水質(zhì)苯胺類化合物測定方法驗證分析

宋 偉

（上海威正測試技術(shù)有限公司，上海 201612）

1 標(biāo)準(zhǔn)方法簡介與原理

水質(zhì) 苯胺類化合物的測定氣相色譜-質(zhì)譜法HJ 822—2017[1～2]方法簡介：該方法主要適用地表水、地下水、海水、生活污水和工業(yè)廢水中苯胺類化合物的測定。其中包括苯胺、2-氯苯胺、3-氯苯胺、4-氯苯胺、3，4-二氯苯胺、2，4，6-三氯苯胺、2，4，5-三氯苯胺、2-硝基苯胺、3-硝基苯胺、4-氯-2-硝基苯胺、2，6-二氯-4-硝基苯胺、2-溴-6-氯-4-硝基苯胺、2-氯-4，6-二硝基苯胺、2，6-二溴-4-硝基苯胺、2，4-二硝基苯胺、2-溴-4，6-二硝基苯胺、4-溴苯胺。當(dāng)樣品取樣量為1L，經(jīng)過濃縮后體積1.0mL 時，該方法檢出限為0.05～0.09μg/L，測定下限為0.20～0.36μg/L。

方法原理：水樣中的苯胺類化合物在pH ≥11堿性條件下用二氯甲烷進行萃取，萃取液經(jīng)過脫水、濃縮、凈化等條件后，用氣相色譜-質(zhì)譜儀測定。根據(jù)目標(biāo)化合物的保留時間和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖或特征離子進行定性，用內(nèi)標(biāo)法定量。

2 儀器設(shè)備和試劑材料

島津氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀GC-QP2010plus、色譜柱：RTX-5MS 30m×0.25mm，0.25μm 膜厚毛細管柱、氮吹儀及K-D 濃縮瓶、帶真空泵固相萃取裝置、弗羅里硅土層析柱、康氏振蕩器、微量注射器、1L 帶聚四氟乙烯塞分液漏斗、砂芯漏斗、容量瓶以及一般實驗室常用儀器和設(shè)備。

二次蒸餾水、二氯甲烷（農(nóng)殘級）、異丙醇（農(nóng)殘級）、正己烷（農(nóng)殘級）、甲醇（農(nóng)殘級）、硫代硫酸鈉、經(jīng)400 ℃烘烤4h 后氯化鈉和無水硫酸鈉、氫氧化鈉：濃度為10moL/L、硫酸溶液1∶1。苯胺類化合物標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液、替代物（苯胺-d5）標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液、內(nèi)標(biāo)（1，2-二氯苯-d4、菲-d10）貯備液、氦氣等。

3 標(biāo)準(zhǔn)方法中存在的問題

3.1 實驗中存在問題

實驗過程前期沒有很好解讀該標(biāo)準(zhǔn)，在操作實驗過程中，會出現(xiàn)一些問題，如萃取過程中分液漏斗塞子不嚴(yán)密導(dǎo)致水樣的損失；實際水樣加入氯化鈉，經(jīng)氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH ≥11，加入二氯甲烷后，經(jīng)振搖后可能會出現(xiàn)乳化現(xiàn)象。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)給的參考條件不滿足實際工作需求

通過實驗后所得到的洗脫液，按照標(biāo)準(zhǔn)所給的氣相的條件：進樣口溫度260℃；進樣方式是不分流模式；載氣氦氣；進樣量1μL；從40℃開始保持5min，以5℃/min 升溫到100℃，以10℃/min 升溫到200℃保持8min，再以30℃/min 升溫到280℃，質(zhì)譜的條件：離子源：EI 源，離子源溫度：230℃；掃描方式scan；掃描范圍m/z35～500amu；掃描時間1s/scan；接口溫度260℃；經(jīng)過儀器檢測，根據(jù)出峰時間、最低檢出限因子響應(yīng)、和出峰總時間等因素，不滿足實際工作需求。

