抗非小細胞肺癌藥物山奈酚納米脂質(zhì)靶向遞藥載體的處方前研究

馬玉霏　　劉金麗　　王曉雪　　侯甲福　　佟雷

[摘要] 目的 制備抗非小細胞肺癌藥物山奈酚納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，并對多種測定包封率的方法進行篩選。 方法 于2020年9月～2021年9月進行實驗，采用熔融超聲法將山奈酚制成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，通過紫外分光光度法測定藥物含量并進行方法學(xué)考察，通過測定溶解度和油水分配系數(shù)研究山奈酚的基本理化性質(zhì)，分別選用超速離心法、超濾離心法、透析法、反透析法、魚精蛋白沉淀法及葡萄糖凝膠過濾法測定包封率。 結(jié)果 山奈酚在2.2～11.0 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2=0.9994），精密度、重復(fù)性、回收率及穩(wěn)定性試驗的RSD值均小于2%。溶解度和油水分配系數(shù)的測定結(jié)果均表明山奈酚為脂溶性藥物。6種方法測得的平均包封率分別為25.77%、73.44%、57.35%、84.20%、89.61%、43.99%。 結(jié)論 反透析法和魚精蛋白沉淀法測定的結(jié)果較為高效準確，適用于山奈酚納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體包封率的測定。

[關(guān)鍵詞] 山奈酚;納米脂質(zhì)載體;包封率;抗非小細胞肺癌;靶向遞藥

[中圖分類號] R979.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）17-0031-04

Preformulation study of the kaempferol-loaded nanostructured lipid targeted drug delivery carrier， An anti-non-small cell lung cancer drug

MA Yufei1? ?LIU Jinli2? ?WANG Xiaoxue1? ?HOU Jiafu1? ?TONG Lei1

1.School of Pharmacy，Mudanjiang Medical University， Mudanjiang 157011，China;2.Department of Infection， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011， China

[Abstract] Objective To prepare the kaempferol-loaded nanostructured lipid carrier， an anti-non-small cell lung cancer drug， and to screen a variety of methods for determining the entrapment efficiency. Methods The experiment was carried out from September 2020 to September 2021. Kaempferol was made into a nanostructured lipid carrier by the ultrasonic melt method.The drug content was determined by UV spectrophotometry and the methodological validation was conducted.The basic physical and chemical properties of kaempferol were studied by measuring solubility and oil-water partition coefficient. The entrapment efficiency was determined by ultracentrifugation， ultrafiltration centrifugation， dialysis， reverse dialysis， protamine precipitation and glucose gel filtration， respectively. Results There was a good linear relationship over the concentration range of 2.2-11.0 μg/ml for kaempferol（r2=0.9994），and the RSD values of precision， repeatability， recovery and stability test were less than 2%.The measurement results of solubility and oil-water partition coefficient showed that kaempferol was a lipid-soluble drug. The average entrapment efficiencies measured by the six methods were 25.77%，73.44%，57.35%， 84.20%，89.61% and 43.99%， respectively. Conclusion The results measured by reverse dialysis and protamine precipitation are relatively efficient and accurate， and the two methods are suitable for the determination of the entrapment efficiency of the kaempferol-loaded nanostructured lipid carrier.

[Key words] Kaempferol; Nanostructured lipid carrier; Encapsulation efficiency; Anti-non-small cell lung cancer; Targeted drug delivery

肺癌患者病死率占惡性腫瘤病死率的首位[1]，而非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）在肺癌中約占80%[2]，平均生存率低于5年。山奈酚（kaemperol，KA）是一種黃酮類化合物，不僅擁有抗菌抗炎、抗氧化、降血糖等作用[3～5]，研究表明KA對于NSCLC細胞的生長具有抑制作用，但KA自身水溶性差，限制進一步應(yīng)用[6-8]。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（nanostructure lipid carrier，NLC）是第三代納米載體，能有效增加藥物的溶解度、提高藥物的穩(wěn)定性，進而促進藥物的吸收[9]。本實驗采用熔融超聲法將山奈酚制成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（KA-NLC），并對超速離心法、超濾離心法、透析法、反透析法、魚精蛋白沉淀法及葡萄糖凝膠過濾法測定包封率的結(jié)果進行比較，為該藥物制劑的處方優(yōu)化及深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

HMS-18數(shù)字型加熱磁力攪拌器（上海泰坦科技股份有限公司）;UV-1800紫外可見分光光度計（日本島津公司）;JY92-II超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）;3K15臺式高速冷凍離心機（德國希格瑪有限公司）。

1.2 材料

山奈酚（阿達瑪斯試劑有限公司）;油酸（阿達瑪斯試劑有限公司）;單硬脂酸甘油酯（阿達瑪斯試劑有限公司）;泊洛沙姆（南京威爾化工有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 KA-NLC的制備? KA和脂質(zhì)混合加熱作為油相，泊洛沙姆水溶液加熱作為水相，將水相緩慢加至油相中，攪拌得到初乳，超聲分散后冷卻得KA-NLC。油相中不加入KA，其余同上，即得空白NLC。

