中藥頭花蓼分析方法的研究概況

顧曼曼　孫媛　秦瓊

摘要：頭花蓼是少數(shù)民族地區(qū)的常用藥，具有清熱利濕、解毒止痛、活血散瘀和利尿通淋的功能。為了深入研究開發(fā)該植物，通過查閱近幾年相關(guān)文獻(xiàn)，本文對(duì)其分析方法的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞：頭花蓼;分析方法

頭花蓼（Polygonum capitatatum） 又名太陽草、石莽草、水繡球等，為蓼科植物頭花蓼的干燥全草或地上部分，是少數(shù)民族地區(qū)的常用藥。具有清熱利濕、解毒止痛、活血散瘀、利尿通淋的功效，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2003年版）。主要用于清熱解毒、利尿通淋、腎盂腎炎、尿路結(jié)石、膀胱炎、風(fēng)濕痛、跌打損傷、尿道感染、瘡瘍濕疹等癥。早在20世紀(jì)80年代就對(duì)頭花蓼開展了大量研究，對(duì)其化學(xué)成分已有較多的文獻(xiàn)報(bào)道，現(xiàn)今頭花蓼及其制劑熱淋清顆粒主要應(yīng)用于治療泌尿系統(tǒng)感染等疾病。隨著分離技術(shù)和分析技術(shù)的進(jìn)步，已有許多新的化學(xué)成分出現(xiàn)，為深入研究開發(fā)該植物，進(jìn)一步闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本文通過檢索近幾年的相關(guān)文獻(xiàn)，將頭花蓼的分析方法進(jìn)行綜述。

目前，有關(guān)頭花蓼質(zhì)量分析的研究主要包括藥材的定性鑒別，藥材中總黃酮的含量測(cè)定，藥材及其制劑中有效成分的含量測(cè)定以及活性成分在動(dòng)物模型中的代謝等。采用的分析方法包括薄層色譜法、紫外分光光度法、高效液相色譜法、核磁共振法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、薄層掃描法和毛細(xì)管電泳法等。其中，高效液相色譜法因具有分辨率高、重現(xiàn)性好、分析速度快、使用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)最為常用。

1定性鑒別

1.1 卿娟^[人對(duì)頭花蓼藥材薄層色譜指紋圖譜進(jìn)行了研究，精密吸取各樣品供試品溶液、對(duì)照品溶液各4ml，用半自動(dòng)點(diǎn)樣儀成點(diǎn)狀點(diǎn)于距聚酰胺 薄層板底邊10mm處。展開系統(tǒng)：正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸 （7：6.5：2.5：3） ?？刂剖覂?nèi)溫度20℃。預(yù)平衡15min后，上行展開8cm，取出薄層板，晾干，再用展開劑正己烷-乙酸乙酯-丁酮-甲酸（7：6.5：2.5：3）二次展開，取出晾干。檢測(cè)條件：噴以AICI試液顯色，揮盡薄層板上的殘留溶劑后置紫外光燈（320nm）下檢視熒光薄層色譜，并將掃描圖導(dǎo)入Chromafinger2005色譜指紋圖譜解決方案軟件，生成灰度掃描圖并積分，驗(yàn)對(duì)12批同一產(chǎn)地CAP種植頭花蓼和11批不同產(chǎn)地野生頭花蓼藥材進(jìn)行了薄層色譜指紋圖譜研究，通過熒光斑點(diǎn)色譜圖，可快速、直觀地與偽品進(jìn)行區(qū)分。將頭花蓼藥材的薄層色譜指紋圖譜運(yùn)用于藥材的收集采購及質(zhì)量監(jiān)控，成本低廉，便于推廣，具有良好的實(shí)用價(jià)值及參考意義。

