預(yù)反應(yīng)態(tài)模型淺析：催化活性和近過(guò)渡態(tài)分子模擬

SIM Byuri，趙一雷

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240）

在合成生物學(xué)三大基本要素中，生物元件模塊化和標(biāo)準(zhǔn)化涉及催化元件改造與設(shè)計(jì)［1］。例如，在重構(gòu)特定代謝途徑時(shí)經(jīng)常調(diào)用或兼并多個(gè)跨物種天然催化元件基因；盡管長(zhǎng)期自然進(jìn)化使得天然酶在原生環(huán)境下具有高效和穩(wěn)定等特點(diǎn)，卻不易滿足工程化生產(chǎn)的特殊需要［2］。為了解決該問(wèn)題，弗朗西斯·阿諾德教授發(fā)明了定向進(jìn)化策略，在比較短的時(shí)間內(nèi)通過(guò)多輪優(yōu)選，在天然酶的基礎(chǔ)上構(gòu)建出大量高活性突變體的文庫(kù)，再?gòu)钠渲泻Y選出優(yōu)勢(shì)突變［3］。然而，實(shí)際應(yīng)用中序列空間全突變搜索還是受到突變實(shí)驗(yàn)技術(shù)中密碼子簡(jiǎn)并性和堿基突變偏好性等諸多問(wèn)題的限制［4］。

為了提高蛋白質(zhì)工程改造效率，需要結(jié)合蛋白質(zhì)理性設(shè)計(jì)方法縮小有效突變實(shí)驗(yàn)測(cè)試范圍［5］。目前蛋白質(zhì)折疊原理在物理和數(shù)學(xué)上已經(jīng)全部被闡明，超級(jí)計(jì)算機(jī)可以對(duì)生物大分子的微觀動(dòng)態(tài)行為開(kāi)展高精度分子模擬，不但可以利用經(jīng)典牛頓力學(xué)對(duì)中小規(guī)模的蛋白質(zhì)和核酸分子力學(xué)展開(kāi)毫秒甚至秒級(jí)的全原子長(zhǎng)軌跡模擬，也可以利用量子力學(xué)對(duì)催化元件反應(yīng)中心進(jìn)行飛秒至皮秒級(jí)基于電子波函數(shù)的理論計(jì)算［6-7］。量子力學(xué)（QM）和分子力場(chǎng)（MM）模擬方法學(xué)的普及，及GPU計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展［8］，計(jì)算體系尺度逐步擴(kuò)大，從傳統(tǒng)的有機(jī)小分子到復(fù)雜金屬絡(luò)合物，一直到數(shù)千到數(shù)萬(wàn)原子級(jí)別的生物大分子體系，讓我們可以對(duì)復(fù)雜生物體系的催化分子機(jī)理進(jìn)行全面深入的計(jì)算模擬和系統(tǒng)分析，給出與實(shí)驗(yàn)精度媲美甚至實(shí)驗(yàn)上難以觀察到的微觀機(jī)制和反應(yīng)勢(shì)能面［9］。

當(dāng)今超進(jìn)化理性設(shè)計(jì)的瓶頸在于有限的計(jì)算資源、有限的研究時(shí)間與酶催化反應(yīng)復(fù)雜勢(shì)能面全原子水平飛秒精度上的接近無(wú)窮無(wú)盡計(jì)算需求之間的矛盾［10-11］。如何利用定向進(jìn)化的高效突變體文庫(kù)和高精度催化分子機(jī)制來(lái)推進(jìn)蛋白質(zhì)工程效率，成為該領(lǐng)域亟待解決的科學(xué)問(wèn)題［12］?！邦A(yù)反應(yīng)態(tài)”模型是基于對(duì)酶分子催化機(jī)制的深度挖掘，利用簡(jiǎn)捷的分子動(dòng)力學(xué)模擬計(jì)算來(lái)闡明催化反應(yīng)中心與遠(yuǎn)端氨基酸殘基的相互作用［13］，快速確定突變效應(yīng)和底物適配性，從而進(jìn)行相應(yīng)的催化元件定向設(shè)計(jì)、改造和優(yōu)化，體現(xiàn)了合成生物學(xué)催化元件的快速優(yōu)化改進(jìn)的工程化理念［2］。

1 預(yù)反應(yīng)態(tài)模型的理論基礎(chǔ)

隨著愈來(lái)愈多的酶分子催化機(jī)制從僅僅包括活性中心的小模型，乃至在生物分子全原子、電子水平上得以闡明，酶學(xué)家們對(duì)“酶”生物催化元件為什么能夠加速生化反應(yīng)的理解也越來(lái)越深入［14］。20 世紀(jì)著名的理論化學(xué)家萊納斯·卡爾·鮑林教授降低表觀活化能的初步概念［15］和酶學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析中常用的米氏方程不斷被改進(jìn)［16-17］。現(xiàn)在人們已經(jīng)能夠在微觀水平上基本理解了酶分子與底物和輔基等小分子形成米氏復(fù)合物［18］，該復(fù)合物經(jīng)過(guò)一系列構(gòu)象轉(zhuǎn)化降低了化學(xué)鍵斷裂和形成所需的反應(yīng)活化能［19］。如同有機(jī)化學(xué)合成，酶-底物復(fù)合物在催化反應(yīng)歷程中有眾多的中間體和過(guò)渡態(tài)，酶的專一性和特異性來(lái)自這些不同能量狀態(tài)復(fù)合物的統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)平衡［20-21］。因此突變體、底物多樣性、底物濃度變化、環(huán)境溫度、鹽度、離子強(qiáng)度、酸堿度都會(huì)改變反應(yīng)歷程上各種中間體復(fù)合物的相對(duì)能量和布居數(shù)［22-23］。從而，即使一個(gè)在原生細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)進(jìn)化非常好的天然酶在實(shí)際生物合成中可能會(huì)由于底物、產(chǎn)物、抑制劑、激活劑濃度與原先進(jìn)化環(huán)境不同而改變了催化反應(yīng)勢(shì)能面，從一個(gè)低活化能反應(yīng)勢(shì)能面轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋罨艿膭?shì)能面［24］。

如何通過(guò)氨基酸殘基突變優(yōu)化在新底物和新環(huán)境下高活化能反應(yīng)勢(shì)能面的生物合成酶？實(shí)驗(yàn)科學(xué)家通過(guò)多輪定向進(jìn)化對(duì)氨基酸序列進(jìn)行隨機(jī)性的優(yōu)化和改進(jìn)，而理論科學(xué)家則提出了諸多酶催化模型用于生物合成酶和工業(yè)酶的理性設(shè)計(jì)和優(yōu)化［25-26］。通過(guò)對(duì)反應(yīng)勢(shì)能面上反應(yīng)物、產(chǎn)物、過(guò)渡態(tài)、中間體等駐點(diǎn)（能量極值點(diǎn)）的計(jì)算來(lái)透徹刻畫(huà)酶催化反應(yīng)機(jī)理，理論學(xué)家基本認(rèn)同了酶具有將反應(yīng)的總活化能（或表觀活化能）降低到15～18 kcal/mol的能力，等價(jià)于50%概率發(fā)生反應(yīng)的時(shí)間縮短到毫秒至秒的范圍［27-28］。然而，理論計(jì)算學(xué)術(shù)界對(duì)蛋白質(zhì)分子如何降低總反應(yīng)活化能的機(jī)制理解上存在許多不同的看法，總結(jié)起來(lái)有如下幾種：

（1）Houk 教授等［29-30］認(rèn)為，類似有機(jī)化學(xué)催化反應(yīng)，酶催化能力主要來(lái)自蛋白質(zhì)的特殊氨基酸殘基穩(wěn)定了催化過(guò)程中的關(guān)鍵過(guò)渡態(tài)。具體來(lái)說(shuō)，一個(gè)生化反應(yīng)有非常多的可能途徑，特定蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)具有降低關(guān)鍵過(guò)渡態(tài)的作用，可以通過(guò)計(jì)算底物與周邊關(guān)鍵氨基酸殘基復(fù)合體Theozyme 模型來(lái)理解，然后基于所獲得的過(guò)渡態(tài)與周邊殘基復(fù)合物的幾何結(jié)構(gòu)利用從內(nèi)向外（inside-out）策略等構(gòu)建蛋白質(zhì)框架，來(lái)開(kāi)發(fā)和優(yōu)化新酶［31］。

（2）Warshel教授［32］提出在蛋白質(zhì)的反應(yīng)勢(shì)能面與孤立體系計(jì)算在可比性方面存在難以克服的問(wèn)題，大部分情況下酶催化反應(yīng)并沒(méi)有使化學(xué)鍵形成或斷裂（化學(xué)步）的能量發(fā)生太大改變，而是通過(guò)與底物、中間體、過(guò)渡態(tài)、產(chǎn)物等系列小分子預(yù)組織成一個(gè)較穩(wěn)定的復(fù)合物（非化學(xué)步）抵消了整個(gè)非酶反應(yīng)歷程中熵?fù)p失問(wèn)題，從而降低了總活化能。

類似的催化理論還有Ground-state destabilization（基態(tài)活化）［33］和Transition state stabilization（過(guò)渡態(tài)穩(wěn)定）［34］、Near attack conformation（近進(jìn)攻構(gòu)象）［35］、 Allosteric control （變 構(gòu) 控 制）［36］、Dynamical effects （動(dòng)態(tài)效應(yīng)）［37］等等從不同角度對(duì)催化元件加速生化反應(yīng)的理論闡述。

