動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測的方法驗證

郭 琳 孫秀菊 郭艷瓊 梁 海 王建軍 馬占山 何建東

（1包頭市農(nóng)牧科學(xué)技術(shù)研究所，內(nèi)蒙古包頭 014000；2包頭市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古包頭 014000）

方法驗證是指實驗室通過核查，提供客觀、有效的證據(jù)證明滿足檢測方法規(guī)定的要求[1]。方法驗證是保證結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的前提和基礎(chǔ)，實驗室在引用和使用標(biāo)準(zhǔn)方法之前，應(yīng)認(rèn)真研究標(biāo)準(zhǔn)方法中的內(nèi)容和要求，如人員、設(shè)備設(shè)施、場所環(huán)境等條件。此外，還應(yīng)通過試驗驗證實驗室是否有執(zhí)行該標(biāo)準(zhǔn)方法的技術(shù)能力[2-6]。

β-受體激動劑又稱“瘦肉精”，人如果食用含有β-受體激動劑殘留的動物組織，當(dāng)殘留量達到一定程度時就會對人體造成毒副作用，甚至急性中毒。自1997年開始，我國就將近有20種β-受體激動劑列入養(yǎng)殖禁用名單。因此，為保障食品安全，對動物源性食品中β-受體激動劑殘留的準(zhǔn)確檢測具有重大意義。本文以《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（農(nóng)業(yè)部1025號公告-18-2008）為基礎(chǔ)，對特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、氯丙那林、萊克多巴胺、噴布特羅、克侖特羅等7種化合物進行方法優(yōu)化驗證，驗證主要內(nèi)容包括線性范圍、方法檢出限、方法定量限、正確度、精密度。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

主要儀器有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（Agilent1260-6420）、恒溫水浴振蕩器、高速離心機、酸度計、渦旋振蕩器、全自動氮吹儀。

主要試劑有特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、氯丙那林、萊克多巴胺、噴布特羅、克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)品；乙酸乙酯、叔丁基甲醚、甲醇，均為色譜級；β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，2%甲酸水溶液，3%氨水甲醇溶液，0.2 mol/L乙酸銨緩沖液，0.1 mol/L高氯酸溶液，10 mol/L氫氧化鈉溶液。

1.2 試驗方法

1.2.1 前處理過程。稱取2.00 g肉樣于50 mL離心管中，加入8.0 mL 0.2 mol/L乙酸銨緩沖液（pH值=5.2）、40 μL β-鹽酸葡萄糖醛苷酶和芳基硫酸酯酶，渦旋混勻，于37℃下避光水浴振蕩16 h。取出冷卻至室溫之后，渦旋混勻，在10 000 r/min條件下高速離心10 min，然后將上清液轉(zhuǎn)移至另一個50 mL離心管中，加入5 mL 0.1 mol/L高氯酸溶液，渦旋混勻，用高氯酸調(diào)節(jié)pH值至1.0±0.2，在10 000 r/min條件下高速離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一個50 mL離心管中，用10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至9.5±0.2，加15 mL乙酸乙酯，渦旋混勻，振蕩10 min，在5 000 r/min條件下離心5 min，移取上層有機相至另一個50 mL離心管內(nèi)。在下層水相中加入10 mL叔丁基甲醚，渦旋混勻，并振蕩10 min，在5 000 r/min條件下離心5 min，合并有機相，50℃下氮氣吹干，用5 mL 2%甲酸溶液溶解，備用。

取全部備用液過經(jīng)甲醇、水、2%甲酸溶液各3 mL活化的MCX固相萃取柱，再依次使用2%甲酸溶液、甲醇各3 mL淋洗，抽干，用2.5 mL 3%氨水甲醇洗脫，將洗脫液在50℃下氮氣吹干。殘余物用0.2 mL甲醇-0.1%甲酸溶液（10 mL+90 mL混合）溶解，渦旋混勻，15 000 r/min高速離心10 min后，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后上機待測[7]。

1.2.2 儀器條件。色譜條件：色譜柱為Eclipse Plus C18（100 mm×2.1 mm×3.5μm）；流動相 A 為 0.1%甲酸水，流動相B為0.1%甲酸甲醇；柱溫為30℃；進樣量為10 μL；流速 0.3 mL/min。 梯度洗脫程序：0 min，97.0%流動相 A，3.0%流動相 B；0.50 min，97.0%流動相 A，3.0%流動相 B；2.00 min，50.0%流動相 A，50.0%流動相 B；2.10 min，10.0%流動相 A，90.0%流動相 B；7.50 min，10.0%流動相 A，90.0%流動相 B；7.60 min，97.0%流動相 A，3.0%流動相 B；16.00 min，97.0%流動相A，3.0%流動相B。質(zhì)譜：電噴霧離子源正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測。干燥氣溫度300℃，流速13 L/min。

1.2.3 方法驗證過程。具體包括以下幾方面的內(nèi)容。

（1）線性范圍。稱取2.00 g空白試樣，分別添加7種β-受體激動劑混標(biāo)工作液，制得濃度為0、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00 μg/kg 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照前述前處理過程進行處理，過0.22 μm濾膜備用。

