黏惰化及酸敏感修飾對納米粒子黏膜穿透的影響

姬發(fā)， 劉玲， 余林玲，2， 孫彥，2

黏惰化及酸敏感修飾對納米粒子黏膜穿透的影響

姬發(fā)1， 劉玲1， 余林玲1，2， 孫彥1，2

（1. 天津大學(xué)化工學(xué)院生物化工系, 2. 教育部合成生物工程重點實驗室， 天津 300350）

使用納米粒子進(jìn)行疾病的診斷和治療是當(dāng)前研究的一個熱點. 由于受到黏液層的阻礙, 納米粒子對于黏膜上皮細(xì)胞的進(jìn)入效果不佳, 從而限制了其對黏膜相關(guān)疾病的診斷和治療. 本文設(shè)計合成了一種具有黏惰性的酸敏感納米粒子(MSNs-pCBMA-DMMA), 可有效穿透黏液層進(jìn)入黏膜上皮細(xì)胞. 首先采用溶膠-凝膠法合成了表面氨基化的介孔二氧化硅納米粒子(MSNs-NH2), 然后通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法(ATRP)使兩性離子羧基甜菜堿甲基丙烯酸酯(CBMA)在MSNs-NH2表面上聚合形成聚羧基甜菜堿甲基丙烯酸酯(pCBMA), 獲得惰性化的粒子(MSNs-pCBMA), 最后將酸響應(yīng)性分子2,3-二甲基馬來酸酐(DMMA)修飾于MSNs-pCBMA表面, 制備了MSNs-pCBMA-DMMA. 場發(fā)射透射電子顯微鏡(TEM)、 傅里葉紅外光譜(FTIR)、 氫核磁共振波譜(1H NMR)和納米粒度電位測定儀等分析結(jié)果表明, 合成了MSNs-pCBMA-DMMA, 且粒子表面電位隨pH值降低顯著增加, 在pH=7.4～5.7范圍內(nèi)具有酸敏感能力. Transwell?小室實驗表明, pCBMA的接枝提高了粒子在模擬黏液中的滲透速率, 而DMMA的修飾則進(jìn)一步增強(qiáng)了粒子的擴(kuò)散能力, 4 h內(nèi)MSNs-pCBMA-DMMA的模擬黏液滲透率達(dá)到16.3%, 為MSNs-pCBMA的1.9倍, MSNs-NH2的3倍, 而以MSNs-NH2的表觀滲透系數(shù)（app）為標(biāo)準(zhǔn)計算得到的MSNs-pCBMA-DMMA的相對表觀滲透系數(shù)達(dá)到了2.96. 細(xì)胞毒性試驗驗證MSNs-pCBMA-DMMA粒子的生物安全性良好. 細(xì)胞攝取試驗表明, 相比于其它粒子MSNs-pCBMA-DMMA能夠更快的被黏膜上皮細(xì)胞攝取. 本文所構(gòu)建的納米粒子能夠快速滲透黏液且易于被黏膜上皮細(xì)胞攝取, 為其應(yīng)用于黏膜相關(guān)疾病的活體診斷和治療提供了基礎(chǔ).

納米粒子； 兩性離子聚合物； 擴(kuò)散； 細(xì)胞攝??； 黏膜滲透

介孔二氧化硅納米粒子因其尺寸小、 易功能化修飾和良好的生物相容性而成為腫瘤診斷和治療的一種新方式［1～3］. 黏膜細(xì)胞參與構(gòu)成人體內(nèi)的多種組織和器官， 因此其涉及到包括口腔癌、 胃癌和宮頸癌等十分龐大的疾病種類和數(shù)量［4，5］. 黏膜細(xì)胞上方覆蓋著由黏蛋白、 水、 無機(jī)鹽、 多肽、 細(xì)菌以及上皮細(xì)胞碎片［6］等物質(zhì)組成的黏彈性黏液層［7］， 可以黏附并清除病原微生物， 形成了人體重要的生理屏障——黏液屏障. 然而， 黏液層也會通過靜電或疏水作用黏附外來粒子使其滯留其中， 從而限制了納米粒子參與的與黏膜上皮細(xì)胞相關(guān)疾病的診斷和治療［8，9］. 因此， 突破黏液層對納米粒子的黏附作用并保障黏膜上皮細(xì)胞對納米粒子的高效攝取是提升用于疾病診斷和治療的納米粒子的應(yīng)用能力的主要難點.

黏液穿透粒子（MPP）是降低黏液黏附效應(yīng)的一種可行手段， MPP具有親水性和電中性表面， 能夠穿透黏液屏障并在黏膜上皮細(xì)胞表面積累［10，11］. 一般通過在納米粒子上修飾親水性和電中性的材料可以制得MPP. 其中， 聚乙二醇（PEG）及其共聚物［12～17］是最常見的修飾材料， 可有效制備MPP； 但PEG等修飾材料易自氧化， 且熱穩(wěn)定性差［18，19］， 限制了粒子的實際應(yīng)用效果. 近年來， 含有高親水性陰陽離子基團(tuán)的兩性離子聚合物（ZI）成為備受關(guān)注的一類抗蛋白吸附材料［20，21］. 其中， 聚羧基甜菜堿甲基丙烯酸酯（pCBMA）內(nèi)部基團(tuán)穩(wěn)定性強(qiáng)， 易于進(jìn)行多種修飾［22］， 而且具有電中性強(qiáng)親水表面能夠降低黏液黏附效應(yīng)， 可作為一種優(yōu)良的黏惰性修飾材料.