近年我們基于紅霉素生物合成酶系中硫酯酶的底物釋放競(jìng)爭(zhēng)催化機(jī)制展開(kāi)了較深入的理論研究，提出了在反應(yīng)勢(shì)能面上選擇合適的“預(yù)反應(yīng)態(tài)”模型可以有效地預(yù)測(cè)水解和環(huán)化途徑選擇，規(guī)避了生物大分子反應(yīng)過(guò)渡態(tài)超高自由度復(fù)雜計(jì)算的瓶頸問(wèn)題。如圖1所示，我們可以從反應(yīng)體系的時(shí)間尺度上理解預(yù)反應(yīng)態(tài)選擇在酶催化反應(yīng)歷程中的重要性：

圖1 酶催化歷程所涉及的運(yùn)動(dòng)時(shí)間尺度，包括了高活化能過(guò)程及多種微觀運(yùn)動(dòng)Fig.1 Timescale in catalytic reactions,including the high-activation energy process and various motions

①酶通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)合能特異性捕捉周邊環(huán)境中的底物分子，與底物分子（及輔因子）一起形成了一個(gè)反應(yīng)物系綜“米氏復(fù)合物”。這一過(guò)程與藥物分子與靶標(biāo)蛋白的結(jié)合過(guò)程類似［38-39］，時(shí)間尺度在毫秒級(jí)以上，結(jié)合和解離的自由能勢(shì)壘主要來(lái)自熵變，即從分子間隨機(jī)相互碰撞中有效地進(jìn)入到合適的反應(yīng)區(qū)域。如果酶反應(yīng)中心接近蛋白表面，結(jié)合勢(shì)壘需要克服的能量比較低，與殘基突變關(guān)系小，然而對(duì)于反應(yīng)中心被包埋在蛋白內(nèi)核的酶而且酶蛋白剛性較大時(shí)，門控作用較為明顯，需要合適的突變來(lái)解除底物和酶的有效結(jié)合［40-41］。通常底物結(jié)合能的大小對(duì)應(yīng)于底物濃度的高低，在原生細(xì)胞環(huán)境內(nèi)，底物濃度相對(duì)較低，催化元件進(jìn)化出高結(jié)合能狀態(tài)有效地從周邊環(huán)境中汲取底物分子。在酶活測(cè)定實(shí)驗(yàn)中米氏常數(shù)Km、解離常數(shù)Kd等接近原生環(huán)境中底物濃度［42］。底物與酶的結(jié)合并進(jìn)入活性中心是酶催化反應(yīng)的前提。

②該反應(yīng)復(fù)合物系綜在特定溫度、特定酸堿環(huán)境等物理化學(xué)條件下發(fā)生熱漲落運(yùn)動(dòng)，其中一些近過(guò)渡態(tài)的結(jié)構(gòu)在某個(gè)瞬間大約數(shù)百飛秒時(shí)間內(nèi)完成了目標(biāo)化學(xué)鍵的斷裂和形成（即所謂的化學(xué)步）［43-45］。在化學(xué)基元步的過(guò)程與其他化學(xué)反應(yīng)遵循同樣的物理規(guī)律，目標(biāo)化學(xué)鍵的斷裂和形成與分子內(nèi)鍵振動(dòng)的時(shí)間尺度相近，Eyring反應(yīng)動(dòng)力學(xué)速率方程的指前因子大約是50 fs，也代表了無(wú)反應(yīng)勢(shì)壘的反應(yīng)發(fā)生最高速率。

③在關(guān)鍵化學(xué)步反應(yīng)發(fā)生前，根據(jù)蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)時(shí)間尺度（圖1）［13］，反應(yīng)復(fù)合物體系將處于一個(gè)穩(wěn)定時(shí)間達(dá)納秒以上的“預(yù)反應(yīng)態(tài)”。因該狀態(tài)尚不涉及后續(xù)的化學(xué)鍵斷裂或形成，其穩(wěn)定性可以利用經(jīng)典分子動(dòng)力學(xué)模擬計(jì)算來(lái)評(píng)估。根據(jù)從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推算的催化元件表觀活化能，可以估計(jì)出化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生概率50%的反應(yīng)時(shí)間大概處于毫秒到秒的時(shí)間范圍［46］。

由此可見(jiàn)，可以通過(guò)對(duì)離關(guān)鍵過(guò)渡態(tài)最近的預(yù)反應(yīng)態(tài)在無(wú)約束分子動(dòng)力學(xué)模擬軌跡中的穩(wěn)定性來(lái)評(píng)估催化元件突變體的酶活及底物適配性。通過(guò)分析定向進(jìn)化突變體預(yù)反應(yīng)態(tài)的相對(duì)穩(wěn)定性變化，結(jié)合生物信息學(xué)的序列和結(jié)構(gòu)比對(duì)，可以從原子分子水平上闡明所觀察到的突變效應(yīng)。

2 近進(jìn)攻構(gòu)象

預(yù)反應(yīng)態(tài)模型的前身為酶學(xué)研究中常用的近進(jìn)攻構(gòu)象分析（圖2）。托馬斯·布魯斯等［47］在20世紀(jì)末觀察到小分子體系中前線軌道布局和范德華相互作用對(duì)反應(yīng)活性有顯著的影響，提出了近進(jìn)攻構(gòu) 象 的 概 念（near attack conformation， NAC）——在活性構(gòu)象中，將要形成新化學(xué)鍵兩個(gè)原子之間的接觸距離小于它們范德華半徑之和，并且與過(guò)渡態(tài)狀態(tài)有相近的鍵角。該方法把反應(yīng)發(fā)生前、在最低能量構(gòu)象kBT量級(jí)以內(nèi)的所有可及構(gòu)象（kB為玻爾茲曼常數(shù)）分為活性構(gòu)象和非活性構(gòu)象，而NAC 布居數(shù)則是活性構(gòu)象在總構(gòu)象空間的占比數(shù)。原子立體空間和經(jīng)典作用會(huì)發(fā)生很大的變化，因此NAC 的布居數(shù)需要考慮影響復(fù)合物體系自由能的空間位阻效應(yīng)、靜電相互作用和零點(diǎn)能校正。鑒于當(dāng)時(shí)計(jì)算機(jī)算力的限制，前期NAC 概念的發(fā)展過(guò)程中大多利用半經(jīng)驗(yàn)方法隨機(jī)搜索小分子體系數(shù)萬(wàn)個(gè)能量最小化的構(gòu)象，例如在分子內(nèi)酸催化酯降解體系，對(duì)構(gòu)象集合中羧酸負(fù)離子與被進(jìn)攻的酯羧基是否接近分子內(nèi)酐形成的范德華接觸距離進(jìn)行幾何結(jié)構(gòu)分析從而確定近進(jìn)攻態(tài)的概率。小分子體系的活性構(gòu)象布居數(shù)對(duì)數(shù)值與反應(yīng)速率對(duì)數(shù)值呈線性相關(guān)，而且這些活性構(gòu)象的相對(duì)能量越低則反應(yīng)活化能亦越小，但小分子體系里活性構(gòu)象熵與反應(yīng)活性不呈現(xiàn)相關(guān)性。

圖2 催化元件突變導(dǎo)致反應(yīng)勢(shì)能面微擾的示意圖［在酶催化單步反應(yīng)米氏模型中，預(yù)反應(yīng)態(tài)與近進(jìn)攻構(gòu)象定義相同，米氏復(fù)合物熱運(yùn)動(dòng)中接近反應(yīng)過(guò)渡態(tài)（近進(jìn)攻構(gòu)象）活性構(gòu)象的布居數(shù)p與催化活性正相關(guān)］Fig.2 Diagram for the perturbation of energy profile caused by the mutation of catalytic elements(In the simplest Michaelis's model,pre-reaction state and near attack conformation are identical,using the correlation of active conformation population and enzyme proficiency.)

NAC 概念進(jìn)而被推廣到酶學(xué)研究中，從底物-酶的所有米氏復(fù)合物的構(gòu)象中根據(jù)結(jié)構(gòu)與過(guò)渡態(tài)的相似性來(lái)推斷那些有利于反應(yīng)發(fā)生的構(gòu)象（reacting complex）。其中一個(gè)著名的NAC 例子是分支酸歧化酶的突變體活性分析［48］，在水溶液中NAC 的布居數(shù)不到百萬(wàn)分之一，在酶和底物的米氏復(fù)合物中NAC的布居數(shù)可達(dá)30%，從而可以推算出NAC結(jié)合自由能在酶中提升了近7.8 kcal/mol，這個(gè)提升幅度接近于實(shí)驗(yàn)中所觀察到的酶催化和非酶反應(yīng)的表觀活化能差（9 kcal/mol）。由于分子內(nèi)張力，在分支酸異構(gòu)化的計(jì)算中所選用的NAC 活性構(gòu)象判定條件非常寬松，兩個(gè)即將成鍵的碳碳原子之間距離小于0.37 nm，兩個(gè)相對(duì)進(jìn)攻角的正負(fù)偏差為sp2碳的法線方向20°范圍。對(duì)于不同的突變體，環(huán)狀過(guò)渡態(tài)的自由能勢(shì)能面圖計(jì)算顯示高效突變體的NAC構(gòu)象相對(duì)能量低，穩(wěn)定性高。