1.3.2? 紫外分光光度法測定藥物含量 （1）測定波長的選擇：采取鋁鹽顯色法，KA溶液在200～400 nm波長內(nèi)進行掃描，考察紫外吸收情況，空白NLC操作同上[10]。（2）標準曲線的繪制：配制終濃度為2.2、4.4、6.6、8.8、11.0 μg/ml的KA溶液，在（1）條件下進行測定。以KA濃度C為橫坐標，吸光度值A(chǔ)為縱坐標繪制標準曲線。（3）精密度試驗：配制濃度為1、4、10 μg/ml的KA溶液，1 d內(nèi)測定6次得日內(nèi)精密度;連續(xù)測定5 d得日間精密度，分別計算RSD。（4）重復(fù)性試驗：同時配制5份濃度為5 μg/ml的KA溶液進行測定，計算RSD。（5）回收率試驗：將KA溶液加至空白NLC溶液中，甲醇稀釋至KA終濃度為0.5、5、10 μg/ml進行測定，回收率（%）=實際濃度/理論濃度×100%。（6）穩(wěn)定性試驗：室溫條件下分別于0、6、12、18、24 h測定KA溶液藥物含量。（7）載藥粒子的含量測定：KA-NLC經(jīng)甲醇破乳后采用微孔濾膜（0.22 μm）進行過濾，于（1）條件下進行測定。

1.3.3 KA基本理化性質(zhì)的研究（1）溶解度測定：分別用超純水、磷酸鹽緩沖液（pH 7.4 PBS）及含0.5%、2%、5%吐溫80與磷酸鹽緩沖液混合溶液（Tween 80 -pH 7.4 PBS）溶解KA，恒溫水浴攪拌，使固體藥物始終存在于溶液中。72 h后吸取上清液，計算KA表觀溶解度。（2）油水分配系數(shù)測定：采用水飽和的正辛醇溶解KA，渦旋至KA完全溶解，恒溫條件下攪拌72 h，兩相分層后分別測定藥物含量。計算公式如下：P=CA-CB/CA（P：油水分配系數(shù);CA：水相中藥物初始濃度;CB：平衡后水相中藥物濃度）。

1.3.4 包封率的測定? 計算公式如下：包封率（%）=（1■）×100%（W1：游離藥物量;W2：總藥物量）。取適量KA-NLC通過1.3.2項下（1）方法記錄吸光度值，計算總藥物量W2。（1）超速離心法：取KA-NLC于離心管中，以15 000 r/min的速度離心2 h，取上清液測定藥物含量。（2）超濾離心法：取KA-NLC于超濾離心管內(nèi)管中，以5000 r/min的速度離心30 min，吸取外管中濾液測定藥物含量。（3）透析法：取KA-NLC于透析袋內(nèi)，PBS緩沖液作為透析介質(zhì)，以800 r/min的速度攪拌，定時取1 ml透析介質(zhì)進行含量測定，并補充同體積透析介質(zhì)，待藥物濃度穩(wěn)定計算包封率。（4）反透析法：含有乙醇溶液的透析袋放入KA-NLC中，以800 r/min的速度攪拌，定時從透析袋中取出1 ml進行含量測定，待藥物濃度穩(wěn)定計算包封率。（5）魚精蛋白沉淀法：KA-NLC中加入同體積的魚精蛋白（10 g/L），混勻后靜置5 min，加入超純水再次混勻后，以8000 r/min的速度離心30 min，取上清液測定藥物含量。（6）葡萄糖凝膠過濾法：葡萄糖凝膠G-50溶脹后注入凝膠柱，超純水洗脫3次，注入KA-NLC溶液繼續(xù)洗脫，每2毫升收集一管測定吸光度;另取KA溶液同上操作。以管數(shù)為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標繪制兩種溶液的洗脫曲線。取KA-NLC按以上方法分離并收集游離藥物，進行含量測定。

2 結(jié)果

2.1 紫外分光光度法測定藥物含量

2.1.1 測定波長的選擇? KA溶液在265 nm處有最大吸收峰，且制劑輔料在此處無吸收峰，最終檢測波長定為265 nm。

2.1.2 標準曲線的繪制? 山奈酚的線性方程為A=0.1243C-0.0096（r2=0.9994，n=6），在2.2～11.0 μg/ml的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗? 3種濃度的溶液日內(nèi)RSD和日間RSD均小于2%，表明所用儀器精密度良好。見表1。

2.1.4 重復(fù)性試驗? 重復(fù)性試驗RSD為0.72%（n=5），證明此方法重復(fù)性較好。見表2。

2.1.5 回收率試驗? 3種濃度的溶液RSD均小于2%，符合方法學(xué)要求。見表3。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗? 穩(wěn)定性RSD為1.49%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。見表4。

