于其他暗培養(yǎng)天數(shù);繼續(xù)增加暗培養(yǎng)的天數(shù)，產生愈傷組織的數(shù)量逐漸遞減，出愈率顯著降低，第20天出愈率下降到37.5%。由此可知，暗培養(yǎng)的時間為10 d時，比較適宜黃毛草莓葉片誘導出愈傷組織。

2.3 不同6-BA和NAA濃度組合和添加抗壞血酸對葉片愈傷組織誘導的影響

由表3可知，將黃毛草莓葉片接種到含有不同6-BA和NAA濃度組合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)50 d之后，所有的處理都出現(xiàn)了不同程度的褐化現(xiàn)象。為了使褐化程度消失或減小，本試驗采用現(xiàn)配制好的15%Vc溶液浸泡葉片20 min。結果表明，9個處理的褐化程度都顯著降低，出愈率都明顯增加。未經15%Vc溶液處理時，處理1的出愈率為15%，顯著低于其他組合，褐化率為95%，顯著高于其他組合;處理5的出愈率最高為75%，褐化率最低為46.67%，與其他組合差異顯著。經過15%Vc溶液浸泡后，處理1的出愈率與處理前相比增加了20%，其褐化率降低了29.67%;處理5的出愈率為86.67%，與處理前相比增加了11%，顯著高于其他組合，褐化率為6.67%，與未經15%的Vc溶液處理相比褐化率降低了39%，顯著低于其他組合。50 d左右愈傷組織增殖明顯，覆蓋整個葉片，呈淡黃色。綜上得出，黃毛草莓葉片愈傷組織誘導適宜的激素組合是處理5（MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA）。

2.4 不同TDZ和IBA濃度組合和添加抗壞血酸對葉片愈傷組織誘導的影響

黃毛草莓葉片接種后，在培養(yǎng)過程中有小部分葉片發(fā)生褐化，大部分葉片都能保持綠色，在接種后10 d，葉片中間開始膨脹，呈拱狀，之后在傷口處出現(xiàn)膨大現(xiàn)象;培養(yǎng)15 d后，黃毛草莓葉片膨大部分轉變成為淡黃色的愈傷組織。繼續(xù)進行培養(yǎng)，愈傷組織逐漸變大增多，顏色逐漸轉變?yōu)辄S褐色。

由表4可知，黃毛草莓葉片在含有不同TDZ和IBA濃度組合的 MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)50 d，出愈率均較高，最高可達到90%，但在不同的培養(yǎng)基中，其出愈狀況差異明顯，并且所有處理的褐化情況表現(xiàn)出了明顯的不同。為了使褐化情況減弱，本試驗用現(xiàn)配制好的15%Vc溶液浸泡葉片20 min，結果發(fā)現(xiàn)，9個處理的褐化情況都顯著降低。在未經Vc處理的情況下，處理10的出愈率為25%，顯著低于其他處理組合，褐化率為86.67%，顯著高于其他處理組合;處理13的出愈率為90%，顯著高于其他處理組合，褐化率最低為5.67%。經過15% Vc處理后，處理10的出愈率增加了30%，褐化率降低了30%;處理13的出愈率為95%，與未經15% Vc處理相比分別增加了5%，顯著高于其他組合，褐化率為2.76%，與未經15% Vc處理相比降低了3%，顯著低于其他組合。綜上得出，最適宜黃毛草莓葉片愈傷組織誘導的培養(yǎng)基是處理13（MS+1.0 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 IBA）。

3 結論與討論

消毒時間的長短對于愈傷組織誘導有著非常重要的影響。大多數(shù)研究認為，消毒時間如果太短（如1 min）則無法控制污染，如果時間太長（如7 min）會損傷葉片，變褐死亡率升高[12]。本試驗適宜的消毒時間為6～8 min，說明黃毛草莓葉片消毒超過7 min也可以達到良好的滅菌效果。這可能是因為黃毛草莓葉片上下表皮具有較多的絨毛，可以減少消毒溶液對葉片的損傷。