布魯斯的分支酸歧化酶計(jì)算成功驗(yàn)證了活性中心周邊氨基酸殘基與底物分子的靜電和范德華相互作用可以顯著提高NAC 活性構(gòu)象的布居數(shù)——其原因是在催化過(guò)程中米氏復(fù)合物給反應(yīng)勢(shì)能面帶來(lái)了結(jié)合熵陷阱，有效限制了底物的構(gòu)象空間中非活性構(gòu)象布居數(shù)，從而在反應(yīng)勢(shì)能面上轉(zhuǎn)化為催化驅(qū)動(dòng)力。由于酶催化反應(yīng)的活化能通常低至10～15 kcal/mol，非常接近室溫?zé)徇\(yùn)動(dòng)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的能量范圍，從能量的角度上過(guò)渡態(tài)與近進(jìn)攻態(tài)存在某種熱平衡［49］。然而，突變體自由能勢(shì)能面計(jì)算需要大量的超級(jí)計(jì)算機(jī)計(jì)算資源，在蛋白質(zhì)工程中對(duì)各個(gè)突變體開(kāi)展自由能勢(shì)能面的計(jì)算在實(shí)際應(yīng)用中可望不可及，因此直接通過(guò)活性構(gòu)象布居數(shù)來(lái)判斷活性成為了NAC 研究的主流。在兒茶酚甲基轉(zhuǎn)移酶的NAC 分析中，進(jìn)攻原子碳氧之間距離定義為0.32 nm 以下，SAM 的硫碳鍵與碳氧夾角定義為大于165°進(jìn)攻角，活性構(gòu)象布居數(shù)大約為7.6%［50］。在Hhal 甲基轉(zhuǎn)移酶的計(jì)算中，米氏復(fù)合物模擬軌跡中底物胞嘧啶與催化關(guān)鍵殘基CYS18、輔酶SAM 之間的相對(duì)構(gòu)象被用于判斷酶活，包括了Cys17硫原子與底物胞嘧啶C6 之間的距離、SAM 甲基與底物胞嘧啶C5 之間的距離以及底物DNA 胞嘧啶堿基的N-糖苷鍵二面角作為3 個(gè)NAC 結(jié)構(gòu)參數(shù)。由于高角度N-糖苷鍵二面角可以縮短進(jìn)攻原子之間的距離，因此大于80°的構(gòu)象被認(rèn)為具有活性［51］。在甲酸脫氫酶中，NAC 定義為甲酸底物的轉(zhuǎn)移氫原子與NAD 受體C4N原子之間的距離小于0.30 nm，甲酸的碳?xì)滏I與進(jìn)攻原子對(duì)夾角（進(jìn)攻角）在132°～180°，米氏復(fù)合物模擬中活性構(gòu)象的布居數(shù)大約1.5%［52］。二氫葉酸還原酶的活性構(gòu)象結(jié)構(gòu)參數(shù)則定義為NADPH輔酶中被轉(zhuǎn)移的負(fù)氫原子與底物DHF 的距離和夾角，在米氏復(fù)合物分子動(dòng)力學(xué)模擬中兩種不同手性（pro-R和pro-S）的活性構(gòu)象都具有較短的距離（<0.30 nm），其中pro-R的活性構(gòu)象布居數(shù)為43%，而pro-S的為7%，計(jì)算結(jié)果與實(shí)驗(yàn)觀察到的手性選擇性相吻合［53］。1，4-β-木糖酶的活性構(gòu)象被用于判斷廣義酸堿催化二聯(lián)體Glu96 和Glu177 在催化反應(yīng)中的角色［54］。馬肝醇脫氫酶中NAC 也被定義為氫負(fù)原子與底物的相對(duì)位置，即氫碳距離小于0.30 nm、進(jìn)攻角大約132°，反應(yīng)物、產(chǎn)物和中間體3 個(gè)體系對(duì)比中，發(fā)現(xiàn)pro-R質(zhì)子化中間體的NAC布居數(shù)最高（約60%）［55］。在腈水解酶的近進(jìn)攻構(gòu)象分析中，Cys25 的硫原子與底物氰基碳原子之間的距離小于0.35 nm、進(jìn)攻角設(shè)定為90°±15°，發(fā)現(xiàn)His159 的咪唑基對(duì)廣義酸堿催化的活性構(gòu)象有很大的作用［56］。在可溶性環(huán)氧水解酶中，近進(jìn)攻構(gòu)象定義為Asp的羧基氧原子與環(huán)氧碳原子的距離小于0.32 nm，環(huán)氧的碳氧鍵與進(jìn)攻羧基氧原子的夾角在145°±15°范圍，NAC 分析中優(yōu)勢(shì)活性構(gòu)象與酶催化反應(yīng)中環(huán)氧的兩個(gè)碳原子化學(xué)選擇性相吻合［57］。在嗜熱吲哚3-甘油磷酯合成酶中，NAC 活性構(gòu)象定義為碳碳距離0.35 nm、進(jìn)攻角為120°±20°，米氏復(fù)合物在低溫和高溫有不同的活性構(gòu)象布居數(shù)，其嗜熱性通過(guò)調(diào)節(jié)活性構(gòu)象的比例而實(shí)現(xiàn)［58］。

近進(jìn)攻態(tài)概念的提出為認(rèn)識(shí)酶微觀催化機(jī)制提供了一個(gè)非?？尚械难芯抗ぞ撸?9-60］。Mulholland研究小組［61］從MD 模擬的16 個(gè)快照結(jié)構(gòu)開(kāi)始計(jì)算分支酸歧化酶催化反應(yīng)路徑，發(fā)現(xiàn)活性構(gòu)象對(duì)降低活化自由能的貢獻(xiàn)與酶對(duì)過(guò)渡態(tài)穩(wěn)定化作用基本相近。而布魯斯等［62］則把大約10%的催化作用歸因于過(guò)渡狀態(tài)穩(wěn)定?？梢?jiàn)，酶不但提升米氏復(fù)合物構(gòu)象中的活性構(gòu)象比例，而且進(jìn)一步通過(guò)穩(wěn)定過(guò)渡態(tài)來(lái)降低反應(yīng)活化能。NAC 效應(yīng)可以認(rèn)為在反應(yīng)開(kāi)始階段的穩(wěn)定性一直保留在過(guò)渡態(tài)，例如分支酸歧化酶的靜電相互作用，不但穩(wěn)定了NAC 活性構(gòu)象也穩(wěn)定了過(guò)渡態(tài)。當(dāng)然，酶催化機(jī)制還包括了動(dòng)力學(xué)等其他因素［63］。

在21 世紀(jì)初，分子動(dòng)力學(xué)模擬中近進(jìn)攻構(gòu)象和近過(guò)渡態(tài)的活性構(gòu)象快照（snapshots）常作為QM/MM 過(guò)渡態(tài)計(jì)算的出發(fā)結(jié)構(gòu)［64-66］，隨著計(jì)算機(jī)硬件的發(fā)展，更多的研究聚焦在酶催化反應(yīng)勢(shì)能面的構(gòu)建與驗(yàn)證、新酶催化機(jī)制的挖掘，而對(duì)這種利用底物分子對(duì)接和半自動(dòng)化分子動(dòng)力學(xué)模擬可以很快地收集到的“酶活”打分函數(shù)和底物適配譜的經(jīng)驗(yàn)性方法不甚重視［67-69］。NAC 近進(jìn)攻構(gòu)象的計(jì)算都是通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間分子動(dòng)力學(xué)模擬來(lái)自底物分子直接對(duì)接的米氏復(fù)合物，從MD軌跡中統(tǒng)計(jì)符合玻爾茲曼分布的活性結(jié)構(gòu)布居數(shù)，一旦米氏復(fù)合物中存在一個(gè)比較穩(wěn)定的休止?fàn)顟B(tài)（resting state），或者底物-酶復(fù)合物的可及構(gòu)象空間過(guò)于復(fù)雜（如生物合成中常見(jiàn)二元底物的催化體系），導(dǎo)致決速步遠(yuǎn)離米氏復(fù)合物的初始結(jié)構(gòu)，從底物分子米氏復(fù)合物開(kāi)始的長(zhǎng)時(shí)間分子動(dòng)力學(xué)模擬軌跡并不能高效地獲得具有統(tǒng)計(jì)意義的活性結(jié)構(gòu)布居數(shù)。

3 多步催化循環(huán)中能量模型

很久以來(lái)，計(jì)算化學(xué)家和實(shí)驗(yàn)者之間缺乏一個(gè)有效的話語(yǔ)系統(tǒng)，計(jì)算化學(xué)家聚焦在單步基元反應(yīng)的能量勢(shì)能面的變化，而生物學(xué)家則側(cè)重表型如生物量、代謝流量、基因調(diào)控等。在蛋白質(zhì)工程中則對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用了米氏方程最簡(jiǎn)單化描述方法，基于單步反應(yīng)模型的米氏常數(shù)Km、最高初始反應(yīng)速率vmax和催化效率kcat/Km來(lái)優(yōu)化酶的催化效率。這也是導(dǎo)致近進(jìn)攻構(gòu)象分析所遇到的常見(jiàn)問(wèn)題，即許多工業(yè)酶或生物醫(yī)用酶反應(yīng)并非單步基元反應(yīng)，或者蛋白質(zhì)工程酶分子優(yōu)化設(shè)計(jì)的目標(biāo)并非單底物的消耗速率而是不同產(chǎn)物途徑的選擇性問(wèn)題，特別是對(duì)于多步反應(yīng)過(guò)程中的中下游反應(yīng)途徑選擇性問(wèn)題，在底物和酶的米氏復(fù)合物分子模擬中并不能觀察到差別。如果把活性構(gòu)象分析從酶-底物的米氏復(fù)合物拓展到全反應(yīng)勢(shì)能面，則需要從復(fù)雜的催化循環(huán)中確定優(yōu)先檢測(cè)點(diǎn)。

