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    藤茶總黃酮提取工藝優(yōu)化與抗氧化 活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究

    2022-07-18 05:45:42許陳思菡沈周媛袁琢越向延衛(wèi)
    現(xiàn)代食品 2022年11期
    關(guān)鍵詞:藤茶測定法楊梅

    ◎ 許陳思菡,沈周媛,袁琢越,路 璐,向延衛(wèi),丁 越

    (上海中醫(yī)藥大學,上海 201203)

    藤茶,學名顯齒蛇葡萄,由被子植物門木蘭綱蕓香目葡萄科蛇葡萄(Ampelopsis grossedentata)的嫩莖葉加工而成,盛產(chǎn)于我國湖北、湖南、江西以及福建等南方各地[1-2]。藤茶性涼,味甘淡,有清熱解毒、消腫利咽、消癰散結(jié)的功效,可用于治療口腔潰瘍、咽喉腫痛、感冒發(fā)熱、濕熱黃疸、目赤腫痛和癰腫瘡癤等癥狀[3]?,F(xiàn)代研究表明藤茶具有較好的抗氧化、抗腫瘤、抗炎抑菌、抗流感、降血壓、降血脂及保肝等多種保健功效和藥理作用,是一種極具開發(fā)潛力的中草藥[4-10]。黃酮類化合物是藤茶中最主要的成分,藤茶中的黃酮含量是目前被研究的植物中最高的,因此藤茶又被稱為“黃酮之王”[11]。藤茶中總黃酮含量高達45.52%,其中二氫楊梅素的含量達藤茶總黃酮含量的58.10%~58.80%[12]。目前,藤茶產(chǎn)品開發(fā)尚處于初級階段,以茶類產(chǎn)品為主,即沖泡型商品。然而藤茶曬干后,其表面的白霜會導致沖泡后外觀及口感不佳。從藤茶的開發(fā)利用來講,藤茶提取物應(yīng)用到食品中安全健康,具有廣闊前景。本研究采用紫外分光光度計法檢測藤茶及其提取物中總黃酮含量,并對藤茶的水提工藝進行優(yōu)化,測定藤茶提取物及其主要活性成分的抗氧化活性,研究藤茶的抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ),以期為藤茶的進一步研究和開發(fā)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    藤茶原茶,市售湖南張家界野生特級藤茶(批號:20210816)。

    1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH),購自上海鴻永生物科技有限公司;蘆丁標準品(純度92.6%,供UV檢測),購自中國食品藥品檢定研究院;抗壞血酸(維生素C),購自國藥集團化學試劑有限公司;二氫楊梅素標準品(純度98.38%,供HPLC測定)、楊梅素標準品(純度99.69%,供HPLC測定)、檞皮素標準品(純度98.05%,供HPLC測定)、橙皮素標準品(純度98.60%,供HPLC測定)和芹菜素標準品(純度98.03%,供HPLC測定),均購自上海鴻永生物科技有限公司。乙醇、甲醇、硝酸鋁、氫氧化鈉和亞硝酸鈉均為分析純,均購自國藥集團化學試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    JFSD-100-II微型高速粉碎機,上海嘉定糧油儀器有限公司;YH系列電熱器,500 mL,江蘇近湖鎮(zhèn)教學儀器廠;DK-S24電熱恒溫水浴鍋,上海精密實驗設(shè)備有限公司;XS105電子天平,梅特勒-托利多集團;UV2550紫外分光光度計,日本島津公司;酶標儀,BioTek;SB5200D超聲波清洗機,寧波新芝生物科技股份有限公司。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 藤茶總黃酮水提工藝研究

    (1)提取方法。取50 g藤茶,加入適量的水煎煮,合并幾次水煎液,過濾。

    (2)單因素實驗設(shè)計。取50 g藤茶,分別加入不同料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50(g∶mL)的水煎煮1.0 h、1.5 h、2.0 h和2.5 h,煎煮1、2、3次,合并水煎液,過濾,采用直接測定法測定藤茶水煎液中藤茶總黃酮的濃度,并計算總黃酮提取率,考察不同料液比、不同提取時間、不同提取次數(shù)對藤茶總黃酮提取率的影響。