4 針對方法存在的問題的改進

4.1 完善驗證方法流程

首先制定好驗證方法計劃，然后依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)對實驗室情況進行分析調(diào)研，看實驗室是否能達到實驗所需要求。對于調(diào)研過程中發(fā)現(xiàn)的不符合的地方及時進行改進，缺少的試劑、耗材燈及時申請購買。然后邀請有經(jīng)驗的老師進行技術(shù)方面的培訓(xùn)指導(dǎo)，碰到技術(shù)問題采用一問一答并記錄到內(nèi)部培訓(xùn)記錄及評價表。接下來進行方法的實驗驗證（包括標(biāo)準(zhǔn)曲線的驗證、方法檢出限的驗證、方法精密度的驗證、方法準(zhǔn)確度的驗證等）。最后出具一份模擬報告，并撰寫新檢測項目計劃表、新檢測項目調(diào)研報告、內(nèi)部培訓(xùn)記錄及評價表、新檢測項目驗證報告、新檢測項目評審報告、新檢測項目作業(yè)指導(dǎo)書。

4.2 解決實驗過程存在的問題

通過解讀標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)培訓(xùn)，更了解了實驗前準(zhǔn)備工作和實驗中標(biāo)準(zhǔn)的操作步驟，針對分液漏斗有漏液現(xiàn)象，解決方案：按照分液漏斗檢漏操作規(guī)范，首先關(guān)閉分液漏斗頸部旋塞，向分液漏斗內(nèi)注入適量的蒸餾水，觀察旋塞的兩端以及漏斗的下口處是否漏水，若不漏水，關(guān)閉上磨口塞，左手握住旋塞，右手食指摁住上磨口塞，倒立，檢查是否漏水，若不漏水，正立，將上磨口塞旋轉(zhuǎn)180°，倒立，若不漏水，則此分液漏斗可以使用。在萃取過程中，當(dāng)加入二氯甲烷振蕩步驟中，會出現(xiàn)乳化現(xiàn)象；解決方案：經(jīng)過大量實驗嘗試，在加入氯化鈉、不停的攪拌、把乳化液進行超聲，破乳效果不明顯；離心分離法和冷凍法效果明顯，但是冷凍法操作過程中需要冷凍時間和解凍時間，比較耗時，不太適用實際工作中；最終選用將乳化液放入離心機進行離心，條件設(shè)為：5 000r/min，時間設(shè)置3min；可根據(jù)實際水樣進行調(diào)節(jié)。

4.3 優(yōu)化儀器條件

首先按照標(biāo)準(zhǔn)參考條件進行進樣分析，通過每次進樣分析，逐步對該條件進行優(yōu)化（主要考慮出峰時間，最低檢出限目標(biāo)因子的響應(yīng)以及總運行時間）。

氣相色譜條件：

色譜柱：RTX-5MS（30m×0.25mm×0.25μm）；載氣為氦氣，氣相色譜條件：進樣口溫度260℃，進樣方式為不分流進樣，進樣量1.0μL，柱流量1.0mL/min（恒流）升溫程序從40℃開始保持5min，以5℃/min 升溫到100℃，以10℃/min 升溫到200℃保持8min，再以30℃/min 升溫到280℃，運行時間，37.67min。

質(zhì)譜儀條件：

掃描方式：全掃描；掃描范圍35～500amu；電子轟擊源EI，離子源溫度230℃；接口溫度260 ℃；溶劑延遲10min。

5 實驗數(shù)據(jù)處理與討論

5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取6個2mL 容量瓶，預(yù)先加入少量二氯甲烷，然后向其中分別準(zhǔn)確移取8μL、20μL、40μL、80μL、120μL、200μL 濃度為50μg/mL 的苯胺類化合物標(biāo)準(zhǔn)使用液（含替代物），再準(zhǔn)確移取40μL 內(nèi)標(biāo)使用液至2.0mL 容量瓶中，混勻，并用二氯甲烷定容至2.0mL，配制成苯胺類化合物和替代物質(zhì)量濃度分別為0.20μg/L、0.50μg/L、1.00μg/L、2.00μg/L、3.00μg/L、5.00μg/mL，內(nèi)標(biāo)1 物質(zhì)量濃度為1.60μg/mL，內(nèi)標(biāo)2質(zhì)量濃度為0.08μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列，貯存在棕色小瓶中，于冷暗處存放。