近10 年來(lái)，Kozuch 從相對(duì)簡(jiǎn)單的金屬有機(jī)催化循環(huán)為研究對(duì)象闡明了多基元、多底物、多進(jìn)程的催化循環(huán)的能量跨度模型，以蛋白質(zhì)工程量度整體催化循環(huán)效率的周轉(zhuǎn)頻率TOF 為目標(biāo)函數(shù)［70］，而非單基元反應(yīng)速率［71］，從催化循環(huán)的全系統(tǒng)考慮各個(gè)參變量變化對(duì)蛋白質(zhì)催化效率的影響（圖3）［72］。能量跨度模型沿用原有的表觀反應(yīng)活化能的概念，假設(shè)反應(yīng)速率是由活性構(gòu)象的濃度和Arrhenius 反應(yīng)活化能決定，而活性構(gòu)象的濃度或布居數(shù)是由其相對(duì)能量和穩(wěn)態(tài)濃度按照玻爾茲曼分布所確定。由此可推斷表觀活化能的能量跨度是反應(yīng)活化能和預(yù)反應(yīng)態(tài)的相對(duì)能量之和，即δE為催化循環(huán)中的能量最高點(diǎn)和能量最低點(diǎn)來(lái)確定［73］。

圖3 催化循環(huán)周轉(zhuǎn)效率TOF與催化反應(yīng)勢(shì)能面的關(guān)系［在酶催化多步催化循環(huán)中，預(yù)反應(yīng)態(tài)定義為關(guān)鍵決速步過(guò)渡態(tài)相關(guān)的活性構(gòu)象的布居數(shù)p，它的變化與催化元件優(yōu)化目標(biāo)直接相關(guān)（如突變效應(yīng)或底物適配）］Fig.3 Correlation of the turn-over frequency(TOF)and reaction potential energy surface(In multiple steps of a catalytic cycle,pre-reaction state is defined as the active conformation near rate-determining transition state,in which rate is dependent on the protein engineering target such as mutation effect and substrate diversity.)

然而，能量跨度模型在總反應(yīng)能接近0的平衡中適用，如果催化循環(huán)的反應(yīng)能遠(yuǎn)小于0，而一次循環(huán)的完成意味者能量的下降，新一輪的反應(yīng)循環(huán)的能量參考點(diǎn)隨即低于原有的能量零點(diǎn)，由此必須建立全循環(huán)周期的能量點(diǎn)與催化循環(huán)周轉(zhuǎn)速率的關(guān)系。Kozuch 與合作者利用Eyring 方程重構(gòu)了基元反應(yīng)速率k空間和勢(shì)能面表示方法［74］，提出了整合催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)與量子力學(xué)的催化循環(huán)模型，揭示了催化循環(huán)的周轉(zhuǎn)效率TOF 與反應(yīng)能量校正后的能量跨度模型的關(guān)系，指出TOF 的精確表達(dá)式與催化循環(huán)勢(shì)能面中過(guò)渡態(tài)和中間體的能量點(diǎn)貢獻(xiàn)度，提出最高能量過(guò)渡態(tài)點(diǎn)和最高濃度中間體點(diǎn)和反應(yīng)能來(lái)快速預(yù)測(cè)催化效率［75］。作者說(shuō)明了催化效率TOF 的控度來(lái)自對(duì)反應(yīng)速率貢獻(xiàn)最大的狀態(tài)［76］，從而指示我們?cè)诹孔恿W(xué)計(jì)算反應(yīng)勢(shì)能時(shí)要重點(diǎn)考慮的觀測(cè)點(diǎn)以及如何改善和調(diào)整關(guān)鍵基元反應(yīng)步［77-78］。從優(yōu)化TOF 的角度來(lái)講，控制度接近1 的中間體和過(guò)渡態(tài)是決速中間體（TDI）和決速過(guò)渡態(tài)（TDTS）［79］。在生物體中如果一個(gè)催化元件進(jìn)化得非常完善，一般而言反應(yīng)物和產(chǎn)物之間的能量差接近于0，而且各個(gè)基元反應(yīng)步的勢(shì)壘接近，從能量的角度來(lái)講達(dá)到了最優(yōu)化的反應(yīng)途徑，導(dǎo)致了在該反應(yīng)途徑上每一個(gè)過(guò)渡態(tài)和中間體對(duì)催化轉(zhuǎn)化效率都相近。反之，如果一個(gè)酶尚未進(jìn)化完全，可能有若干個(gè)基元反應(yīng)對(duì)催化循環(huán)的控制度超過(guò)了其他基元反應(yīng)，從而使得決速中間體或過(guò)渡態(tài)的個(gè)數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于進(jìn)化完全的催化元件（圖4）。在蛋白質(zhì)工程的酶進(jìn)化中，更多是屬于后者，當(dāng)調(diào)用一個(gè)其他物種的異源基因時(shí)，大部分情況下反應(yīng)途徑選擇在催化元件的自然進(jìn)化中已經(jīng)完成了，定向進(jìn)化是在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的反應(yīng)勢(shì)能面內(nèi)優(yōu)化催化效率或?qū)χ邢掠蔚姆磻?yīng)途徑進(jìn)行選擇［80-82］，或者是由于反應(yīng)條件發(fā)生了變化，例如生物工程酶的反應(yīng)物和產(chǎn)物的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于自然進(jìn)化催化元件時(shí)原始濃度導(dǎo)致反應(yīng)勢(shì)能面發(fā)生了相應(yīng)的變化［83］。

圖4 催化元件分子進(jìn)化前后的反應(yīng)勢(shì)能面［進(jìn)化完成前通常存在階段性的最大控制點(diǎn)（左圖），而進(jìn)化后反應(yīng)勢(shì)能面各過(guò)渡態(tài)的控制度相近（右圖）］Fig.4 Imaginary reaction potential energy surface for molecular evolution(Before evolving to a"perfect"enzyme,one point on the reaction potential energy surface controls the overall rate,but many other points are equivalently important for the perfect enzyme.)

上述催化元件的勢(shì)能面表述方案統(tǒng)一了20 世紀(jì)關(guān)于酶催化效率的基態(tài)活化、過(guò)渡態(tài)穩(wěn)定、近進(jìn)攻構(gòu)象、動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)、過(guò)渡態(tài)穩(wěn)定等不同角度對(duì)酶催化機(jī)理的認(rèn)識(shí)，把催化反應(yīng)推動(dòng)力和催化流與電子電路中的電勢(shì)和電流概念相對(duì)應(yīng)，提出了決速過(guò)渡態(tài)（TDTS）和決速中間體（TDI）協(xié)同決定催化效率，認(rèn)為單個(gè)基元反應(yīng)或轉(zhuǎn)化狀態(tài)并不具備決定催化效率的所有動(dòng)力學(xué)信息。一個(gè)非常重要的推論是，TDTS 和TDI 不一定是能量最高和能量最低的狀態(tài)，也不一定是某單個(gè)基元反應(yīng)的相鄰狀態(tài)；其次，催化循環(huán)的效率并非單一決速狀態(tài)，不同的目標(biāo)函數(shù)對(duì)應(yīng)著不同的決速參變量，在催化模型中引入了圖論、相關(guān)性、反應(yīng)速率控制度、魯棒性和火山圖等信息學(xué)的概念［84］。

因此，從米氏復(fù)合物的近進(jìn)攻構(gòu)象布居數(shù)和催化循環(huán)能量跨度模型可以延伸出可工程計(jì)算的預(yù)反應(yīng)態(tài)（PRS），定義為與催化效率相關(guān)的TDI和TDTS 的預(yù)組織復(fù)合物幾何結(jié)構(gòu)。首先，PRS 必須是催化循環(huán)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)目標(biāo)函數(shù)的控制度最高的狀態(tài)，它可以是米氏復(fù)合物的近進(jìn)攻構(gòu)象，也可能是決定多條不同產(chǎn)物的反應(yīng)途徑分岔口流量的狀態(tài)［85-86］。預(yù)反應(yīng)態(tài)不拘泥于米氏復(fù)合物基態(tài)、決速過(guò)渡態(tài)本身，也不拘泥于物理意義上是否必須是某種分子狀態(tài)或者是某種分子狀態(tài)中的“高活性”構(gòu)象，或者甚至是多元底物的預(yù)組織狀態(tài)，甚至是底物進(jìn)入活性口袋的非化學(xué)步或是產(chǎn)物離開(kāi)催化元件的非化學(xué)步。在分子動(dòng)力學(xué)模擬中，如果該狀態(tài)是與TDTS 或TDI 相鄰的情況下就可以直接從活性構(gòu)象的角度開(kāi)始模擬測(cè)試其穩(wěn)定性，如果該狀態(tài)與米氏復(fù)合物相鄰的情況下就使用傳統(tǒng)底物分子對(duì)接結(jié)構(gòu)開(kāi)始模擬測(cè)試其可及性，如果產(chǎn)物和反應(yīng)物的能量差接近于0，也可以適用產(chǎn)物分子對(duì)接結(jié)構(gòu)模擬關(guān)鍵過(guò)渡態(tài)的預(yù)反應(yīng)態(tài)，或者是反應(yīng)途徑的分岔口來(lái)模擬催化元件對(duì)下游不同反應(yīng)途徑的選擇。更多的應(yīng)用場(chǎng)景下是利用一個(gè)能量不甚準(zhǔn)確的計(jì)算勢(shì)能面，根據(jù)催化元件的進(jìn)化路徑分析從中選擇適合計(jì)算的預(yù)反應(yīng)狀態(tài)，通過(guò)人工智能機(jī)器學(xué)習(xí)的方法核對(duì)該預(yù)反應(yīng)態(tài)對(duì)應(yīng)的控制度是否符合實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4 預(yù)反應(yīng)態(tài)模型的應(yīng)用