    (3)水提工藝正交試驗設(shè)計。采用L9(34)正交試驗表,考察料液比(1∶20、1∶30、1∶40)、提取時間(1.0 h、1.5 h、2.0 h)和提取次數(shù)(1次、2次、3次)3個因素,以總黃酮提取率為考察指標,分別采用直觀分析和正交分析進行水提工藝條件的優(yōu)選,確定最佳水提提取工藝。

    1.3.2 藤茶中總黃酮含量測定方法的建立與比較

    (1)二氫楊梅素標準品溶液制備精密稱定適量二氫楊梅素標準品,用95%乙醇溶解并定容于25 mL容量瓶中,配成0.499 6 mg·mL-1的標準品溶液,備用。

    (2)樣品溶液制備稱取5 g藤茶,10倍量75%乙醇浸泡18 h,超聲1 h,過濾,取1 mL濾液于50 mL容量瓶中,95%乙醇定容,然后取5 mL于50 mL容量瓶中,95%乙醇稀釋至刻度線,備用。

    (3)直接測定法精密吸取藤茶樣品溶液2.5 mL于25 mL容量瓶中,另取0.5 mL二氫楊梅素標準品溶液于另一個25 mL容量瓶中,并采用95%乙醇定容,搖勻后靜置10 min,在200~700 nm波長進行掃描,根據(jù)掃描光譜圖,確定該方法的最適吸收波長為294 nm。然后分別準確吸取0.250 mL、0.375 mL、0.500 mL、0.625 mL和0.750 mL二氫楊梅素標準品溶液于5個不同25 mL容量瓶,95%乙醇定容,搖勻,靜置10 min,在此方法最適吸收波長處測定吸光度,繪制標準曲線,測定藤茶樣品溶液的吸光度并計算其中藤茶總黃酮的含量。

    (4)硝酸鋁-亞硝酸鈉-氫氧化鈉[Al(NO3)3-NaNO2-NaOH)]比色法(簡稱硝酸鋁法)。精密吸取藤茶樣品溶液1.5 mL于25 mL容量瓶中,另取0.25 mL二氫楊梅素標準品溶液于另一個25 mL容量瓶中,加入5 mL蒸餾水,搖勻后加入1 mL 5% NaNO2溶液搖勻并靜置6 min,加入1 mL 10% Al(NO3)3溶液搖勻靜置6 min,加入10 mL 10 mol·L-1NaOH溶液,加蒸餾水至刻度線后搖勻靜置15 min,在200~700 nm波長進行掃描,根據(jù)掃描光譜圖,確定該方法的最適吸收波長為324 nm。然后分別準確吸取0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL和0.35 mL二氫楊梅素標準品溶液于25 mL容量瓶,按上述方法進行處理,在此方法最適吸收波長處測定吸光度,繪制標準曲線,測定藤茶樣品溶液的吸光度并計算其中藤茶總黃酮的含量。

    1.3.3 藤茶總黃酮水提物及其主要化合物抗氧化活性評價

    (1)DPPH溶液的制備。精密稱取DPPH試劑適量,加乙醇溶解配制成0.65 mmol·L-1。

    (2)樣品溶液的制備。精密稱取2.00 mg藤茶提取物,加入乙醇溶液,定容至10 mL,恒溫超聲提取30 min,冷卻至室溫,用50%乙醇逐級稀釋成系列濃度的樣品溶液。

    (3)對照品溶液的制備。精密稱取蘆丁、抗壞血酸、二氫楊梅素、楊梅素、槲皮素和橙皮素適量,加入二甲基亞砜適量配成20 mmol·L-1母液,用50%乙醇逐級稀釋成系列濃度的對照品溶液。