2 化學(xué)成分的制備、分析鑒定

2.1 周雯等應(yīng)用超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)苗藥頭花蓼醇提物與水提物的化學(xué)成分進(jìn)行分析與鑒定。采用Waters ACQUITY UPLC BEH C 色譜柱（2.1mm×100mm，1.7m）; 以0.10%甲酸水溶液（A）-0.10%甲酸乙腈溶液（B）為流動(dòng)相梯度洗脫;流速為0.35mL/min;ESI-Ms檢測(cè)采用負(fù)離子模式。根據(jù)精確相對(duì)分子質(zhì)量，結(jié)合數(shù)據(jù)庫匹配進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果顯示醇提物及水提物皆以黃酮類、多酚類及木脂素類成分為主，但醇提物與水提物化學(xué)成分具有明顯差異，具體為：醇提物中的可水解類鞣質(zhì)成分明顯減少，鞣花酸的缺失，花青素類化合物的新增等。該研究為闡明頭花蓼醇提物與水提物中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了重要依據(jù)。而且可以為基于“有效組分”的中藥新藥研制提供基礎(chǔ)。

2.2 方煒等應(yīng)用高速逆流色譜法對(duì)頭花蓼水提噴霧干燥粉末的乙酸乙酯粗提物的化學(xué)成分進(jìn)行了半制備性分離研究，通過對(duì)分離方法和溶劑系統(tǒng)的篩選，尋找到最佳的溶劑系統(tǒng)（正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水=1：5：1：5），上相為固定相，轉(zhuǎn)速840r/min，流速2.0mL/min，進(jìn)樣量756mg，檢測(cè)波長(zhǎng)272nm。結(jié)果顯示，在該條件下經(jīng)一步分離可同時(shí)得到質(zhì)量為148.5mg和9.2mg的兩種產(chǎn)物，純度為99.8%和97.4%，經(jīng)紫外、紅外、質(zhì)譜及核磁共振等方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，確定分別為沒食子酸和原兒茶酸。

2.3 張麗娟等：應(yīng)用硅膠、sephadex LH-20、MCI、RP-18及半制備HPLC等各種色譜技術(shù)對(duì)頭花蓼富含黃酮活性組分進(jìn)行分離純化，根據(jù)化合物的理化常數(shù)和波譜數(shù)據(jù)鑒定其結(jié)構(gòu);廖高尚等通過各種柱色譜技術(shù)對(duì)頭花蓼進(jìn)行分離純化，根據(jù)理化性質(zhì)、色譜性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)進(jìn)行頭花蓼酚酸類化學(xué)成分研究。葉全知等采用硅膠柱層析、反相ODS柱色譜、SephadexLH20等分離手段對(duì)頭花蓼降糖活性部位進(jìn)行分離純化，通過波譜數(shù)據(jù)分析進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。從頭花蓼中共分離出7個(gè)木脂素類成分，分別鑒定為：（+）-異落葉松脂醇（1）、（-）-南燭木樹脂酚-2a-O-[6-O-（4-羥基-3，5-二甲氧基）-苯甲?；鵠-β-D-葡萄糖苷（2）、（-）-異落葉松脂素-2a-O-β-D-木吡喃糖苷（3）、（+）-5’-甲氧基異落葉松脂素9-O-β-D-木吡喃糖苷（4）、（-）-異落葉松脂素-3a-O-β-D-葡萄糖苷（5）、nudiposide（6）、lyoniside（7）。

3 有效成分的含量測(cè)定

3.1李雨生等HPLC法同時(shí)測(cè)定頭花蓼中槲皮素與山奈酚的含量，采用Alltima C18柱（5um，4.6mm×250mm），流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸（50：50），流速0.8mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360nm。結(jié)果：槲皮素在0.0216ug～0.389ug濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.9998。平均回收率為97.37%，RSD為1.88%;山奈酚在0.0051ug～0.0918ug濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.9993，平均回收率為97.09%，RSD為1.19%。