納米粒子的電中性強(qiáng)親水表面在加快黏液層穿透的同時也會減弱其與黏膜上皮細(xì)胞之間的相互作用， 從而影響納米粒子的細(xì)胞攝取效果［23］. 帶正電的納米粒子可與帶負(fù)電的細(xì)胞膜發(fā)生靜電吸引作用， 與不帶電以及帶負(fù)電的粒子相比， 更容易接近細(xì)胞加速細(xì)胞攝取［24］. 鑒于人體中大部分黏液層環(huán)境呈弱酸性， 為納米粒子通過酸敏感分子修飾實現(xiàn)pH響應(yīng)過程提供了可能. 2，3-二甲基馬來酸酐 （2，3-Dimethylmaleic anhydride， DMMA）是一種良好的酸敏感分子， 與結(jié)構(gòu)類似的酸敏感分子丁二酸酐、 順式環(huán)己烯-1，2-二甲酸酐和順式烏頭酸酐相比， 在相同酸性pH下DMMA的響應(yīng)速率最高［25］. 因此， 將DMMA通過酰胺鍵與納米粒子表面的原位氨基相連， 在黏液的弱酸性環(huán)境中DMMA通過pH響應(yīng)斷裂引起納米粒子表面原位氨基暴露， 從而使納米粒子表面呈現(xiàn)正電荷， 更容易接近細(xì)胞加速細(xì)胞攝取［26，27］.

本文針對納米粒子進(jìn)入黏膜上皮細(xì)胞進(jìn)行疾病治療和診斷的兩個關(guān)鍵過程——黏液層的快速穿透和黏膜上皮細(xì)胞的有效進(jìn)入提出了一種新策略（Scheme 1）. 先將黏液惰性材料pCBMA接枝到表面氨基化的介孔二氧化硅納米粒子（MSNs-NH2）上形成惰性化納米粒子（MSNs-pCBMA）， 再將酸敏感分子 DMMA與MSNs-pCBMA表面未反應(yīng)的原位氨基相連， 制備了具有黏液惰性的酸敏感納米粒子 MSNs-pCBMA-DMMA. 以DMMA直接修飾的介孔二氧化硅納米粒子（MSNs-DMMA）為對照， 通過體外黏液穿透實驗和細(xì)胞實驗考察了MSNs-pCBMA-DMMA的黏液滲透能力和細(xì)胞攝取效果. 本文研究結(jié)果有助于納米粒子在黏膜系統(tǒng)疾病的診斷和治療中的應(yīng)用.

Scheme 1Schematic of pH?responsive mucus?inert nanoparticles MSNs?pCBMA?DMMA

1 實驗部分

1.1　試劑與儀器

鹽酸（分析純）、 乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na， 分析純）和大豆卵磷脂（純度98%）， 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所； 硫酸（H2SO4， 分析純）、 過氧化氫（H2O2）和三乙胺（TEA）均為分析純， 天津市江天化工技術(shù)有限公司；，二甲基甲酰胺（DMF）， 優(yōu)級純， 天津市元立化工有限公司； 溴化銅（CuBr2）， 分析純， 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司； 溴化亞銅（CuBr）， 分析純， 上海潤捷化學(xué)試劑有限公司； 2，2-聯(lián)吡啶（Bpy）， 分析純， 北京鼎國生物科技有限公司； 異硫氰酸熒光素（FITC）， 純度90%， 沈陽聯(lián)星生物技術(shù)有限公司； 正硅酸四乙酯（TEOS， 純度99.9%）， 阿法埃莎化學(xué)有限公司（Alfa Aesar）； 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES， 純度98%）、-溴異丁酰溴（BIBB， 分析純）、-丙內(nèi)酯（純度98%）、 十六烷基三甲基溴化銨（CTAB， 純度99%）、 甲基丙烯酸 2-（二甲氨基）乙酯（DMAEMA， 純度98%）、 噻唑藍(lán)（MTT， 純度99%）和牛血清白蛋白（BSA， 純度96%）， 美國西格瑪奧德里奇公司（Sigma-Aldrich）； 豬胃黏蛋白， 98%， 上海源葉生物科技有限公司.

聚碳酯膜（PC）Transwell?嵌套（6.5 mm， 3 μm）， 美國Corning Incorporated公司； JEM-2100F型場發(fā)射透射電子顯微鏡（TEM）， 日本JEOL公司； Spectrum 100型傅里葉紅外光譜（FTIR）， 美國Perkin Elmer公司； 2000U型納米粒度電位測定儀， 英國Malvern公司； INFINITE M NANO＋型酶標(biāo)儀， 瑞士Tecan公司； TE2000-U型倒置熒光顯微鏡， 日本NIKON公司； Varian Unity Inova 500 MHz核磁共振光譜儀， 美國Varian公司.

1.2　實驗過程

1.2.1MSNs-NH2的制備利用溶膠-凝膠法制備表面氨基化介孔二氧化硅納米粒子MSNs-NH2［28］. 將750 mg CTAB溶于去離子水中， 加入210 mg NaOH， 在80 ℃下， 依次加入3.75 mL TEOS與0.75 mL APTES， 反應(yīng)2 h； 產(chǎn)物經(jīng)洗滌后轉(zhuǎn)移至三口燒瓶中， 依次加入120 mL乙醇與15 mL濃鹽酸， 回流2 h去除模板劑CTAB， 洗滌后得到MSNs-NH2粒子， 置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥24 h.