    (4)抗氧化活性的測定。精密量取10 μL樣品提取液和對照品溶液,分別加入有100 μL DPPH溶液的96孔板中,充分混勻,加入140 μL的50%乙醇,室溫避光反應(yīng)1 h,混勻,在517 nm下測定吸光度。以加入50%乙醇溶液為空白對照,各平行3份。并計算抑制率:

    式中:A1為樣品溶液的吸光度;A0為空白對照溶液的吸光度。

    分別以各樣品溶液濃度和抑制率進行線形回歸,并計算抑制率為50%時,待測樣品的濃度值,即半抑制濃度IC50。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 方法學考察

    2.1.1 線性關(guān)系考察

    分別準確吸取0.250 mL、0.375 mL、0.500 mL、0.625 mL和0.750 mL二氫楊梅素標準品溶液于25 mL容量瓶,95%乙醇定容,搖勻,靜置10 min,在最適吸收波長處(294 nm)測定吸光度,以吸光度(Y)對各對照品濃度(X)進行線性回歸。

    分別準確吸取0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL和0.35 mL二氫楊梅素標準品溶液于25 mL容量瓶,加入5 mL蒸餾水,搖勻后加入1 mL 5% NaNO2溶液搖勻并靜置6 min,加入1 mL 10% Al(NO3)3溶液搖勻靜置6 min,加入10 mL 10 mol·L-1NaOH溶液,加蒸餾水至刻度線后搖勻靜置15 min,在最適吸收波長處測定吸光度(324 nm),以吸光度(Y)對各對照品濃度(X)進行線性回歸,評價兩種檢測方法的線性關(guān)系。

    直接測定法和硝酸鋁法的線性關(guān)系見表1,以二氫楊梅素標準品溶液的系列濃度(μg·mL-1)為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線,分別得到兩種方法相應(yīng)的線性回歸方程。直接測定法在線性范圍為4.996 ~ 14.988 μg·mL-1時,R2為 0.999 3,線性關(guān)系較好;硝酸鋁法在線性范圍為2.998~6.994 μg·mL-1時,R2為0.999 7,線性關(guān)系較好。

    表1 兩種測定方法的線性關(guān)系表

    2.1.2 精密度實驗

    準確移取上述藤茶樣品溶液2.5 mL和1.5 mL,分別按照1.3.2項下2種方法進行處理,然后在各方法的最大吸收波長處(294 nm和324 nm),在2 min內(nèi)對同一樣品溶液連續(xù)測定6次,計算測定吸光度的平均值和RSD值。直接測定法和硝酸鋁法測定藤茶樣品溶液總黃酮的精密度實驗中,RSD值分別為1.4%和1.8%,均小于3%,說明采用紫外分光光度計測定總黃酮精密度較好。

    2.1.3 重復(fù)性實驗

    分別按照1.3.2項下2種方法處理藤茶樣品溶液各5份,然后測定各藤茶樣品中總黃酮的含量,并計算其平均值和RSD值。結(jié)果表明,直接測定法和硝酸鋁法測定藤茶樣品溶液中總黃酮的含量分別為0.069 mg·mL-1和 0.083 1 mg·mL-1,RSD 值分別為 2.1%和2.4%,均小于5%,在誤差允許范圍內(nèi),說明采用上述兩種方法測定藤茶提取液中總黃酮的含量,均有較好的重復(fù)性。

    2.1.4 穩(wěn)定性實驗

    準確移取藤茶樣品溶液2.5 mL和1.5 mL,分別按照1.3.2項下2種總黃酮含量測定方法進行處理,然后在 0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h和4.0 h時,在各方法最大吸收波長處測定一次吸光值,共測定9次,計算各方法測定吸光度的平均值和RSD值。穩(wěn)定性實驗顯示,直接測定法在4 h內(nèi)的穩(wěn)定性最好,RSD值僅為1.3%,硝酸鋁法在4 h內(nèi)的穩(wěn)定性最差,RSD值為7.8%,而在1.0 h內(nèi)的RSD值為2.1%,說明硝酸鋁法在1.0 h內(nèi)基本穩(wěn)定。由此可見,直接測定法建立的總黃酮測定方法穩(wěn)定性更好。