3.2 劉躍等建立頭花蓼藥材中沒食子酸、原兒茶酸、陸地棉苷、槲皮苷、兒茶素、槲皮素3-O-（2”-沒食子?；?鼠李糖苷及槲皮素的UPLC-MRM-MS檢測(cè)方法。色譜采用WatersBEHC（2.1mm×50mm，1.7um）色譜柱，以0.1%甲酸乙腈0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，質(zhì)譜采用多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）檢測(cè)。沒食子酸、原兒茶酸、陸地棉苷、槲皮苷、兒茶素、槲皮素3-O-（2”-沒食子?；?鼠李糖苷及槲皮索分別在0.136-32.965、0.031-7.481、0.022-5.300、0.076-18.433、0.085-20.737、0.017-4.147、0.128-31.029ug/mL濃度范圍線性關(guān)系良好，平均回收率為91.23%～105.33%，RSD<3%，精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。此方法操作簡(jiǎn)便，快速，靈敏度高，可用于頭花蓼藥材中主要活性成分的含量測(cè)定，并為頭花蓼藥材質(zhì)量控制提供了新方法。

3.3 曹芳等采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定頭花蓼凍干粉中槲皮素、槲皮苷的含量，色譜柱條件：AgilentODSC18（250.0mm×4.6mm，5um）;迪馬 DiamonsilODSC18（250.0mm×4.6mm，5um），流動(dòng)相為0.3%醋酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫，0～5min，92%～90%A;5～20min，90%～75%A;2O～40min，75%～50%A，40～41min，50%～92%A，41～50min，92%A。檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，進(jìn)樣量10ul，流速1.0ml/min，柱溫30℃。理論板數(shù)以槲皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000，槲皮素在0. 209～0.1570ug內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=1.0000，平均回收率為101.49%，RSD為1.93%，槲皮苷在0. 368～2.760ug內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=0.9999，101.49%，平均回收率為98.87%，RSD為2.46%，該方法測(cè)定頭花蓼凍干粉中槲皮素、槲皮苷的含量，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性、穩(wěn)定性較好。

3.4王愛民等2011年用80%甲醇超聲10min，制備供試品，并建立HPLC法測(cè)定了10批次四季草顆粒中頭花蓼藥材的槲皮苷含量，結(jié)果槲皮苷含量在0.9～I(xiàn). 3 （mg/g）之間。劉程程等2012年比較了6種黔產(chǎn)中草藥（黃柏、射干、頭花蓼、板藍(lán)根、龍膽草、梔子）中總黃酮、多酚、多糖在水和乙醇提取液中的含量。結(jié)果顯示：頭花蓼水提取液黃酮含量高于乙醇提取液，故提取頭花蓼中的黃酮時(shí)宜用水作提取溶劑。

4 代謝方面

4.1 遲明艷等通過UPLCQ-TOF/MS鑒別大鼠口服頭花蓼提取物后尿液中的原型成分及代謝產(chǎn)物，以探索其體內(nèi)代謝過程及直接作用物質(zhì)。流動(dòng)相0.1%甲酸水溶液（A）0. 1%甲酸乙腈溶液（B）梯度洗脫（0～10min，95%～55%A;10～14min，55%～5%A;14～15min，5%～0%A;15～16min，0%～95%A），柱溫45℃，流速0.3mL/min，進(jìn)樣量2uL以電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)，掃描范圍m/z50～1000，在負(fù)離子模式下掃描，通過比較空白尿液、給藥尿液和兩者的差異圖譜確認(rèn)灌胃后大鼠尿液中原型成分及其代謝產(chǎn)物。利用TOF/MS得到的準(zhǔn)確相對(duì)分子質(zhì)量，對(duì)尿液中頭花蓼原型成分及代謝物進(jìn)行鑒別。結(jié)果：鑒別出尿液中3個(gè)原型成分及15個(gè)代謝產(chǎn)物，推測(cè)頭花蓼直接作用物質(zhì)可能為原兒茶酸、槲皮素和沒食子酸，或其經(jīng)肝臟代謝的產(chǎn)物。該方法可靠、有效，可用于口服頭花蓼提取物后尿液中化學(xué)成分鑒別，為該藥材后續(xù)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。