1.2.2 兩性離子聚合物pCBMA的接枝 利用叔胺基團(tuán)和羧酸內(nèi)酯的開環(huán)反應(yīng)合成CBMA單體［29］. 將1.68 mL DMAEMA加入到25 mL無水丙酮中， 冰浴下通入氮?dú)猓?得到A溶液； 將0.76 mL-丙內(nèi)酯加入到5 mL無水丙酮中， 得到B溶液. 在持續(xù)通入氮?dú)獾臈l件下， 將B溶液逐滴加入到A溶液中； 然后將反應(yīng)容器密封并移至15 ℃空氣搖床反應(yīng)5 h； 產(chǎn)物用無水丙酮與無水乙醚洗滌， 使用真空泵將產(chǎn)物干燥2 h并封存于4 ℃冰箱中備用. 通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法（ATRP）將pCBMA接枝到MSNs-NH2表面［30］. 將300 mg MSNs-NH2， 50 mL DMF與2.4 mL TEA混合， 將5 mL DMF和200 μL BIBB加入到恒壓滴定漏斗中， 在冰水浴條件下逐滴加入到MSNs-NH2的混合懸濁液中， 以240 r/min轉(zhuǎn)速反應(yīng)2 h； 然后轉(zhuǎn)移至30 ℃恒溫水浴中持續(xù)反應(yīng)18 h； 反應(yīng)結(jié)束后分別用DMF、 無水乙醇和去離子水洗滌產(chǎn)物， 所得溴化粒子記為MSNs-Br， 并分散于體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇水溶液中， 于4 ℃保存?zhèn)溆? 將200 mg MSNs-Br加入20 mL DMF與水的混合溶液（體積比為1∶1）中， 再依次加入227 mg CBMA單體、 1.34 mg CuBr2和9.37 mg Bpy； 向反應(yīng)體系中通入氮?dú)獬ンw系中的氧氣， 然后將4.31 mg CuBr加入到反應(yīng)體系中， 持續(xù)反應(yīng)3 h； 停止通氮?dú)猓?并將反應(yīng)體系暴露于空氣中， 待溴化亞銅被空氣中的氧氣氧化完成， 終止反應(yīng)； 用0.1 mol/L EDTA-2Na溶液、 無水乙醇和去離子水洗滌產(chǎn)物. 經(jīng)真空冷凍干燥后得到pCBMA接枝的介孔二氧化硅納米粒子MSNs-pCBMA.

1.2.3 酸敏感分子DMMA的修飾 參照文獻(xiàn)［31］方法， 將DMMA修飾到納米粒子的氨基上. 將 MSNs-NH2和MSNs-pCBMA各100 mg分散于去離子水中， 用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值使其穩(wěn)定在8.5； 然后各加入100 mg DMMA， 混合均勻后于常溫下反應(yīng)6 h， 收集固體產(chǎn)物， 用pH=8.5的去離子水清洗3遍， 經(jīng)真空冷凍干燥得到MSNs-DMMA和MSNs-pCBMA-DMMA.

1.2.4 黏液滲透實驗 將1800 mg部分純化的豬腸胃黏蛋白、 96 mg卵磷脂和960 mg BSA溶解于30 mL HEPES（20 mmol/L， pH=7.4）緩沖液中， 用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值至6.5， 在4 ℃搖床中孵育48 h， 作為模擬黏液［32］. 對納米粒子進(jìn)行熒光標(biāo)記［33］， 將FITC標(biāo)記的APTES分別與MSNs-NH2， MSNs-pCBMA， MSNs-DMMA和MSNs-pCBMA-DMMA混合， 在避光條件下合成熒光粒子， 在特定波長（490 nm）光源的激發(fā)下可以呈現(xiàn)出熒光信號. 采用Transwell?嵌套板對4種納米粒子在模擬黏液中的滲透性能進(jìn)行表征［34］. 將20 μL黏液充分鋪展在Transwell?嵌套板的A室中并加入FITC標(biāo)記的納米粒子（100 μg/mL） 200 μL， B室中加入HEPES（20 mmol/L， pH=6.5）緩沖液600 μL， 放入37 ℃保溫箱中避光孵育. 定時（0.5， 1， 1.5， 2， 3， 4 h）從B室取樣100 μL， 并補(bǔ)加相同體積的緩沖液， 使用酶標(biāo)儀測定取出樣品的熒光強(qiáng)度， 利用下式計算粒子透過率（， %）：

式中：0為空白對照的熒光強(qiáng)度；1為待測樣品熒光強(qiáng)度；c為標(biāo)準(zhǔn)樣品熒光強(qiáng)度.粒子相應(yīng)的表觀滲透系數(shù)（app， cm/s）用下式計算， 并以MSNs-NH2的app為標(biāo)準(zhǔn)計算相對表觀滲透系數(shù)：

式中： d/d（mg/s）為粒子透過黏液的速率；0（μg/mL）為粒子的初始濃度，（cm2）為Transwell?嵌套板中半透膜的面積.

1.2.5 細(xì)胞安全性實驗 以人肺腺癌細(xì)胞（Calu-3細(xì)胞系）作為模型細(xì)胞， 培養(yǎng)基選擇MEM（含NEAA）， 其中包含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清（FBS）和體積分?jǐn)?shù)為1%的青霉素-鏈霉素. 將細(xì)胞在37 ℃， CO2濃度為5%的環(huán)境中孵育. 采用噻唑藍(lán)（MTT）比色法對粒子的細(xì)胞毒性進(jìn)行表征［35］. 將細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期， 用杜氏磷酸鹽緩沖液（DPBS）制成單細(xì)胞懸液加入到96孔板中， 每孔加入80 μL細(xì)胞懸液（5×103個/孔）， 培養(yǎng)24 h. 向孔板中加入20 μL不同濃度（10， 50和100 μg/mL）的4種納米粒子， 而對照組則加入20 μL的DPBS緩沖液， 繼續(xù)培養(yǎng)24 h. 利用無菌DPBS配制5.5 mg/mL的MTT溶液. 培養(yǎng)板每孔加入10 μL MTT溶液， 培養(yǎng)一定時間. 將培養(yǎng)物離心后除去上清液， 加入100 μL二甲基亞砜（DMSO）， 在37 ℃搖床中振搖以充分溶解藍(lán)紫色甲瓚晶體. 利用酶標(biāo)儀測定溶液在570 nm處的吸光度， 以對照組存活率為100%， 計算細(xì)胞活性的平均值.

1.2.6 細(xì)胞攝取實驗 利用熒光顯微鏡對熒光標(biāo)記的細(xì)胞與一種納米粒子進(jìn)行觀察. 將2 mL Calu-3單細(xì)胞懸液（1×105個/孔）加入到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)48 h. 將1 mL熒光標(biāo)記的納米粒子 溶液（50 μg/mL）加入到孔中培養(yǎng)4 h； 將孔板中液體吸出， 用DPBS緩沖液沖洗后， 向每個孔中加入 1 mL Hoechst 33258染色液（5 μg/mL）， 孵育30 min后用DPBS緩沖液沖洗， 利用熒光顯微鏡進(jìn)行檢查［36］.