預(yù)反應(yīng)態(tài)分析的基本流程為：首先，基于高階量子力學(xué)計(jì)算提取催化中心關(guān)鍵過(guò)渡態(tài)的結(jié)構(gòu)特征；其次，從高精度蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)出發(fā)，結(jié)合氨基酸質(zhì)子化預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)工具推導(dǎo)出穩(wěn)定存在的近進(jìn)攻活性構(gòu)象；最后，利用過(guò)渡態(tài)結(jié)構(gòu)信息設(shè)定分子動(dòng)力學(xué)模擬約束條件，通過(guò)逐步取消約束條件測(cè)試預(yù)反應(yīng)態(tài)隨氨基酸突變和底物變化的穩(wěn)定性變化，以近進(jìn)攻構(gòu)象在預(yù)反應(yīng)態(tài)軌跡中布居數(shù)作為“預(yù)反應(yīng)態(tài)-酶活”半定量相關(guān)系數(shù)，從預(yù)反應(yīng)態(tài)穩(wěn)定性中挖掘酶與底物的適配圖譜。

4.1 聚酮合酶系統(tǒng)中硫酯酶的水解與成環(huán)

聚酮合酶（PKS）是模塊化多酶復(fù)合物的一個(gè)大家族［87］，在藥物生物合成過(guò)程中生成各種各樣的環(huán)肽產(chǎn)物，包括大環(huán)內(nèi)酯抗生素、抗真菌劑、免疫抑制劑、抗癌藥物等［88］。其中紅霉素DEBS合酶是Ⅰ型PKS 模塊化合成的一個(gè)代表系統(tǒng)，由啟動(dòng)模塊、多個(gè)延伸模塊和硫酯酶組成［89-92］。硫酯酶模塊化生物合成系統(tǒng)里負(fù)責(zé)終產(chǎn)物大環(huán)內(nèi)酯的關(guān)環(huán)和釋放［86］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)底物中遠(yuǎn)離酯鍵的C7 位酮基改為羥基時(shí)，硫酯酶催化反應(yīng)從大環(huán)內(nèi)酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)樗夥磻?yīng)，由于關(guān)環(huán)和水解兩條反應(yīng)途徑共享同一底物上載后的共價(jià)中間體，因此該中間體的預(yù)反應(yīng)態(tài)傾向是決定水解和環(huán)化兩條反應(yīng)選擇性的決速中間體TDI［93-94］。分子動(dòng)力學(xué)模擬表明酮基和羥基兩種底物與酶的共價(jià)中間體在經(jīng)過(guò)10 ns模擬后都達(dá)到了平衡，在20 ns后兩個(gè)體系的分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示了硫酯酶lid 區(qū)呈現(xiàn)開(kāi)合交替構(gòu)象，在100 ns軌跡中則觀察到了完全不同的構(gòu)象演化，選擇環(huán)化反應(yīng)途徑的底物酶共價(jià)中間體結(jié)構(gòu)傾向“開(kāi)”的狀態(tài)，活性口袋內(nèi)部體積變大，而選擇水解反應(yīng)途徑的底物酶共價(jià)中間體慢慢傾向“閉合”構(gòu)象。更為有意思的是，該硫酯酶天然底物形成的共價(jià)中間體則強(qiáng)烈地趨向環(huán)化反應(yīng)活性結(jié)構(gòu)。表明硫酯酶lid 區(qū)域通過(guò)誘導(dǎo)擬合互作來(lái)識(shí)別不同的底物，通過(guò)不斷地“開(kāi)”/“閉”構(gòu)象循環(huán)調(diào)整水解/環(huán)化預(yù)反應(yīng)態(tài)選擇性。值得注意的是，在500 ns軌跡中，開(kāi)閉運(yùn)動(dòng)與預(yù)反應(yīng)狀態(tài)的形成和解散并不同步，蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致共價(jià)結(jié)合的底物疏水尾端在口袋中翻轉(zhuǎn)并形成環(huán)化預(yù)反應(yīng)態(tài)。在環(huán)化預(yù)反應(yīng)態(tài)中，其底物疏水尾端C11位的羥基與His259殘基之間的氫鍵對(duì)形成環(huán)化預(yù)反應(yīng)態(tài)發(fā)揮了引導(dǎo)作用，而Leu183、Leu186 和Leu190 非極性殘基則形成起模板作業(yè)的疏水口袋，共同克服了酶內(nèi)部共價(jià)結(jié)合底物疏水鏈尾端的大環(huán)構(gòu)象變化帶來(lái)的構(gòu)象熵?fù)p失。預(yù)反應(yīng)態(tài)計(jì)算也預(yù)測(cè)到Leu183、Leu186 和Val170 的丙氨酸突變可以改變酶催化環(huán)化和水解的傾向；其次，非極性氨基酸Phe260 與Ile79 突變?yōu)闃O性氨基酸則阻礙環(huán)化反應(yīng)［95］。

硫酯酶對(duì)于6～8、12、14、16 元大環(huán)內(nèi)酯的環(huán)合能力是藥物生物合成的研究熱點(diǎn)，為了進(jìn)一步確認(rèn)預(yù)反應(yīng)態(tài)在硫酯酶選擇催化水解或環(huán)化途徑的重要性，我們比較了苦霉素硫酯酶催化環(huán)化12 元環(huán)（10-deoxymethynolide，甲霉素前體）和14 元環(huán)（narbonolide，苦霉素前體）中底物與硫酯酶共價(jià)中間體的動(dòng)態(tài)行為［96］。與DEBS 硫酯酶相近，苦霉素硫酯酶也包含了活性口袋疏水界面、開(kāi)放的底物通道和絲氨酸-組氨酸-天冬氨酸催化三聯(lián)體，催化三聯(lián)體位于通道的中心位置，底物與Ser148 形成共價(jià)中間體。對(duì)底物小分子體系開(kāi)展構(gòu)象搜索，從低能量構(gòu)象中直接選取與催化口袋匹配的活性構(gòu)象移植入酶中，以共價(jià)對(duì)接的方式構(gòu)建了預(yù)反應(yīng)態(tài)分子動(dòng)力學(xué)模擬的出發(fā)結(jié)構(gòu)，利用高斯軟件構(gòu)建絲氨酸-底物共價(jià)衍生結(jié)構(gòu)RESP 電荷力場(chǎng)。利用短軌跡多次模擬的方法篩選出酶-底物共價(jià)中間體復(fù)合物的近進(jìn)攻活性構(gòu)象，然后對(duì)體系展開(kāi)長(zhǎng)軌跡模擬觀察預(yù)反應(yīng)態(tài)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。在各6 次50 ns 的短軌跡模擬中，有3 條12 元環(huán)和2 條14 元環(huán)軌跡中出現(xiàn)了較穩(wěn)定His259-Asp169 氫鍵網(wǎng)絡(luò)的環(huán)化反應(yīng)活性構(gòu)象。如果定義預(yù)反應(yīng)態(tài)中氫鍵重原子距離小于0.30 nm、尾端羥基氧與絲氨酸連接的羧基碳原子之間的接觸距離小于0.45 nm，則12 元環(huán)和14 元環(huán)體系在300 ns 軌跡中的His259 活性氫鍵總布居數(shù)分別為24.3%和14.2%，而12 元環(huán)碳氧短距離的活性構(gòu)象比14 元環(huán)高出10.3%。盡管預(yù)反應(yīng)態(tài)判定閾值因人為定義而幾何結(jié)構(gòu)參數(shù)具體數(shù)值的物理意義不甚清晰，從上述預(yù)反應(yīng)態(tài)短軌跡模擬中可以觀察到12 元環(huán)體系明顯具有更多的環(huán)化反應(yīng)活性構(gòu)象，因此可以推導(dǎo)出12 元環(huán)的預(yù)反應(yīng)態(tài)比14 元環(huán)占比更高、結(jié)構(gòu)上更穩(wěn)定。如果從這些短軌跡中選擇最穩(wěn)定的預(yù)反應(yīng)態(tài)結(jié)構(gòu)出發(fā)進(jìn)一步把模擬時(shí)間推長(zhǎng)到300 ns，12 元環(huán)和14 元環(huán)體系的氫鍵布居數(shù)分別為46.0%和27.5%，而短距離碳氧活性構(gòu)象布居數(shù)分別為24.3%和14.2%，總布居數(shù)為11.2%和5.7%。從模擬軌跡中可以看到，除了類似紅霉素硫酯酶預(yù)反應(yīng)態(tài)分子模擬中組氨酸氫鍵引導(dǎo)作用之外，C9 位羧基與Thr77 側(cè)鏈存在氫鍵也穩(wěn)定預(yù)反應(yīng)態(tài)結(jié)構(gòu)，苦霉素硫酯酶在12 元環(huán)體系中疏水作用增加了Ala78 和Gly150殘基。研究發(fā)現(xiàn)苦霉素硫酯酶的Tyr178 識(shí)別14 元環(huán)底物的作用不同于紅霉素硫酯酶，前者為疏水相互作用，而后者中突變?yōu)槭杷奖彼釟埢鶗r(shí)失去催化活性。另一方面，預(yù)反應(yīng)態(tài)的分子動(dòng)力學(xué)模擬也展示了硫酯酶活性口袋的柔性，POVME口袋體積計(jì)算表明結(jié)合12 元環(huán)底物時(shí)口袋體積為0.335 nm3而14 元環(huán)底物時(shí)為0.355 nm3。QM/MM計(jì)算表明了后續(xù)的碳四面體結(jié)構(gòu)形成和消除在反應(yīng)勢(shì)能面上14 元環(huán)的活化能皆高于12 元環(huán)。鑒于后續(xù)C－O 斷裂和形成兩步基元反應(yīng)發(fā)生時(shí)除反應(yīng)位點(diǎn)之外底物-酶復(fù)合物的拓?fù)鋷缀谓Y(jié)構(gòu)變化很小，故可認(rèn)為環(huán)化預(yù)反應(yīng)態(tài)是由底物共價(jià)連接中間體決定。