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，按照儀器分析條件（4.3）依次從低濃度到高濃度進行測定，以目標(biāo)化合物濃度與內(nèi)標(biāo)化合物濃度的比值為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)化合物定量離子的響應(yīng)值與內(nèi)標(biāo)化合物定量離子響應(yīng)值的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1。

從表1得出結(jié)論：19種苯胺類化合物及其替代物的線性相關(guān)系數(shù)均滿足標(biāo)準(zhǔn)要求的R≥0.995，故校準(zhǔn)曲線線性符合要求。

表1 苯胺類化合物（含替代物）的校準(zhǔn)曲線線性

5.2 檢出限

根據(jù)HJ 168—2010環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)導(dǎo)則附錄A 中A.1的方法檢出限要求，按空白實驗加標(biāo)檢測目標(biāo)物質(zhì)的方法，重復(fù)n=7次的加標(biāo)實驗，將各測定結(jié)果換算成樣品的濃度和含量，計算7次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差，按公式（1）計算方法檢出限。

式中：MDL 為方法檢出限；N為樣品平行測定次數(shù)；t為自由度為n-1，置信度為99%時的t分布（單側(cè)）；Sb為n次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

結(jié)論：通過加標(biāo)值除以方法檢出限的數(shù)值，以及HJ 168～2010環(huán)境監(jiān)測技術(shù)導(dǎo)則判定原則：對于針對多組分的分析方法，一般至少要求50%的被分析物樣品濃度在3～5倍計算出的方法檢出限的范圍內(nèi)，同時，至少90%的被分析物樣品濃度在1～10倍計算出的方法檢出限的范圍內(nèi)，其余不多于10%的被分析物樣品濃度不應(yīng)超過20倍計算出的方法檢出限，符合標(biāo)準(zhǔn)要求，（且本次驗證的各個目標(biāo)化合物的方法檢出限均符合少于或等于HJ 822-2017 標(biāo)準(zhǔn)上的對應(yīng)物質(zhì)檢出限）因此本次驗證的方法檢出限合格。

5.3 精密度

對空白樣品進行加標(biāo)，理論上樣品中苯胺類化合物為0.50、2.00、5.00μg/L，每種濃度分別平行測定6次得到的精密度結(jié)果。

結(jié)論：19種苯胺類化合物及其替代物的高、中、低樣品濃度平行測定6次相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.1%～9.7%之間，小于30%，精密度滿足要求。

5.4 準(zhǔn)確度

對空白水樣進行加標(biāo)；理論上樣品中苯胺類化合物濃度為0.50μg/L、2.00μg/L、5.00μg/L，每種濃度分別平行測定6次得到的準(zhǔn)確度結(jié)果。

對任務(wù)單號21010201，21010202，21010203 分別為地下水、地表水、廢水樣品進行加標(biāo)，理論樣品苯胺類化合物濃度為0.20μg/L、2.50μg/L、4.50μg/L，每種濃度分別平行測定6次得到的準(zhǔn)確度結(jié)果。

結(jié)論：空白水樣進行加標(biāo)，19種苯胺化合物及其替代物的高中低三種加標(biāo)水平下的的空白水樣加標(biāo)平均回收率在72.8%～95.9%，實際水樣進行加標(biāo)，19種苯胺化合物及其替代物的高中低三種加標(biāo)水平下的的實際水樣加標(biāo)平均回收率在58.7%～81.1%之間，地表水、地下水回收率均在50%～150%，廢水回收率均在40%～150%，替代物回收率均在50%～150%，滿足分析要求。

6 方法驗證結(jié)論

本實驗室在儀器設(shè)備、環(huán)境條件、人員能力、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及試劑驗收等方面均具備了水質(zhì)苯胺類化合物的測定能力；方法驗收方面，本實驗室所得精密度，準(zhǔn)確度及最低檢出限均達到HJ 822—2017 對水質(zhì)苯胺類化合物的測定要求，綜合考慮，本實驗室可以開展此項目。