2 結(jié)果與討論

2.1　納米粒子的制備與表征

首先利用TEM觀察了合成的4種納米粒子MSNs-NH2， MSNs-pCBMA， MSNs-DMMA和MSNs- pCBMA-DMMA的形貌和尺寸， 結(jié)果如圖1所示. TEM圖像顯示， 4種納米粒子均呈現(xiàn)球型或橢球型， 粒徑均約為100 nm. 由圖1（A）～1（D）可以看出， 與MSNs-NH2相比， MSNs-pCBMA-DMMA粒徑?jīng)]有明顯變化， 這是由于TEM表征過程中粒子處于干燥狀態(tài)， 接枝的pCBMA聚合物鏈不能充分伸展而造成的. 由圖1（E）可以看出， 二氧化硅納米粒子具有明顯的介孔結(jié)構(gòu)， 與文獻(xiàn)［37］報道一致， 表明這4種納米粒子均具備較高的藥物負(fù)載能力［38］. 為了更好地表征聚合物接枝層， 對粒子進(jìn)行了染色［圖1（F）和圖1（G）］. 可以看出， 與MSNs-NH2相比， MSNs-pCBMA上存在聚合物層， 證明pCBMA連接成功. 此外， 利用DLS測量MSNs-NH2， MSNs-pCBMA，MSNs-DMMA和MSNs-pCBMA-DMMA在溶液中的水合粒徑， 分別為（205.8±22）， （313.2±7）， （200.1±15）和（307.0±12）nm. MSNs-NH2與MSNs-DMMA幾乎一致， 而接枝修飾pCBMA聚合物鏈后的粒子MSNs-pCBMA和MSNs-pCBMA-DMMA幾乎一致， 且均高于MSNs-NH2與MSNs -DMMA， 表明DMMA修飾幾乎不影響粒子的水合粒徑， 而pCBMA聚合物鏈修飾則明顯增加了粒徑. 由于DLS測量的是溶液中的粒子的水合粒徑， 不同于干燥狀態(tài)的粒子， 因而與TEM測得的粒徑結(jié)果存在差異.

Fig.1　TEM images ofMSNs?NH2(A, E, F), MSNs?pCBMA(B, G), MSNs?DMMA(C) and MSNs?pCBMA?DMMA(D)

（E） Amplified MSNs-NH2； （F） MSNs-NH2by negative staining； （G） MSNs-pCBMA by negative staining.

實驗中通過叔胺基團(tuán)和羧酸內(nèi)酯的開環(huán)反應(yīng)制得黏惰性材料pCBMA的單體CBMA， 并測定了 CBMA的1H NMR光譜，：1.78（s， 3H， dCH3）， 2.57（t， 2H， CH2COO）， 3.04（s， 6H， NCH3）， 3.53（t， 2H， NCH2）， 3.64（t， 2H， CH2N）， 4.49（t， 2H， OCH2）， 5.61（s， 1H， dCH）， 6.00（s， 1H， dCH）， 證明CBMA制備成功.

將CBMA單體修飾在MSNs-NH2上得到MSNs-pCBMA， 然后以MSNs-NH2和MSNs-pCBMA為基礎(chǔ)進(jìn)一步修飾酸敏感分子DMMA， 分別制備MSNs-DMMA和MSNs-pCBMA-DMMA. 利用FTIR對MSNs-NH2， MSNs-pCBMA， MSNs-DMMA及MSNs-pCBMA-DMMA進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析. 由圖2可見， 4種納米粒子都出現(xiàn)了數(shù)個明顯的特征峰， 其中1095 cm-1處為Si—O—Si的不對稱伸縮振動吸收峰， 950 cm-1處為Si—OH的彎曲振動吸收峰， 799和467 cm-1處為Si—O的對稱伸縮振動峰和彎曲振動峰. MSNs-pCBMA和MSNs-pCBMA-DMMA在1730 cm-1處出現(xiàn)聚合物的C=O伸縮振動峰， 同時在1480和1380 cm-1處出現(xiàn)兩性離子聚合物的C—N和C—H伸縮振動峰［39］. MSNs-DMMA和MSNs-pCBMA-DMMA在1700 cm-1處出現(xiàn)了特征峰， 該峰為DMMA的C=C特征峰. 1730， 1480和1380 cm-1處出現(xiàn)的特征峰表明MSNs-pCBMA和MSNs-pCBMA-DMMA上已接枝pCBMA， 而1700 cm-1處 DMMA的C=C特征峰證明MSNs-DMMA和MSNs-pCBMA-DMMA上修飾DMMA成功.

Fig.2　FTIR spectra of four nanoparticles

2.2　納米粒子的表面電荷分析

選取3個不同的pH值（7.4， 6.5和5.7）作為變量研究了酸敏感分子DMMA修飾的MSNs-DMMA和MSNs-pCBMA-DMMA的表面電勢隨pH值的變化情況［27］， 結(jié)果如圖3所示.

由圖3可見， 在pH=7.4時， DMMA穩(wěn)定， MSNs-DMMA上的DMMA用羧酸基團(tuán)取代了粒子表面部分氨基， 使得粒子總體呈現(xiàn)出明顯區(qū)別于MSNs-NH2的負(fù)電位（-11.6 mV+17.6 mV）， 而MSNs-pCBMA由于接枝了電中性的pCBMA， 其電勢值（+10.16 mV）與MSNs-NH2相比明顯下降. 在MSNs-pCBMA-DMMA中pCBMA取代了粒子表面的部分氨基， DMMA的修飾量小， 其電勢值為+6.8 mV， 高于MSNs-DMMA粒子同時低于未修飾DMMA的MSNs-pCBMA粒子， 再次證明了DMMA修飾成功. 盡管在中性條件（pH=7.4）下， 2種酸敏感粒子MSNs-DMMA和MSNs-pCBMA-DMMA的電荷性質(zhì)不同（-11.6 mV+6.8 mV）， 但后者的凈電荷量更小， 更偏電中性， 將有利于粒子在黏液中的滲透.