變構(gòu)霉素生物合成酶系硫酯酶則傾向于水解途徑，產(chǎn)生線性產(chǎn)物分子，但如果在生物合成模塊中調(diào)用苦霉素硫酯酶模塊則生成了痕量14 元環(huán)合產(chǎn)物［97］。底物-酶共價(jià)中間體50 ns 短軌跡預(yù)反應(yīng)態(tài)模擬結(jié)果表明，變構(gòu)霉素硫酯酶體系中可以形成相當(dāng)數(shù)量的組氨酸氫鍵（32.7%），與苦霉素硫酯酶結(jié)合變構(gòu)霉素底物的體系中氫鍵布居數(shù)相近（33.5%）；然而，變構(gòu)霉素硫酯酶體系中短碳氧距離的活性構(gòu)象相對(duì)較少（11.0%）而苦霉素硫酯酶體系中短碳氧距離的活性構(gòu)象較高（22.7%），總布居數(shù)（9.3%）也低于苦霉素硫酯酶體系（13.6%）。如果采用相同的預(yù)反應(yīng)態(tài)計(jì)算策略，300 ns長(zhǎng)軌跡分析卻給出相反的結(jié)果，變構(gòu)霉素的環(huán)化預(yù)反應(yīng)態(tài)更加穩(wěn)定（保持高活性構(gòu)象布居數(shù)，15.6%），而苦霉素的環(huán)化預(yù)反應(yīng)態(tài)卻持續(xù)穩(wěn)定時(shí)間短（活性構(gòu)象布居數(shù)減低到9.8%）。從環(huán)化預(yù)反應(yīng)態(tài)動(dòng)態(tài)形成過(guò)程來(lái)看，變構(gòu)霉素的活性口袋中疏水和親水性環(huán)境與苦霉素有較大差異，Try161形成了多重氫鍵提高了活性構(gòu)象的穩(wěn)定性。Y161F、Y161F&N179P、Y161A 的虛擬突變可有效改變短軌跡中環(huán)化預(yù)反應(yīng)態(tài)的活性構(gòu)象布居數(shù)（0.3%、12.0%和21.0%），說(shuō)明了Tyr161 是決定環(huán)化預(yù)反應(yīng)態(tài)布居數(shù)的關(guān)鍵殘基。另外，變構(gòu)霉素活性口袋中的水分子數(shù)目較大也導(dǎo)致了組氨酸殘基活化水分子的水解活性構(gòu)象大量增加，C1-Owater平均距離變短（變構(gòu)霉素0.295 nm，苦霉素0.322 nm）、組氨酸與水分子之間氫鍵增強(qiáng)（變構(gòu)霉素0.266 nm，苦霉素0.279 nm），水解預(yù)反應(yīng)態(tài)活性構(gòu)象布居數(shù)（23.1%）明顯高于苦霉素體系（19.2%）。變構(gòu)霉素體系研究表明，如果短軌跡與長(zhǎng)軌跡的預(yù)反應(yīng)態(tài)活性構(gòu)象布居數(shù)出現(xiàn)反轉(zhuǎn)現(xiàn)象，催化反應(yīng)途徑的競(jìng)爭(zhēng)因素比較復(fù)雜，從傳統(tǒng)分子對(duì)接方法推算預(yù)反應(yīng)態(tài)與酶活可能會(huì)有比較大的偏差，需要進(jìn)一步計(jì)算QM/MM反應(yīng)勢(shì)壘來(lái)確定多種反應(yīng)途徑之間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系［98］。

4.2 醇脫氫酶

藥物生物合成中，不可避免會(huì)涉及高空間位阻的手性醇中間體合成，而煙酰胺腺苷二核苷酸依賴酶醇脫氫酶催化還原羧基化合物路徑有非常重要的地位［99］。然而，天然來(lái)源的醇脫氫酶底物譜受限、立體選擇性低、活性低，而且手性還原時(shí)受Prelog規(guī)則限制只能獲得其中一種手性醇而不能獲得其對(duì)映體［100］。雖然可通過(guò)定向進(jìn)化方法等蛋白質(zhì)工程技術(shù)提高其催化活性，受限于手性產(chǎn)物高通量篩選方法，目前半理性設(shè)計(jì)方法在立體選擇性酶改造中有重要的價(jià)值。

克魯維多孢酵母的醇脫氫酶可催化轉(zhuǎn)化CPMK 手性合成藥物中間體，我們對(duì)KpADH 酶立體選擇性反轉(zhuǎn)的兩個(gè)高效突變體開(kāi)展了預(yù)反應(yīng)態(tài)分子動(dòng)力學(xué)研究，以闡明決定立體選擇性的因素［101］。該酶是一種典型短鏈脫氫酶，由NADPH提供氫負(fù)離子，而催化中心Tyr164 提供質(zhì)子中和負(fù)氫原子進(jìn)攻羧基而衍生出氧負(fù)離子洞。在催化口袋中Ser126 結(jié)合底物，Lys168 與Tyr164 形成穩(wěn)定氫鍵網(wǎng)絡(luò)極化酪氨酸酚羥基的質(zhì)子而降低其pKa。早期的研究發(fā)現(xiàn)，非受約束的分子動(dòng)力學(xué)模擬中底物無(wú)法保持在活性位點(diǎn)而擴(kuò)散到溶劑中，通常在25 ns 內(nèi)底物分子就離開(kāi)反應(yīng)中心，而酶的開(kāi)合轉(zhuǎn)換周期大約為20 ns［102］。因此，如果從傳統(tǒng)的分子對(duì)接米氏復(fù)合物出發(fā)，長(zhǎng)時(shí)間的分子模擬并不能有效獲得預(yù)反應(yīng)態(tài)布居數(shù)。為了提高計(jì)算效率，利用已知過(guò)渡態(tài)結(jié)構(gòu)出發(fā)對(duì)預(yù)反應(yīng)態(tài)進(jìn)行多次重復(fù)短軌跡分子模擬，發(fā)現(xiàn)兩種不同手性的預(yù)反應(yīng)態(tài)結(jié)構(gòu)布局在兩個(gè)高效突變體中呈現(xiàn)完全不同的穩(wěn)定性。Mu-R2 突變體的pro-R手性預(yù)反應(yīng)態(tài)中，負(fù)氫原子和質(zhì)子在非受約束的分子動(dòng)力學(xué)模擬中可以穩(wěn)定存在1 ns，而在pro-S手性預(yù)反應(yīng)態(tài)中雖然負(fù)氫原子可以保持在范德華接觸距離以內(nèi)，但不能同時(shí)保持提供質(zhì)子的Try164 氫鍵網(wǎng)絡(luò)。而Mu-S5 突變體的pro-S手性預(yù)反應(yīng)態(tài)中負(fù)氫原子和質(zhì)子在非受約束分子動(dòng)力學(xué)模擬中可以穩(wěn)定存在1 ns 左右，在pro-R手性預(yù)反應(yīng)態(tài)中雖然質(zhì)子可以保持在氫鍵距離內(nèi)，但負(fù)氫原子卻遠(yuǎn)離羧基碳原子0.4 nm 以上。如果以氫鍵距離0.34 nm 和負(fù)氫原子距離0.45 nm 劃分活性和非活性構(gòu)象，Mu-R2的pro-R預(yù)反應(yīng)態(tài)活性構(gòu)象布居數(shù)（4.56%）是Mu-S5（0.52%）的8 倍左右，而Mu-S5 的pro-S預(yù)反應(yīng)態(tài)活性構(gòu)象布居數(shù)（7.64%） 是Mu-R2（1.84%）的4 倍以上。在Mu-R2 突變體中，可以看到Ala128、Phe161、Tyr127 和Phe197 與底物有很強(qiáng)的π-π 相互作用和疏水相互作用，而在Mu-S5中卻沒(méi)有，說(shuō)明與硫酯酶類似，疏水作用在誘導(dǎo)契合活性構(gòu)象中有非常重要的角色。另外，在氫鍵和負(fù)氫原子的距離分布圖上，可以觀察到布居數(shù)非常高的非活性構(gòu)象，說(shuō)明活性構(gòu)象在分子動(dòng)力學(xué)熱平衡運(yùn)動(dòng)中并不占優(yōu)勢(shì)。類似變構(gòu)霉素硫酯酶的環(huán)化預(yù)反應(yīng)態(tài)形成機(jī)制，在短鏈醇脫氫酶的相對(duì)較小的活性口袋中二芳基酮底物的立體選擇性反轉(zhuǎn)也可能與預(yù)反應(yīng)態(tài)的形成過(guò)程相關(guān)——與野生型對(duì)比，Mu-S5 的4 個(gè)突變位點(diǎn)N136、V161、C237 和G214 位于平行四邊形的4 個(gè)角上，底物進(jìn)入催化口袋時(shí)需要穿過(guò)這個(gè)“極門”而促使pro-S預(yù)反應(yīng)態(tài)的形成，而底物上的氯取代剛好賦予極化苯環(huán)而吻合靜電相互作用和π-π 相互作用。