4.2 孫慧園等采用UHPLC-Q-TOF/M S聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合MetaboliteTools?、質(zhì)量虧損過濾（MDF）等代謝產(chǎn)物分析技術(shù)，對(duì)各成分暴露模式斑馬魚24h后的藥液以及模式斑馬魚體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行篩查分析。結(jié)果沒食子酸、原兒茶酸經(jīng)斑馬魚作用后，主要以甲基化、硫酸化反應(yīng)為主。在斑馬魚體內(nèi)外藥液檢測(cè)到?jīng)]食子酸原形成分和2個(gè)甲基硫酸化產(chǎn)物，以及原兒茶酸原形成分、2個(gè)甲基硫酸化產(chǎn)物、2個(gè)硫酸化產(chǎn)物。頭花寥有效組分中沒食子酸、原兒茶酸經(jīng)斑馬魚代謝后存在II相代謝產(chǎn)物，這與大鼠體內(nèi)的代謝機(jī)制高度一致，提示斑馬魚對(duì)頭花寥有效組分的代謝具有合理性，為闡明該藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

結(jié)語

頭花蓼作為民族道地藥材，從20世紀(jì)80年代就已開始研究，成方制劑有熱淋清顆粒和熱淋清膠囊，主要應(yīng)用于尿頻、尿急、尿痛、腎盂腎炎等癥。主要有效成分有黃酮、酚酸（沒食子酸為主要有效成分），近幾年有文獻(xiàn)報(bào)道木脂素類成分在降糖方面有療效;現(xiàn)在HPLC-MS/TOF、HMR、HSCCC等儀器的應(yīng)用也越來越成熟，在頭花蓼化學(xué)成分的制備、分離、鑒定、含量測(cè)定以及提取物在動(dòng)物模型中代謝的研究應(yīng)用廣泛，為更充分的研究開發(fā)該植物提供了有效支持。

參考文獻(xiàn)：

[1] WANG S，ZHANG LY，XIE Y，et a1.Determination of gallic acid in Polygonum capitatum and relinqing granules by HPLC [J].Chin J Exp Tradit Med From（中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志），2012，18（9）：112-115.

[2] 卿娟，張麗艷，潘文婷，等.頭花蓼藥材薄層色譜指紋圖譜研究[J].微量元素與健康研究，2014，31（2）：62-63.

[3] 周雯，張麗艷，謝立敏，等.超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用分析苗藥頭花蓼醇提物及水提物化學(xué)成分[J].中國中藥雜志，2017，42（18）：3557—3563.

[4] 方煒，萬金志，張艷麗，等.高速逆流色譜法同時(shí)分離制備頭花蓼中沒食子酸和原兒茶酸[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2011，23：299-303.

[5] 張麗娟，王永林，王珍，等.頭花蓼活性組分化學(xué)成分研究[J].中藥材，2012，35（9）：1425-1428.

[6] 廖高尚，陳曉君，蘭燕宇，等.頭花蓼酚酸類化學(xué)成分研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21（8）：1946-1947.

[7] 葉全知，黃光輝，黃豆豆，等頭花蓼中木脂素類降糖活性成分的研究[J].中藥材，2017，40（2）：107-110.

[8] 李雨生，王祥培，萬德光，等. HPLC法同時(shí)測(cè)定頭花蓼中槲皮素與山奈酚的含量[J].中藥與臨床，2011，3：24-26.

[9] 劉躍，胡杰，謝玉敏，等. UPLC—MRM—MS法測(cè)定頭花蓼藥材中7個(gè)指標(biāo)成分[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2015，27：73-76.88.

[10] 曹芳，段萍，王洪平，等.高效液相色譜法測(cè)定頭花蓼凍干粉中槲皮素和槲皮苷的含量[J].重慶醫(yī)學(xué)，2017，46（14）：1972-1973.

[11] 王愛民，鄢艷，譚安菊，等.四季草顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究[J].貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，36（5）：455—459

[12] 劉程程，韋萬麗，廖莉玲，等.6種黔產(chǎn)清熱類中草藥主要抗氧化成分的含量[J]貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40 （2）：41—43.

[13] 遲明艷，向文英，楊武，等. UPLC—Q—TOF/MS分析頭花蓼提取物在大鼠尿液中的代謝產(chǎn)物[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑雜志，2016，22（17）：77-80.

[14] 孫慧園，覃小麗，梅朝葉，等.頭花蓼有效組分中沒食子酸、原兒茶酸在模式生物斑馬魚中的代謝研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2017，，33（3）：388-393.