Fig.3　Zeta?potentials of four nanoparticles at 37 ℃at pH of 7.4, 6.8 and 5.7 in 0.02 mol/L HEPES buffer

在pH=6.5時， 粒子表面的DMMA部分脫離使得表面氨基暴露， MSNs-DMMA和MSNs-pCBMA- DMMA的電勢都明顯升高（電勢升高量分別為+7.36和+5.05 mV）， 且略高于相應(yīng)對照組MSNs-NH2和MSNs-pCBMA的電勢升高量（+6.83和+4.67 mV）， 說明在此階段DMMA的脫離量較少； 但在pH=5.7時， DMMA脫離量增加， MSNs-DMMA的電勢升高值明顯高于MSNs-NH2（電勢升高量分別為+18.69和 +7.6 mV）， 而MSNs-pCBMA-DMMA的上升幅度也略高于MSNs-pCBMA的上升幅度（電勢升高量分別為+5.93和+3.90 mV）， 但由于其DMMA的修飾量小于MSNs-DMMA， 所以電勢上升低于MSNs- DMMA. 由此可以看出， 在pH值由7.4變化為5.7的過程中， MSNs-DMMA和MSNs-pCBMA-DMMA的電勢相比于對照組均表現(xiàn)出更強(qiáng)的隨pH降低而上升的趨勢， 證明了DMMA修飾的2種納米粒子MSNs-DMMA和MSNs-pCBMA-DMMA具有在pH=7.4～5.7范圍內(nèi)的響應(yīng)能力.

當(dāng)pH值從7.4變?yōu)?.5時， MSNs-pCBMA-DMMA由帶有極少的電荷（+6.8 mV）轉(zhuǎn)變?yōu)閹в休^多的正電荷（+11.8 mV）， 證明了pH響應(yīng)的高效性， 并符合本文預(yù)期設(shè)計（粒子幾乎不帶電以利于透過黏液層， 在透過黏液層后電荷轉(zhuǎn)變?yōu)檎姡?有利于與黏膜上皮細(xì)胞作用被攝?。? 當(dāng)pH值從7.4變?yōu)?.5時， MSNs-DMMA由帶有較多的負(fù)電（-11.6 mV）轉(zhuǎn)變?yōu)閹缀醪粠щ姾桑?4.4 mV）， 對其與黏液上皮細(xì)胞作用并沒有優(yōu)勢， 只有當(dāng)pH進(jìn)一步下降到5.7時， 才轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂休^高的正電荷（+14.3 mV）， 可與黏膜上皮細(xì)胞作用， 因此其pH應(yīng)用范圍低于MSNs-pCBMA-DMMA. 本文獲得的MSNs-DMMA在pH值從7.4變?yōu)?.5時， 電勢升高量高達(dá)7.36 mV， 而文獻(xiàn)［40］報道的DMMA修飾的介孔二氧化硅納米粒子在此范圍內(nèi)電勢變化低于5 mV， 表明合成的MSNs-DMMA具有極強(qiáng)的pH響應(yīng)能力.

2.3　黏液滲透實驗

以含豬腸胃黏蛋白（Ⅱ型）、 卵磷脂和牛血清白蛋白（BSA）的溶液（pH=6.5）為模擬黏液， 利用 Transwell?小室建立體外模擬黏液層模型， 研究了粒子在黏液中的滲透能力， 由圖4和圖5所示. 可見， 在4 h時， MSNs-NH2， MSNs-pCBMA， MSNs-DMMA和MSNs-pCBMA-DMMA的滲透率分別為5.5%， 8.4%， 5.8%和16.3%. 以MSNs-NH2的app為標(biāo)準(zhǔn)計算相對表觀滲透系數(shù)， MSNs-pCBMA， MSNs- DMMA和MSNs-pCBMA-DMMA的相對表觀滲透系數(shù)依次為1.52， 1.06和2.96.

Fig.4　Mucus penetration of four nanoparticles obtained by a mucus?containing Transwell? model

Fig.5　Relative apparent permeability coefficients of four nanoparticles across the mucus

a. MSNs-NH2； b. MSNs-pCBMA； c. MSNs-DMMA； d. MSNs-pCBMA-DMMA. *<0.05， **<0.01MSNs-NH2.

根據(jù)圖4和圖5結(jié)果可知， MSNs-DMMA粒子的滲透效果與MSNs-NH2無明顯區(qū)別， 且均低于pCBMA接枝后的MSNs-pCBMA和MSNs-pCBMA-DMMA. 這是由于盡管DMMA取代了MSNs-NH2表面的部分氨基， 使得MSNs-DMMA粒子幾乎不帶電（pH=6.5， -4.4 mV， 圖3）， 但介孔二氧化硅表面還有大量疏水性基團(tuán)可以與黏液中多種蛋白發(fā)生黏附作用， 從而被黏液滯留， 不利于滲透.

相比之下， 聚合物pCBMA可以吸附水分子在粒子表面形成較強(qiáng)的水化層抵抗黏液中黏蛋白的黏附， 同時還取代了MSNs-NH2粒子表面部分氨基降低了MSNs-pCBMA粒子電勢（pH=6.5， +14.86 mV+24.43 mV， 圖3）， 因此MSNs-pCBMA的滲透率比未黏惰性修飾的MSNs-NH2高. 值得注意的是， MSNs-pCBMA-DMMA的相對表觀滲透系數(shù)最大， 且在4 h內(nèi)模擬黏液滲透率達(dá)到16.3%， 為MSNs- pCBMA的1.9倍， MSNs-NH2的3倍. 除了pCBMA接枝黏惰化的貢獻(xiàn)外， DMMA修飾也發(fā)揮了重要作用. pCBMA的接枝降低了粒子表面原位氨基數(shù)量， 因而較少量的DMMA修飾即可對MSNs-pCBMA-DMMA的電勢產(chǎn)生影響（pH=6.5， +14.86 mV+11.80 mV， 圖3）， 在粒子剛加入模擬黏液中時， 粒子表面電勢接近中性（pH=7.4， +6.8 mV， 圖3）， 降低了黏蛋白的黏附作用， 利于黏液穿透. 實驗結(jié)果表明， 黏惰性材料pCBMA的接枝和酸敏感分子DMMA的修飾能夠有效提升介孔二氧化硅納米粒子的黏液穿透能力， 并且兩者缺一不可. 此外， MSNs-pCBMA-DMMA粒子在黏液中的表觀滲透系數(shù)為2.06×10-5cm/s， 是文獻(xiàn)［41］報道的乳清蛋白納米顆粒在黏液中的表觀滲透系數(shù)的2.5倍. 這證明所合成的MSNs-pCBMA-DMMA粒子具有強(qiáng)大的黏液穿透能力.