在活性口袋空間相對(duì)較大的中鏈醇脫氫酶CpRCR 中，基于晶體結(jié)構(gòu)的點(diǎn)突變分子模擬發(fā)現(xiàn)W286A 和F285A 可以擴(kuò)大活性口袋的空間從而可以容納更大的底物，而W116A 突變反而使得活性口袋空間塌縮導(dǎo)致顯著的蛋白質(zhì)構(gòu)象重組。CpRCR 與4 個(gè)特定突變體具有高互補(bǔ)性，使得這些突變體可用于合成具有不同立體選擇性的多種手性醇化合物。在CpRCR 中，由于羧基的兩側(cè)取代基中有一側(cè)為小取代基，因此不同于二芳基酮底物，它可以在活性口袋內(nèi)部翻轉(zhuǎn)底物而改變預(yù)反應(yīng)態(tài)的手性，立體選擇性更多取決于兩種不同手性預(yù)反應(yīng)態(tài)的結(jié)合穩(wěn)定性而非其形成過(guò)程［103］。

4.3 甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A

除了處于進(jìn)化中的生物合成酶及需要人工超進(jìn)化的工業(yè)酶之外，我們嘗試了解預(yù)反應(yīng)態(tài)在進(jìn)化相對(duì)完善的催化元件中的地位。DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNMT3A）是表觀遺傳甲基化的關(guān)鍵酶［104］，在急性骨髓性白血病（AML）患者中高發(fā)R882H 突變［105］，因此以正常型和致病型為研究對(duì)象可以了解進(jìn)化后酶因殘基突變干擾產(chǎn)生的預(yù)反應(yīng)態(tài)結(jié)構(gòu)變化［106］。首先，利用經(jīng)典或加速分子動(dòng)力學(xué)模擬產(chǎn)生甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)步的活性構(gòu)象，以SAM輔因子中的硫原子與甲基碳原子之間的距離、甲基碳與靶標(biāo)堿基C5 原子的距離搜尋在室溫?zé)徇\(yùn)動(dòng)可及的甲基轉(zhuǎn)移活性構(gòu)象，QM/MM 理論計(jì)算表明雖然突變可以同時(shí)穩(wěn)定預(yù)反應(yīng)態(tài)和過(guò)渡態(tài)，但反應(yīng)勢(shì)壘反而從正常型的14.9 kcal/mol升高到15.6 kcal/mol。對(duì)反應(yīng)勢(shì)壘的畸變-互作-勢(shì)壘-張力（DIAS）能量分解分析表明，R882H 突變系統(tǒng)地降低了外圍蛋白骨架能量（PRS 5 kcal/mol；TS 14.7 kcal/mol）。然而在反應(yīng)中心部分，該突變一方面進(jìn)一步提高TDI 的穩(wěn)定性（4.9 kcal/mol），另一方面卻減弱了TDTS 的穩(wěn)定性（5.5 kcal/mol）。DNMT3A 酶的預(yù)反應(yīng)態(tài)分析表明，對(duì)于進(jìn)化比較完善的催化元件，反應(yīng)勢(shì)能面上的決速過(guò)渡態(tài)和中間體個(gè)數(shù)比較多，各個(gè)節(jié)點(diǎn)的控制度Xrate相近，雖然可以觀察到遠(yuǎn)端突變通過(guò)準(zhǔn)“牛頓搖籃”誘導(dǎo)契合機(jī)制對(duì)反應(yīng)中心產(chǎn)生結(jié)構(gòu)微擾。由于遠(yuǎn)端突變同時(shí)改變了過(guò)渡態(tài)和中間體，導(dǎo)致預(yù)反應(yīng)態(tài)活性構(gòu)象布居數(shù)與催化活性呈現(xiàn)非線性相關(guān)，單憑借分子動(dòng)力學(xué)模擬提供的預(yù)反應(yīng)態(tài)信息尚不足以確定分子進(jìn)化已經(jīng)相對(duì)完善的催化元件突變效應(yīng)，需要系統(tǒng)地計(jì)算反應(yīng)勢(shì)能面內(nèi)所有高控制度的TDTS和TDI。

4.4 磷酸吡哆醛依賴脫羧酶

磷酸吡哆醛（PLP，又稱維生素B6）依賴酶具有多功能的特性，通常在休止?fàn)顟B(tài)時(shí)PLP 的醛基與酶中保守賴氨酸殘基形成席夫堿中間體，底物氨基酸的氨基親核進(jìn)攻該中間體的亞氨基而置換出賴氨酸形成外醛亞胺（external aldimine）與PLP 交聯(lián)。新形成的外醛亞胺中間體的碳-氮或碳-碳斷裂分別發(fā)生轉(zhuǎn)胺、消旋、β-消除、逆羥醛反應(yīng)等多個(gè)候選反應(yīng)途徑［107］。我們從酪氨酸脫羧酶的晶體結(jié)構(gòu)出發(fā)，構(gòu)建外醛亞胺決速中間體（TDI），然后利用受約束的分子動(dòng)力學(xué)模擬獲得外醛亞胺脫羧反應(yīng)的預(yù)反應(yīng)態(tài)，通過(guò)對(duì)理論酶過(guò)渡態(tài)的內(nèi)稟反應(yīng)坐標(biāo)展開(kāi)前線軌道分析，發(fā)現(xiàn)預(yù)反應(yīng)態(tài)與過(guò)渡態(tài)有非常相近的立體電子效應(yīng)：負(fù)電荷從羧基轉(zhuǎn)移到PLP的π 電子系統(tǒng)，碳-碳成鍵σ 軌道的電子流向C＝N的π*軌道，這種超共軛效應(yīng)是PLP 酶選擇性催化碳碳鍵斷裂的主要原因［108］。由此可見(jiàn)，碳碳鍵與碳氮雙鍵保持相互垂直并且二面角為90°可以最大化σ-π*前線軌道的相互作用，這活性構(gòu)象特征適用于PLP 依賴脫羧酶的各種突變體結(jié)合不同底物的脫羧反應(yīng)。為了維系預(yù)反應(yīng)態(tài)活性構(gòu)象，His98、His241 必須利用氫鍵錨定即將離去的二氧化碳基團(tuán)，使得碳氧鍵保持在一個(gè)特定的方向從而使得預(yù)反應(yīng)態(tài)內(nèi)反應(yīng)前線軌道對(duì)齊，而Lys240-His241 的動(dòng)態(tài)行為與PLP 進(jìn)入活性位置相呼應(yīng)，His241 的芳環(huán)與PLP 的芳環(huán)呈現(xiàn)π-π相互作用。預(yù)反應(yīng)態(tài)分析與H241 的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合，說(shuō)明PLP 脫羧酶的外醛亞基的確是酶活控制度最大的核心預(yù)反應(yīng)態(tài)。

4.5 N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶

海因酶系是藥物中間體D 型氨基酸的生物合成途徑之一，其中包括了海因消旋酶、海因酶和N- 氨甲酰-D- 氨基酸酰胺水解酶 Dcarbamoylase［109］。在工業(yè)生產(chǎn)中，D-carbamoylase的熱穩(wěn)定性和活性都遠(yuǎn)遜于海因酶及消旋酶，我們對(duì)來(lái)自N.indicus的野生型及人工進(jìn)化高效突變體M4 展開(kāi)了預(yù)反應(yīng)態(tài)分析，聚焦該酶催化反應(yīng)中Cys171 親核進(jìn)攻底物酰胺的決速步［110］。在該預(yù)反應(yīng)態(tài)中Lys126 穩(wěn)定親核進(jìn)攻衍生出的氧負(fù)離子洞，而Glu47作為質(zhì)子受體以鹽橋穩(wěn)定羧基，因?yàn)橛H核進(jìn)攻時(shí)親核試劑的最高占據(jù)軌道需要對(duì)齊羧基的最低未占據(jù)π*軌道，親核進(jìn)攻的最適宜角度（Bürgi-Dunitz 角度）為107°左右。在野生型中，該角度分布在60°～100°或120°～150°，只有6.4%的構(gòu)象在100°～110°之間。而在高效突變體M4 的預(yù)反應(yīng)態(tài)中，親核進(jìn)攻角被優(yōu)化到與Bürgi-Dunitz進(jìn)攻角相匹配（26.4%），說(shuō)明M4 的活性構(gòu)象布居數(shù)提高了近4倍。進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在野生型的活性口袋比較寬敞，而M4 高效突變體的口袋變窄使得底物與酶有更多的相互作用，Asn172 和Asn196 與底物形成了更穩(wěn)定的氫鍵網(wǎng)絡(luò)、Cys171與Arg174 的氫鍵作用倍增、His144 與Phe288/Pro198 之間的π-π 相互作用和疏水作用等有利因素。雖然這些相互作用的變化并不是直接來(lái)之M4高效突變體的4個(gè)位點(diǎn)（D187N、A200N、S207A、R211G），然而可以觀察到M4 這些殘基突變對(duì)活性口袋結(jié)合底物產(chǎn)生了明顯的影響。

4.6 普魯蘭多糖酶

普魯蘭多糖酶是糖苷水解酶家族的重要成員之一，催化α-1，6-糖苷鍵水解反應(yīng)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、材料、有機(jī)金屬化學(xué)和糖化行業(yè)［111］。通過(guò)對(duì)同源酶的序列突變的交互熵分析，挖掘到協(xié)同進(jìn)化殘基對(duì)，進(jìn)一步利用定點(diǎn)飽和突變掃描鎖定位點(diǎn)，成功獲得了遠(yuǎn)離活性中心2 nm 以上的高效突變體K631V/Q597K/D541I/D473E［112］。根據(jù)前人的QM/MM 計(jì)算我們對(duì)野生型和高效突變體展開(kāi)了預(yù)反應(yīng)態(tài)分子動(dòng)力學(xué)模擬，該酶的決速步為催化中心天冬氨酸進(jìn)攻α-1，6-糖苷鍵的SN2 取代反應(yīng)，相應(yīng)的預(yù)反應(yīng)態(tài)活性構(gòu)象的幾何參數(shù)定義為Asp619的羧基與糖苷鍵C1 碳原子之間的距離和它們與離去基團(tuán)烷氧基的夾角，計(jì)算結(jié)果表明碳氧距離的低四分位點(diǎn)在高效突變體中0.428 nm（最小值0.374 nm）而野生型為0.480 nm（最小值0.424 nm），進(jìn)攻角的高四分位點(diǎn)在高效突變體中143°（最大值175°）而野生型為134°（最大值157°），說(shuō)明普魯蘭多糖酶高效突變體的預(yù)反應(yīng)態(tài)構(gòu)象明顯優(yōu)于野生型。