    2.1.5 加標回收率實驗

    準確移取藤茶樣品溶液1.25 mL和0.75 mL各9份藤茶樣品溶液,按照80%、100%和120%比例分別加入一定量的二氫楊梅素標準品溶液后,分別按照1.3.2項下2種總黃酮含量測定方法進行處理,分別在上述方法中最大吸收波長處(294 nm和324 nm)測定藤茶樣品溶液的吸光值,并計算其加樣回收率和RSD值。結(jié)果表明,采用直接測定法測定藤茶總黃酮的含量平均加樣回收率為100.5%,RSD為4.2%(表2);采用硝酸鋁顯色法測定藤茶總黃酮的含量平均加樣回收率為102.8%,RSD為6.2%(表3),兩種方法中硝酸鋁顯色法測定誤差較大。結(jié)合方法學考察結(jié)果,最終選擇直接測定法測定樣品中總黃酮的含量。

    表2 直接測定法加標回收率實驗結(jié)果表

    表3 硝酸鋁法加標回收率實驗結(jié)果表

    2.2 藤茶總黃酮水提工藝研究

    2.2.1 提取溶劑量的初步考察

    取50 g藤茶,分別加入不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50)的水煎煮2 h,煎煮2次,合并水煎液,過濾,采用直接測定法測定藤茶水煎液中藤茶總黃酮的濃度,并計算總黃酮提取率。

    由圖1可知,隨著提取液加入量的增加,藤茶總黃酮提取率先上升后逐漸下降,當料液比為1∶40時,總黃酮提取率達到最高。繼續(xù)增加提取液用量,總黃酮提取率不再升高,考慮到提取液增多,使得濃縮時間變長,降低了提取效率。綜合考慮經(jīng)濟效益,提取料液比選擇1∶40最佳。

    2.2.2 提取時間的初步考察

    實驗考察不同提取時間(1 h、1.5 h、2 h和2.5 h)對藤茶總黃酮提取效率的影響。由圖2可知,隨著提取時間的增加,總黃酮提取率先升高后降低,當提取時間達到2 h時,總黃酮提取率最高。綜合考慮,初步確定提取時間為2 h。

    2.2.3 提取次數(shù)的考察

    實驗考察不同提取次數(shù)(1次、2次、3次)對藤茶總黃酮提取效率的影響。由圖3可知,隨著提取次數(shù)的增加,總黃酮提取率先升高后降低,提取次數(shù)為2次時,總黃酮提取率最高。綜合考慮,初步確定提取次數(shù)為2次。

    2.2.4 水提工藝正交試驗及方差分析

    采用L9(34)正交試驗表,考察料液比(1∶20、1∶30、1∶40)、提取時間(1.0 h、1.5 h、2.0 h)和提取次數(shù)(1次、2次、3次)3個因素,以總黃酮提取率為考察指標,進行水提工藝條件的優(yōu)選,確定最佳水提提取工藝。正交實驗結(jié)果見表4,方差分析見表5。

    由表4可知,在不考慮交互作用的情況下,影響水提工藝的因素主次順序為料液比>提取時間>提取次數(shù)。由表5可知,料液比對總黃酮提取率有顯著性影響,而提取時間、提取次數(shù)在考察范圍內(nèi)影響不顯著。因此,藤茶總黃酮提取的最佳工藝條件為A3B3C2,即選用料液比1∶40,提取2 h,提取2次。