2.4　細(xì)胞毒性實驗

以產(chǎn)黏液的人肺腺癌細(xì)胞Calu-3為模型細(xì)胞， 利用MTT法評估了納米粒子的細(xì)胞毒性. 將不同濃度（10， 50和100 μg/mL）的MSNs-NH2， MSNs-pCBMA， MSNs-DMMA和MSNs-pCBMA-DMMA分別與 Calu-3細(xì)胞共培養(yǎng)24 h， 統(tǒng)計共培養(yǎng)前后細(xì)胞數(shù)量變化以考察納米粒子對Calu-3細(xì)胞的毒性. 由圖6可見， 10， 50和100 μg/mL的MSNs-NH2與Calu-3細(xì)胞共培養(yǎng)后， 細(xì)胞存活率分別為92.5%， 84.0%和77.4%， MSNs-pCBMA相應(yīng)的細(xì)胞存活率為93.2%， 90.0%和88.9%. 用10， 50和100 μg/mL的MSNs-DMMA粒子處理細(xì)胞后， 細(xì)胞的存活率分別為85.7%， 78.1%和69.3%； 而MSNs-pCBMA-DMMA相應(yīng)的細(xì)胞存活率為94.0%， 87.3%和78.3%. 根據(jù)Calu-3細(xì)胞的細(xì)胞存活率數(shù)據(jù)， DMMA修飾的納米粒子對Calu-3細(xì)胞的毒性高于未修飾的粒子， 表明DMMA對Calu-3細(xì)胞有一定的毒性. 而在相同濃度下， pCBMA修飾的MSNs-pCBMA， MSNs-pCBMA-DMMA相比于MSNs-NH2， MSNs-DMMA毒性更小， 說明pCBMA具有良好的生物相容性， 能夠降低納米粒子對細(xì)胞的毒性. 根據(jù) ISO10993-5標(biāo)準(zhǔn)， 當(dāng)細(xì)胞存活率高于75%時， 其毒性分級處于一級. 在實驗研究的粒子濃度范圍內(nèi)， MSNs-pCBMA-DMMA的細(xì)胞存活率高于75%， 因而認(rèn)為MSNs-pCBMA-DMMA具有良好的生物相容性.

Fig.6　Cytotoxicitiy of four nanoparticles of 0, 10, 50 and 100 μg/mL against Calu?3 cells cultured for 24 h

2.5　細(xì)胞攝取實驗

以Calu-3細(xì)胞為模型細(xì)胞， 評估了Calu-3細(xì)胞對4種納米粒子的攝取能力. 將熒光標(biāo)記的納米粒子溶液（50 μg/mL）與Calu-3細(xì)胞共培養(yǎng)4 h， 于熒光顯微鏡下觀察納米粒子和細(xì)胞的位置. 如圖7所示， 在MSNs-NH2， MSNs-pCBMA和MSNs-DMMA實驗組中細(xì)胞周圍觀察不到明顯的綠色熒光， 而在MSNs-pCBMA-DMMA組中則有部分細(xì)胞中出現(xiàn)了綠色熒光， 表明MSNs-pCBMA-DMMA成功地進(jìn)入細(xì)胞， 而其它3種粒子未進(jìn)入細(xì)胞. Calu-3細(xì)胞會分泌黏液， 黏液pH值一般為6～7［42，43］. 在攝取體系中， MSNs-NH2和MSNs-DMMA的4 h模擬黏液滲透率相近（分別為5.5%和5.8%， 圖4）， 黏液滲透能力差， 很難穿透Calu-3細(xì)胞的黏液到達(dá)細(xì)胞表面［圖7（A）和圖7（B）］. 而MSNs-pCBMA的模擬黏液滲透能力雖然較MSNs-NH2和MSNs-DMMA更強(qiáng)（4 h模擬黏液滲透率為8.4%， 圖4）， 但在4 h內(nèi)并未有效穿透Calu-3細(xì)胞的黏液， 因此也難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部［圖7（C）］. MSNs-pCBMA-DMMA在4 h內(nèi)的模擬黏液滲透率最高（16.8%， 圖4）， 而且經(jīng)過黏液弱酸性環(huán)境的孵育， 其表面電勢轉(zhuǎn)變?yōu)?11.8 mV（圖3）， 表面存在的大量正電荷能與細(xì)胞膜上的負(fù)電荷相互吸引， 進(jìn)而快速地進(jìn)入細(xì)胞［圖7（D）］， 證明MSNs-pCBMA-DMMA是一種優(yōu)良的跨黏膜遞送藥物的納米粒子.

Fig.7　Cell imaging of Calu?3 co?cultured respectively with MSNs?NH2(A), MSNs?pCBMA(B), MSNs?DMMA(C) and MSNs?pCBMA?DMMA(D) for 4 h