4.7 冠狀病毒主蛋白酶

冠狀病毒的主蛋白酶（3C 蛋白酶）對(duì)于冠狀病毒的生命活動(dòng)極為重要，是抗冠狀病毒藥物設(shè)計(jì)的重要靶點(diǎn)。根據(jù)前人對(duì)SARS 病毒中主蛋白酶的QM/MM 的分子機(jī)制計(jì)算，催化口袋中His41 殘基與Cys148 形成氫鍵，極化了Cys148 硫原子的親核性［113］。因此，預(yù)反應(yīng)態(tài)定義為包含Cys148 巰基負(fù)離子-His41 咪唑陽(yáng)離子對(duì)的蛋白質(zhì)復(fù)合物，通過(guò)對(duì)比MERS 冠狀病毒野生型和M168L/T174V 突變型的預(yù)反應(yīng)態(tài)分子動(dòng)力學(xué)模擬中活性構(gòu)象布局?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)S-C 距離在二者之間并無(wú)太大區(qū)別（均可小于0.35 nm），說(shuō)明Cys148巰基負(fù)離子都能夠接近底物目標(biāo)肽鍵碳原子，然而從親核進(jìn)攻角度而言，在突變型中巰基負(fù)離子能夠更準(zhǔn)確對(duì)準(zhǔn)底物Gln-Ser 肽鍵的π*反鍵軌道——突變型進(jìn)攻角中位數(shù)為86°而在野生型為82°，突變后與Bürgi-Dunitz 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)攻角度107°更接近，因此它們的HOMO-LUMO 相互作用更強(qiáng)，進(jìn)攻鍵角100°～110°二面角85°～90°范圍的活性構(gòu)象布居數(shù)之比為1∶1.8。鑒于分子動(dòng)力學(xué)模擬中99%以上的構(gòu)象都為休止?fàn)顟B(tài)（S-C 距離>0.48 nm），說(shuō)明冠狀病毒主蛋白酶與底物蛋白的進(jìn)化尚未完全，M168L/T174V 突變僅部分提高了催化活性［114］。

在表1中對(duì)前期的預(yù)反應(yīng)態(tài)研究做了一個(gè)系統(tǒng)的總結(jié)，所選擇的催化元件反應(yīng)勢(shì)能面在前人的QM/MM 研究中皆已經(jīng)報(bào)道，在預(yù)反應(yīng)態(tài)模型分析中聚焦反應(yīng)勢(shì)能面控制點(diǎn)的選擇、高效突變體或遠(yuǎn)端突變對(duì)催化中心幾何結(jié)構(gòu)和電子結(jié)構(gòu)的微擾作用，以及活性構(gòu)象布居數(shù)的變化。

表1 預(yù)反應(yīng)態(tài)模型的研究實(shí)例［95-98，101，103，106，108，110，112，114］Tab.1 Pre-reaction states of the studied enzymes,control points,and geometric parameters［95-98，101，103，106，108，110，112，114］

續(xù)表

5 挑戰(zhàn)與展望

可見(jiàn)預(yù)反應(yīng)模型基于催化元件的已知催化分子機(jī)制，假設(shè)蛋白質(zhì)工程定向進(jìn)化中催化循環(huán)反應(yīng)途徑并沒(méi)有發(fā)生巨變，而是通過(guò)殘基突變精修控制度較大的TDTS 和TDI 能量點(diǎn)，逐步達(dá)到人工進(jìn)化完善狀態(tài)，這一逐步優(yōu)化逼近的過(guò)程與天然進(jìn)化相似，由于在超級(jí)計(jì)算機(jī)中運(yùn)行，其優(yōu)化速度可以超過(guò)天然進(jìn)化，有望達(dá)到超進(jìn)化的合成生物學(xué)工程化要求。由于目前的通用型量子力學(xué)和分子動(dòng)力學(xué)模擬的能量準(zhǔn)確度尚不能達(dá)到實(shí)驗(yàn)精度（1 kcal/mol），關(guān)鍵步預(yù)反應(yīng)態(tài)的選擇上具有相當(dāng)?shù)碾S意性，通常是綜合考慮分子進(jìn)化對(duì)催化反應(yīng)的化學(xué)鍵斷裂和形成難易程度、多反應(yīng)途徑選擇下的專一性（如手性選擇性）、催化反應(yīng)的可逆性等來(lái)確定需要優(yōu)化的能量點(diǎn)，利用分子對(duì)接和手工搭建方法構(gòu)建符合量子力學(xué)計(jì)算結(jié)果的活性構(gòu)象，然后利用超級(jí)計(jì)算機(jī)GPU 分子動(dòng)力學(xué)模擬的快速采樣，分析催化元件氨基酸殘基突變或周邊環(huán)境對(duì)活性構(gòu)象的影響。因此，預(yù)反應(yīng)態(tài)模型可以用一個(gè)比較廉價(jià)的計(jì)算方案，在假設(shè)被擬合點(diǎn)對(duì)目標(biāo)函數(shù)具有較高控制度的情況下，測(cè)算各種因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。預(yù)反應(yīng)態(tài)計(jì)算可以覆蓋催化元件外部環(huán)境對(duì)酶活性的影響，例如溫度效應(yīng)、酸堿效應(yīng)、非水介質(zhì)及小分子效應(yīng)以及產(chǎn)物底物受限輸運(yùn)。通過(guò)對(duì)比不同介質(zhì)（氣相、水相、有機(jī)相、催化元件約束、Theozyme簡(jiǎn)化中心）的分子模擬，收集不同化學(xué)環(huán)境下預(yù)反應(yīng)態(tài)的變化，提取和標(biāo)記每個(gè)可以有效降低反應(yīng)活化能的分子間相互作用（如極性氨基酸形成的氫鍵、離子對(duì)鹽橋、離子-芳環(huán)相互作用等），可以建立催化中心保守性結(jié)構(gòu)的化學(xué)信息，將一系列保守結(jié)構(gòu)信息圖譜歸納為“預(yù)反應(yīng)態(tài)”的特征，從而可以利用信息學(xué)方法量化非酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為催化反應(yīng)時(shí)機(jī)制變化，通過(guò)修改底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和氨基酸殘基及功能基團(tuán)的空間布局，達(dá)到改變反應(yīng)體系活性中心化學(xué)環(huán)境，優(yōu)選出最佳反應(yīng)通路。

預(yù)反應(yīng)態(tài)不同于精細(xì)的量子力學(xué)計(jì)算，如基于inside-out 策略來(lái)改造或拓新催化反應(yīng)機(jī)制，它更多地在對(duì)所獲得的新酶分子初步定向進(jìn)化后需要進(jìn)一步改造的場(chǎng)景下利用已有海量實(shí)驗(yàn)酶活數(shù)據(jù)和已知催化分子機(jī)制，采用高性能計(jì)算建模來(lái)優(yōu)化催化元件。預(yù)反應(yīng)態(tài)模型結(jié)合突變文庫(kù)酶活的大數(shù)據(jù)分析方法可以快速定位高效突變體對(duì)催化中心活性構(gòu)象的影響，并進(jìn)一步確定特定功能區(qū)和協(xié)同進(jìn)化位點(diǎn)，確定nanozyme 和theozyme 為模板的酶催化反應(yīng)的不同階段的活性中心反應(yīng)勢(shì)能面、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和介質(zhì)效應(yīng)，驗(yàn)證了簡(jiǎn)化活性中心模型反應(yīng)勢(shì)能面上的關(guān)鍵中間體和過(guò)渡態(tài)在計(jì)算機(jī)輔助合理設(shè)計(jì)中的有效性和一致性，利用結(jié)構(gòu)信息和能量信息分析活化焓和活化熵變化。利用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)-計(jì)算數(shù)據(jù)循環(huán)驗(yàn)證的方法自動(dòng)化收集反應(yīng)勢(shì)能面上的關(guān)鍵點(diǎn)，為高階量化過(guò)渡態(tài)計(jì)算提供反應(yīng)坐標(biāo)參數(shù)，避免在新酶計(jì)算機(jī)分子設(shè)計(jì)中人為搭建過(guò)渡態(tài)的盲目性。在預(yù)反應(yīng)態(tài)計(jì)算中可以觀察到催化動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)對(duì)活性中心具有顯著效應(yīng)，與酶學(xué)中遠(yuǎn)端突變產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)效應(yīng)相吻合，所用預(yù)反應(yīng)模型具有內(nèi)稟性的“dynamozyme”的概念，它來(lái)源于酶促反應(yīng)分子機(jī)制中的活化熵變化，但底物分子受到催化元件約束時(shí)在原子運(yùn)動(dòng)水平上的動(dòng)態(tài)特性。這種動(dòng)態(tài)特性與催化元件的亞基多聚、嗜熱或嗜冷、極端條件敏感性相關(guān)，將成為預(yù)反應(yīng)態(tài)研究的熱點(diǎn)。