    表4 正交試驗結(jié)果表

    表5 正交試驗方差分析表

    2.2.5 最佳工藝驗證實驗

    由表6可知,按照最佳提取溶液開展驗證實驗,3次實驗藤茶總黃酮提取率分別為62.61%、62.40%和61.66%,說明該工藝穩(wěn)定可行。

    表6 重復(fù)性試驗結(jié)果表

    2.3 測定結(jié)果

    由表7可知,藤茶水提物對DPPH自由基清除能力強弱與黃酮含量呈正相關(guān)性,表明藤茶提取物中黃酮類化合物的抗氧化活性占主導地位。藤茶總黃酮水提物IC50=0.176 mg·mL-1,總黃酮DPPH自由基清除能力略低于維生素C(IC50=0.147 mg·mL-1),高于蘆?。↖C50=0.192 mg·mL-1)。藤茶中主要的4種黃酮類單體化合物均有較強的清除作用,對DPPH自由基清除能力隨著濃度的增加而增強。對DPPH自由基清除能力為楊梅素>槲皮素>二氫楊梅素>維生素C>橙皮素。

    表7 藤茶總黃酮提取物和主要黃酮類單體化合物抗氧化活性結(jié)果表

    3 結(jié)論

    本文以二氫楊梅素為對照品,選用直接測定法和硝酸鋁法對藤茶中總黃酮含量進行測定,結(jié)果表明兩種測定方法相對應(yīng)的最適吸收波長分別為294 nm和324 nm。在該波長下,直接測定法和硝酸鋁法測定藤茶總黃酮,在 4.996 ~ 14.988 μg·mL-1和 2.998 ~ 6.994 μg·mL-1線性關(guān)系良好;精密度、重復(fù)性良好;穩(wěn)定性結(jié)果表明,直接測定法在4 h內(nèi)的穩(wěn)定性最好,硝酸鋁法在1.0 h內(nèi)基本穩(wěn)定,4 h內(nèi)的穩(wěn)定性較差。同時,加標回收率實驗結(jié)果表明采用硝酸鋁顯色法測定藤茶總黃酮的含量平均加樣回收率為102.8%,RSD為6.2%,兩種方法中硝酸鋁顯色法測定誤差較大,最終選擇直接測定法測定藤茶中總黃酮的含量。

    藤茶總黃酮是藤茶中主要活性成分,采用水提法制備藤茶總黃酮,采用單因素和正交實驗得到的最佳提取工藝為料液比1∶40,提取2 h,提取2次。3次驗證性實驗表明,所制備藤茶水提物中總黃酮提取率分別為62.61%、62.40%和61.66%,說明該工藝穩(wěn)定可行。運用DPPH法對藤茶水提物及其黃酮類單體成分的自由基清除能力進行評價,結(jié)果表明,藤茶水提物對DPPH自由基清除能力強弱與黃酮含量大小呈正相關(guān)性,對DPPH自由基清除能力略高于蘆丁。藤茶中主要的4種黃酮類單體化合物均有較強的清除作用,對DPPH自由基清除能力隨著濃度的增加而增強,對DPPH自由基清除能力為楊梅素>槲皮素>二氫楊梅素>維生素C>橙皮素,其中楊梅素、二氫楊梅素和槲皮素可能是藤茶抗氧化的主要化學成分。

    藤茶作為一種保健茶,在民間飲用歷史可上溯到神農(nóng)嘗百草時期。我國最早的詩歌總集《詩經(jīng)》稱之為古茶勾藤。它不僅是一種純天然的綠色飲料,更是一種藥效保健性能很強的茶中奇葩。藤茶素有“黃酮之王”的稱號,本文通過提取工藝優(yōu)化,可以使藤茶總黃酮提取率達到60%以上,同時藤茶提取物可以迅速溶解到溶液中,服用后發(fā)揮抗氧化、抗炎的功效。藤茶提取物對DPPH自由基清除能力強弱與黃酮含量大小呈正相關(guān)性。目前已證實自由基氧化損傷與衰老及多種疾病相關(guān),當體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多或/和清除過少時都會打破人體內(nèi)自由基平衡,使多余的自由基攻擊人體內(nèi)的生物膜,造成體內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸、酶等生物大分子的氧化損傷,破壞細胞結(jié)構(gòu)和功能完整,從而影響人體正常新陳代謝、產(chǎn)生疾病[13]。因此,藤茶作為一種營養(yǎng)價值較高的藥用原料,具有很高的開發(fā)利用價值。

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