3 結(jié) 論

采用溶膠-凝膠法合成了介孔二氧化硅納米粒子MSNs-NH2， 以MSNs-NH2作為出發(fā)粒子接枝黏液惰性兩性離子聚合物pCBMA并修飾酸敏感分子DMMA制備了MSNs-pCBMA-DMMA. pCBMA吸附水分子形成水化層能夠增強(qiáng)納米粒子在黏液中的抗黏附性， 而DMMA的修飾則賦予納米粒子pH響應(yīng)能力使其更快地被細(xì)胞攝取. TEM和FTIR等結(jié)果表明， MSNs-pCBMA-DMMA成功合成. 電勢測定結(jié)果表明， 在弱酸性環(huán)境中MSNs-pCBMA-DMMA可以斷裂DMMA基團(tuán)導(dǎo)致表面電位上升， 具有高效pH響應(yīng)能力. 黏液滲透實驗顯示， pCBMA具有加速粒子滲透的能力， 而DMMA的修飾進(jìn)一步放大了這種加速效應(yīng)， 在模擬黏液中以MSNs-NH2的app為標(biāo)準(zhǔn)計算得到的MSNs-pCBMA-DMMA的相對表觀滲透系數(shù)達(dá)到了2.96， 同時其4 h內(nèi)模擬黏液滲透率為16.3%， 是MSNs-NH2的3倍. MTT細(xì)胞毒性實驗表明， MSNs-pCBMA-DMMA具有良好的生物安全性. 根據(jù)體外細(xì)胞攝取實驗結(jié)果可知， 在4 h內(nèi)MSNs-pCBMA-DMMA粒子能夠有效地被細(xì)胞攝取. 本文針對納米粒子的黏液層滲透問題和細(xì)胞攝取問題， 提出了一種將黏液穿透粒子和酸敏感分子相結(jié)合的策略， 并得到了具有黏液惰性和酸敏感能力的納米粒子MSNs-pCBMA-DMMA， 為納米粒子應(yīng)用于黏膜相關(guān)疾病的活體診斷和治療提供了基礎(chǔ).

［1］ Li N.， Liu Y.， Guo P.， Huang R.， Liu Z. D.，， 2017，（3）， 161—166（李楠， 劉巖， 郭盼， 黃瑞， 劉志東. 天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2017，（3）， 161—166）

［2］ Chu B. B.， Wang H. Y.， He Y.，， 2021，（4）， 880—888

［3］ Yuan H.， Liang H. Y.， Hou P. D.， Li J.，， 2021，（4）， 840—845

［4］ Li S. X.， Yu S. F.，， 2005，（05）， 525—527（李曙霞， 于世鳳. 現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2005，（05）， 525—527）

［5］ Li W.， Zhao W. D.， Zhang W. Q.， Zhang W.， Guo Z.，， 2012，（7）， 69—71（李偉， 趙衛(wèi)東， 張威慶， 張煒， 郭壯. 山東醫(yī)藥， 2012，（7）， 69—71）

［6］ Creeth J. M.，， 1978，（1）， 17—24

［7］ Hovenberg H. W.， Davies J. R.， Carlstedt I.，， 1996，（1）， 319—324

［8］ Cone R. A.，， 2009，（2）， 75—85

［9］ Gao C. Y.， Wang Y.， Ye Z. H.， Lin Z. H.， Ma X.， He Q.，， 2020，（6）， 2000512

［10］ Popov A.，， 2020，（6）， 366—375

［11］ Liu M.， Zhang J.， Shan W.， Huang Y.，， 2015，（4）， 275—282

［12］ Wang Y. Y.， Lai S. K.， Suk J. S.， Pace A.， Cone R.， Hanes J.，， 2008，（50）， 9726—9729

［13］ Tang B. C.， Dawson M.， Lai S. K.， Wang Y. Y.， Suk J. S.， Yang M.， Zeitlin P.， Boyle M. P.， Fu J.， Hanes J.，， 2009，（46）， 19268—19273

［14］ Xu Q. G.， Ensign L. M.， Boylan N. J.， Schon A.， Gong X. Q.， Yang J. C.， Lamb N. W.， Cai S. T.， Yu T.， Freire E.， Hanes J.，， 2015，（9）， 9217—9227

［15］ Liu Y. X.， Kong T. J.， Yang Z. X.， Zhang Y. W.， Lei J. D.， Zhao P.，， 2021，（2）， 1223—1234

［16］ Lai C.， Hu H.， Xu D. F.，， 2021，（12）， 3013—3021

［17］ Yang M.， Lai S. K.， Wang Y. Y.， Zhong W. X.， Happe C.， Zhang M.， Fu J.， Hanes J.，， 2011，（11）， 2597—2600

［18］ Ostuni E.， Chapman R. G.， Holmlin R. E.， Takayama S.， Whitesides G. M.，， 2001，（18）， 5605—5620

［19］ Li L. Y.， Chen S. F.， Jiang S. Y.，， 2007，（11）， 1415—1427

［20］ Chen S. F.， Jiang S. Y.，， 2008，（2）， 335—338

［21］ Yang W.， Zhang L.， Wang S. L.， White A. D.， Jiang S. Y.，， 2009，（29）， 5617—5621

［22］ Vaisocherova H.， Yang W.， Zhang Z.， Cao Z. Q.， Cheng G.， Piliarik M.， Homola J.， Jiang S. Y.，， 2008，（20）， 7894—7901

［23］ Liu M.， Wu L.， Zhu X.， Shan W.， Li L.， Cui Y.， Huang Y.，， 2016，（35）， 5831—5841

［24］ Wang C.， Cheng L.， Liu Y. M.， Wang X. J.， Ma X. X.， Deng Z. Y.， Li Y. G.， Liu Z.，， 2013，（24）， 3077—3086

［25］ Chen J.， Ding J.， Zhang Y.， Xiao C. S.， Zhuang X. L.， Chen X. S.，， 2015，（3）， 397—405

［26］ Du J. Z.， Sun T. M.， Song W. J.， Wu J.， Wang J.，， 2010，（21）， 3621—3626

［27］ Chen S. Q.， Song G.， He C.， Hou M.， He W. D.， Li H. J.， Haleem A， Li Q. L.， He R. F.，， 2020，（12）， 2212—2221

［28］ Zhou G. X.， Li L. S.， Xing J.， Cai J.， Chen J. Q.， Liu P. D.， Gu N.， Ji M.，， 2017，（2）， 490—499

［29］ Zhang Z.， Chao T.， Chen S. F.， Jiang S. Y.，， 2006，（24）， 10072—10077

［30］ Zhang L. Q.，， Tianjin University， Tianjin， 2018（張立倩. 聚羧基甜菜堿接枝載體的制備及其固定化酶的研究， 天津： 天津大學(xué)， 2018）