（2）方法檢出限、定量限。以信噪比等于3的標(biāo)液濃度作為檢出限，以信噪比等于10的標(biāo)液濃度作為定量限，該標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定7種化合物檢出限為0.25 μg/kg、定量限為 0.5 μg/kg。 稱取 2.00 g 空白樣品，添加檢出限和定量限濃度水平目標(biāo)化合物，按照上述前處理步驟處理后，備用，待上機檢測。

（3）正確度。采用加標(biāo)回收方式驗證正確度。β-受體激動劑類是禁用藥，針對食品中的禁用物質(zhì)，回收率應(yīng)在方法測定低限、兩倍方法測定低限和十倍方法測定低限進行3個水平試驗[2]。根據(jù)方法中給出的檢出限和定量限，依次添加 0.25、0.50、2.50 μg/kg 3個水平濃度，進行加標(biāo)回收試驗。

（4）精密度。準(zhǔn)確稱取2.00 g空白試樣，分別添加7種β-受體激動劑混標(biāo)工作液至加標(biāo)量為標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度，本試驗以添加量為0.5 μg/kg為例，按照前處理過程操作，上機平行測定6次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

在Eclipse Plus C18色譜柱上，對比了0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸甲醇作為流動相對分離效果的影響。結(jié)果表明，在Eclipse Plus C18色譜柱上，0.1%甲酸甲醇的分離度優(yōu)于0.1%甲酸乙腈，0.1%甲酸水溶液的分離度優(yōu)于純水。因此，選用0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇作為流動相進行梯度洗脫。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

母離子優(yōu)化，即分別對每一種單標(biāo)溶液進行全質(zhì)量數(shù)掃描，得到化合物的準(zhǔn)分子離子。子離子優(yōu)化，即對其母離子進行電子轟擊，得到碰撞產(chǎn)生的子離子，選擇2個響應(yīng)值比較高的子離子，與母離子組成2組特定離子對，作為該化合物的定量離子對和定性離子對。毛細管電壓和碰撞能量優(yōu)化，即分別對7種目標(biāo)化合物施加毛細管電壓70～160 V，以5 V為梯度進行優(yōu)化，在最佳毛細管電壓條件下，對每一對離子對設(shè)置碰撞能量5～50 eV，以3 eV為梯度進行優(yōu)化，分別得到7種目標(biāo)化合物的最佳毛細管電壓和碰撞能量。目標(biāo)化合物的定性離子、定量離子以及碰撞電壓和能量見表1。

表1 7種β-受體激動劑的毛細管電壓和碰撞能量

2.3 工作曲線及線性范圍

將處理好的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按照濃度由低到高的順序供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，以各標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)、各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定量離子色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1～7所示。7種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)滿足《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）中相關(guān)系數(shù)不應(yīng)低于0.99的要求[3]。

2.4 方法檢出限與定量限

由表2可知：7種目標(biāo)化合物的檢出限信噪比（S/N）為 28.2～636.7，均大于 3；定量限信噪比（S/N）為62.7～2 972.1，均大于10。說明在現(xiàn)有條件下該方法的檢出限和定量限可以滿足標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的檢出限 0.25 μg/kg 和定量限 0.5 μg/kg。

表2 方法檢出限、定量限數(shù)據(jù)

2.5 正確度

以空白樣品為本底，添加7種不同濃度β-受體激動劑，其回收率范圍為73.2%～102.4%，加標(biāo)回收試驗結(jié)果見表3。滿足標(biāo)準(zhǔn)方法中的要求，即以空白添加標(biāo)準(zhǔn)校正，其回收率范圍為70%～120%。

表3 試樣加標(biāo)回收率測定數(shù)據(jù)

2.6 精密度

由表4可知，在空白樣品中添加7種β-受體激動劑進行6次重復(fù)試驗，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果為6.6%～11.4%，滿足標(biāo)準(zhǔn)方法中批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)≤20%的要求。

表4 精密度測試數(shù)據(jù)

3 結(jié)論與討論

本文以《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（農(nóng)業(yè)部1025號公告-18-2008）為基礎(chǔ)，以葡萄糖醛苷酶、芳基硫酸酯酶為酶解劑，用pH值5.2的乙酸-乙酸銨緩沖溶液進行提取，經(jīng)高氯酸沉淀蛋白后，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至9.5，再分別經(jīng)乙酸乙酯和叔丁基甲醚萃取后，過MCX固相萃取柱凈化，Eclipse Plus C18色譜柱分離，以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇為流動相，UPLCMS/MS上機測試，對特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、氯丙那林、萊克多巴胺、噴布特羅、克侖特羅等7種化合物進行方法優(yōu)化驗證。結(jié)果表明：特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、氯丙那林、萊克多巴胺、噴布特羅、克侖特羅等7種目標(biāo)化合物在0～2.5 μg/kg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達0.99以上，方法檢出限、定量限滿足方法中的要求，平均回收率73.2%～102.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%。本文建立了畜產(chǎn)品中特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、氯丙那林、萊克多巴胺、噴布特羅、克侖特羅等7種β-受體激動劑的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法的驗證過程，證實了在現(xiàn)有的設(shè)備設(shè)施、人員、環(huán)境等條件下有能力正確運用本方法進行檢測。