2.2 KA基本理化性質(zhì)的研究

2.2.1 溶解度測定? KA在超純水和PBS緩沖液中的溶解度極低，隨著Tween 80用量的增加，KA溶解度也隨之增加，說明KA為水難溶性藥物。見表5。

2.2.2 油水分配系數(shù)測定? 結(jié)果表明，KA的油水分配系數(shù)LogP為（2.16±0.09），藥典規(guī)定logP>0.5時為脂溶性藥物，由此證明KA脂溶性較強，將其制備成KA-NLC具有一定意義。見表6。

2.3 包封率的測定

2.3.1 超速離心法? 3批樣品包封率均小于30%，該方法通常需要幾萬轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速[11]，本實驗所用離心機無法達到條件，不能有效分離游離藥物，故不選用該方法測定KA-NLC包封率。見表7。

2.3.2 超濾離心法? 3批樣品RSD為6.16%，可能在超濾過程中超濾膜截留大分子溶質(zhì)增加了膜附近滲透壓，使得游離藥物的透過率減小，導(dǎo)致結(jié)果重復(fù)性較差，故不選用該方法測定KA-NLC包封率[12]。見表8。

2.3.3 透析法? 平均包封率為57.35%。由于KA在PBS中溶解性較差，易堵塞透析袋微孔導(dǎo)致游離藥物無法正常析出，使所測包封率偏低，故不適于KA-NLC包封率的測定[13]。見表9。

2.3.4 反透析法? 平均包封率為84.20%，RSD為1.08%。由于減少透析介質(zhì)的用量，避免對游離藥物的稀釋，所測結(jié)果較好，較適用于KA-NLC包封率的測定。見表10。

2.3.5 魚精蛋白沉淀法? 平均包封率為89.61%，RSD為0.81%。魚精蛋白呈正電[14]。本實驗的KA-NLC呈負電，二者形成的聚合物在離心后能完全沉淀，故該方法適于測定KA-NLC包封率。見表11。

2.3.6 葡萄糖凝膠過濾法? 平均包封率為43.99%。該方法是按分子量大小的順序進行洗脫，從而實現(xiàn)載體與藥物的分離，但較適用于分離水溶性藥物[15]。見表12。圖1的洗脫曲線也顯示，該方法不能有效分離KA-NLC與游離藥物，故不選用此方法測定包封率。

3 討論

NSCLC在肺癌中最為常見，其臨床治療和預(yù)后均較差[16]。KA具有多種藥理作用，在腫瘤方面的應(yīng)用尤為突出，但KA為脂溶性藥物，口服生物利用度較低，限制其實際應(yīng)用。NLC能夠有效提高難溶性藥物的遞送效率，脂質(zhì)的混合使用使載體能夠容納更多藥物。本研究通過熔融-超聲法成功制備了KA-NLC，改善KA水溶性差的缺陷，為進一步研究提供一定的實驗依據(jù)。

本實驗分別通過超速離心法、超濾離心法、透析法、反透析法、魚精蛋白沉淀法及葡萄糖凝膠過濾法測定所制KA-NLC的包封率。結(jié)果表明超速離心法雖操作簡單，但離心時間過長易摩擦產(chǎn)熱，需要在低溫條件下進行，因此對設(shè)備條件要求較高，且本實驗所制KA-NLC粒徑較小，該方法不能完全分離藥物與載體，導(dǎo)致測定的游離藥物含量偏高。超濾離心法便捷快速，但超濾膜對藥物的吸附作用可引起藥物濃度發(fā)生變化，導(dǎo)致所測結(jié)果重復(fù)性較差。透析法雖對儀器要求簡單，但脂溶性藥物不易溶解于透析介質(zhì)而聚集在透析袋上，導(dǎo)致所測結(jié)果偏差較大。反透析法可減少透析介質(zhì)的使用，避免破壞載體與游離藥物的動態(tài)平衡，減少藥物泄露的可能，使測定結(jié)果更為準確。魚精蛋白沉淀法通過電荷吸附與載體形成大顆粒沉淀，將藥物與載體分離的同時也不破壞載體的結(jié)構(gòu)，操作簡便且重復(fù)性好。葡萄糖凝膠過濾法無法有效分離脂溶性藥物，且分離過程中需要大量的洗脫液，可能會造成載體的滲漏，同時洗脫液的流速、上樣量及載體粒徑等均存在一定影響，導(dǎo)致所測結(jié)果重復(fù)性較差。通過比較以上結(jié)果，最終選擇反透析法和魚精蛋白沉淀法測定KA-NLC的包封率，為脂溶性藥物的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體包封率的測定提供一定的參考依據(jù)。

綜上所述，反透析法和魚精蛋白沉淀法測定的結(jié)果較為高效準確，適用于山奈酚納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的包封率的測定。

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