［31］ Liu Y. J.， Dai R.， Wei Q. Y.， Li W. Z.， Zhu G.， Chi H.， Guo Z. M.， Wang L.， Cui C. H.， Xu J. Q.， Ma K.，， 2019，（47）， 44582—44592

［32］ Mcgill S. L.， Smyth H. D. C.，， 2010，（6）， 2280—2288

［33］ Li X. T.，， Huazhong Agricultural University， Wuhen， 2014（李曉彤. 復(fù)合熒光二氧化硅納米粒子的可控制備及其熒光性能探究， 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2014）

［34］ Guo Q.， Zheng Y. X.， Wu L.， Zhou R.， Liu C. D.， Huang Y.，， 2019，（03）， 547—554 （郭權(quán)， 鄭雅嫻， 吳蕾， 周銳， 劉晨冬， 黃園. 藥學(xué)學(xué)報， 2019，（03）， 547—554）

［35］ Fang L.，， Tianjin University， Tianjin， 2017（房蕾. 基于pH響應(yīng)的納米載體的制備及其黏液滲透性能的研究， 天津： 天津大學(xué)， 2017）

［36］ Wang X.，， Jilin University， Changchun， 2017（王雪. 介孔有機(jī)硅雜化納米材料的設(shè)計合成與性質(zhì)研究， 長春； 吉林大學(xué)， 2017）

［37］ Gao Y.， Zhong S. L.， Xu L. F.， He S. H.， Dou Y. M.， Zhao S. N.， Chen P.， Cui X.， J.，， 2019，， 130—137

［38］ Slowing I. I.， Vivero?Escoto J. L.， Wu C. W.， Lin V. S. Y.，， 2008，（11）， 1278—1288

［39］ Zhu Y. H.， Sundaram H. S.， Liu S. J.， Zhang L.， Xu X. W.， Yu Q. M.， Xu J. Q.， Jiang S. Y.，， 2014，（5）， 1845—1851

［40］ Guo C.，， Huazhong University of Science and Technology， Wuhan， 2019（郭晨. 介孔二氧化硅納米復(fù)合載藥系統(tǒng)的構(gòu)建及其抗腫瘤效應(yīng)， 武漢： 華中科技大學(xué)， 2019）

［41］ Cai J. J.，， Beijing University of Chemical Technology， Beijing， 2018（柴靜靜. 乳清蛋白納米載體與腸粘液層滲透性的構(gòu)效關(guān)系的研究， 北京： 北京化工大學(xué)， 2018）

［42］ Jayaraman S.， Joo N. S.， Reitz B.， Wine J. J.， Verkman A. S.，， 2001，（14）， 8119—8123

［43］ Hehar S. S.， Mason J. D. T.， Stephen A. B.， Washington N.， Jones S.， Jackson S. J.， Bush D.，.， 1999，（1）， 24—25

Effects of Muco-inert and Acid-sensitive Modification on Mucosal Penetration of Nanoparticles

JIFa1， LIULing1， YULinling1，2*， SUNYan1，2

（1.，，，300350，，2.，，，，）

Gastric cancer， cervical carcinoma， lung cancer are occurred in mucosa， and the nanoparticles provided a competitive way for the diagnosis and therapy of these diseases. However， the mucus layer which contains mucus and other viscous substances could adsorb and remove the foreign substance， resulting the hindered penetration of nanoparticles. In this paper， a pH-responsive mucus-inert nanoparticle was designed for penetrating mucus and entering mucosal epithelial cells. In brief， mesoporous silica nanoparticles with surface amination（MSNs-NH2） was prepared by sol-gel method. Then， the zwitterionic polymer was modified to the surface of MSNs-NH2by atom transfer radical polymerization to form mucus-inert particles（MSNs-pCBMA）. Acid-sensitive molecule DMMA was modified onto MSNs-pCBMA through amino groups on the particle surface to obtain pH-responsive mucus-inert nanoparticles（MSNs-pCBMA-DMMA）. The results of transmission electron microscopy（TEM）， proton nuclear magnetic resonance（1H NMR），F(xiàn)ourier transform infrared spectrophotometer（FTIR） andpotential measurements showed that four nanoparticles were synthesized successfully， and MSNs-pCBMA-DMMA exhibited sensitive pH response at pH= 7.4—5.7. A mucus-containing Transwell?model was used to study the permeability of nanoparticles in mucus. The penetration results showed that within 4 h， the mucus permeability of MSNs-pCBMA-DMMA reached 16.3%， 1.9 times that of MSNs-pCBMA and 3 times that of MSNs-NH2， and its relative apparent permeability coefficient reached 2.96 calculated with the apparent penetration coefficient（app） of MSNs-NH2as the reference. In addition， the grafting pCBMA improved the penetration rate of nanoparticles in mucus and the modification of DMMA further improved the penetration rate. Cytotoxic test showed that the viability of cells cultured with 100 μg/mL MSNs- pCBMA-DMMA was 78.3% in 24 h， indicating its good biosafety. The cellular uptake experiment showed that MSNs-pCBMA-DMMA could be endocytosed effectively at 4 h， and exhibited better endocytosis performance compared with other particles. The work proved that the combination of mucus inertia and acid sensitivity can effectively promote the mucosal permeability of nanoparticles， and MSNs-pCBMA-DMMA has excellent mucus permeability. The experimental results would benefit the design of nanoparticles for the diagnosis and therapy of mucosal diseases.

Nanoparticles； Zwitterionic polymer； Diffusion； Cell uptake； Mucus penetration

O631； TQ460.1

A

10.7503/cjcu20210837

2021-12-17

2022-02-15.

余林玲, 女, 博士, 副教授, 主要從事生物分離、 生物催化和納米馬達(dá)的研究. E-mail: yulinling@tju.edu.cn

國家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號: 21878223, 21621004)和天津市自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號: 19JCQNJC05200)資助.

Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos.21878223, 21621004) and the Natural Science Foundation of Tianjin from Tianjin Municipal Science and Technology Commission, China(No.19JCQNJC05200).

（Ed.： L， H， W， K）