葉片愈傷組織誘導的培養(yǎng)，需要一定時間暗培養(yǎng)的處理，才能達到適宜的培養(yǎng)條件，這一結論在許多草莓的離體葉片誘導愈傷組織的試驗中也得到了證實。王梅[13]在試驗中進行了2個草莓品種的比較，發(fā)現(xiàn)暗培養(yǎng)10 d可以使紅顏草莓的出愈率達到最高。本試驗在暗培養(yǎng)10 d時出愈率達到最高，與上述結論一致。在葉片愈傷組織誘導的過程中，選取適合的細胞分裂素濃度對于提高愈傷組織的生成率有著至關重要的影響。周厚成等[14]將生長素NAA的濃度定為0.1，0.2 mg·L-1時，發(fā)現(xiàn)愈傷組織的生成能力可高達98.9%，但隨著NAA濃度的增加，愈傷組織的生成能力逐漸下降。付崇毅等[15]研究發(fā)現(xiàn)，當6-BA濃度低于1.5 mg·L-1時，隨著6-BA濃度的升高，草莓莖尖愈傷組織萌發(fā)率升高，褐化率顯著降低，將6-BA濃度提高到2 mg·L-1時，草莓莖尖愈傷組織褐化率顯著提高。因此，本試驗中使用較低濃度的生長素NAA和細胞分裂素6-BA結合，促進葉片愈傷組織的誘導，根據愈傷組織的出愈率和褐化率，從而得出適宜黃毛草莓葉片誘導愈傷組織的植物激素組合水平。本試驗結果顯示，TDZ與IBA的處理組合1.0 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 IBA配合MS培養(yǎng)基效果最佳，出愈率為90%，這與劉玲等[11]研究結果一致。將2組激素組合進行比較，筆者發(fā)現(xiàn)TDZ與IBA的處理組合比6-BA與IAA的處理組合誘導愈傷組織效果好，添加了TDZ和IBA的培養(yǎng)基能使出愈率最高達到90%，而添加了6-BA和NAA的培養(yǎng)基最高出愈率只能達到75%。這可能是由于 TDZ具有較高的細胞分裂能力，使愈傷組織在培養(yǎng)中積累較多的養(yǎng)分，從而促進了愈傷組織的形成。褐化是植物組織培養(yǎng)中最常見的問題，褐化產生的酚類物質影響愈傷的生長， 嚴重時導致愈傷死亡，抗壞血酸（Vc）作為一種抗褐化劑能有效消除有毒有害物質的積累，提高愈傷組織的誘導率[16]。本試驗發(fā)現(xiàn)，接種前將外植體用15%Vc浸泡20 min后，所有激素處理組合的出愈率和褐化率與未進行15%Vc浸泡處理的激素處理組合相比，均有不同程度的升高和降低，與前人研究結果一致[16]，其出愈率最高增加了30%，褐化率最高降低了67.33%。這說明在培養(yǎng)基中添加適合濃度的Vc能夠有效預防外植體褐化，促進愈傷組織的生成。

綜上所述，用0.1%升汞對外植體消毒，消毒時間為6～8 min時，誘導出的愈傷組織，褐化較少，污染小。對外植體進行暗處理10 d，再轉移到光照下培養(yǎng)，出愈率最高可達到87.5%，對外植體進行15%Vc浸泡處理能有效降低褐化率，提高出愈率。從不同激素組合水平的處理來看，在18組激素處理中，相對較適宜黃毛草莓葉片愈傷組織誘導的培養(yǎng)基是處理13（MS+1.0 mg·L-1 TDZ+0.1 mg·L-1 IBA）和處理5（MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA）。本試驗篩選出適宜黃毛草莓葉片愈傷組織誘導的一系列最適培養(yǎng)條件，為草莓葉片愈傷組織培養(yǎng)提供了一定的理論基礎。

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