分子伴侶作用下的蛋白質(zhì)穩(wěn)定與進化

唐宇琦，葉松濤，劉嘉，張鑫

（1西湖大學理學院化學系，浙江 杭州 310030；2浙江西湖高等研究院，理學研究所，浙江 杭州 310024）

蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)起到十分重要的作用，從基礎的能量儲存到復雜的生物代謝都離不開蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)通常會被折疊成多級結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)折疊的復雜程度決定了其結(jié)構(gòu)和功能的多樣性。大多數(shù)天然蛋白質(zhì)的折疊僅具有邊緣穩(wěn)定性（marginal stability），這種邊緣穩(wěn)定性在保證蛋白質(zhì)功能正常的情況下，賦予了蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上偏離最穩(wěn)定狀態(tài)去行使功能的能力。邊緣穩(wěn)定性的弊端是蛋白質(zhì)容易發(fā)生錯誤折疊，導致蛋白質(zhì)喪失正常功能。因此，生物體內(nèi)有一套復雜的質(zhì)量控制機制用來幫助蛋白質(zhì)正確折疊、修復或降解錯誤折疊的蛋白質(zhì)。但是作為生物體內(nèi)重要的工具，蛋白質(zhì)在維持穩(wěn)定的同時，也同樣在進化。在實驗室里，科學家們通過定向進化（directed evolution）的方法來產(chǎn)生并優(yōu)化蛋白質(zhì)的新功能，用于開發(fā)新型催化劑、新型藥物抗體、生產(chǎn)可再生燃料等。蛋白質(zhì)的定向進化需要具有新功能的蛋白質(zhì)突變體，這就要求蛋白質(zhì)折疊過程能夠適應翻譯錯誤的新突變體，并將它們折疊成具有新功能的復雜多級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性（stability）是生物體內(nèi)生理活動正常進行的基礎，而蛋白質(zhì)的可進化性（evolability）則是生物體適應自然條件選擇的關鍵因素。圍繞這一關鍵問題，本文首先簡述了蛋白質(zhì)個體的穩(wěn)定性（protein stability）以及蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)（protein homeostasis）的異同，并詳盡介紹了以熱休克蛋白（heat shock protein，Hsp）為主的分子伴侶（molecular chaperone）對于維持蛋白質(zhì)個體穩(wěn)定性的重要作用，以及通過多種手段維持內(nèi)環(huán)境蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的研究。隨后本文總結(jié)了蛋白質(zhì)穩(wěn)定性與可進化性關系的研究進展，并通過分子伴侶輔助定向進化、分子伴侶自身定向進化兩方面實例，闡述了蛋白質(zhì)穩(wěn)定性對于可進化性的重要意義。

1 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性

1.1 蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)僅具有邊緣穩(wěn)定性

多肽鏈經(jīng)核糖體合成后通常需要折疊成一個在體內(nèi)具有生理功能的多級結(jié)構(gòu)，也稱為天然結(jié)構(gòu)（native structure）。諾貝爾獎得主Christian Anfinsen的早期實驗提出蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)是其正常折疊時的最低能量態(tài)。盡管如此，人們通過對天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行突變發(fā)現(xiàn)，天然蛋白質(zhì)序列并非保持生理功能前提下的最穩(wěn)定序列，多數(shù)蛋白質(zhì)可以在保持乃至提高功能的情況下得到熱力學更穩(wěn)定的突變體。其中蛋白酶作為天然蛋白質(zhì)的代表，因催化活性檢測方法比較簡單、直觀，并且研究體系也不復雜，成為被廣泛研究的體系。例如，Giver 等早在1998 年通過將野生型（wild-type）對硝基芐基酯酶（pNBE）進行體外定向進化，得到了既能保持低溫活性又具有更好熱穩(wěn)定性的突變體［1］；同一年，Van Den Burg通過定點突變增強嗜熱菌蛋白酶樣蛋白酶（TLP-ste）的剛性結(jié)構(gòu)，得到能夠在極端環(huán)境中保持其活性的突變體［2］；Miyazaki等人在2000年也僅通過7個氨基酸殘基的突變就得到穩(wěn)定性大幅增強的嗜冷酶突變體，并發(fā)現(xiàn)該突變體穩(wěn)定性的增加來源于與Ca2+結(jié)合能力的增強［3］。雖然這些研究都只是針對天然蛋白質(zhì)氨基酸序列及其特定催化功能的探究，但以實踐表明天然蛋白質(zhì)并非處于最穩(wěn)定狀態(tài)。除此以外，蛋白質(zhì)錯誤折疊時形成的無規(guī)蛋白質(zhì)沉淀（amorphous protein aggregates）和淀粉樣蛋白質(zhì)纖維（amyloid fibrils）均被證實比天然結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。

蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性不僅僅決定于氨基酸序列，還決定于其他與蛋白質(zhì)相互作用的生物大分子以及周圍的物理化學環(huán)境。例如，研究發(fā)現(xiàn)生物素（biotin）與鏈霉親和素（streptavidin）的緊密結(jié)合能夠顯著提高后者在高溫下的穩(wěn)定性［4］；許多DNA/RNA 結(jié)合蛋白與DNA/RNA 的多價相互作用（multivalent interactions）也能夠幫助提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，如TDP-43、FUS、TAF15 等［5-7］；甚至是細胞中常見離子濃度的變化就能夠在一定程度上影響蛋白質(zhì)的折疊［8-10］。人們不僅通過突變得到熱力學更穩(wěn)定的突變體，還運用計算發(fā)現(xiàn)多數(shù)天然蛋白質(zhì)的折疊自由能（?Gf）僅在-10 kcal/mol左右，即輕微的擾動就很有可能影響蛋白質(zhì)的正確折疊，揭示出天然蛋白質(zhì)具有邊緣穩(wěn)定性（marginal stability），為進一步探究蛋白質(zhì)構(gòu)效關系提供更深層次的理解［1，11-12］

1.2 蛋白質(zhì)組的邊緣穩(wěn)定性

除了單一蛋白質(zhì)以外，蛋白質(zhì)組也被證實具有邊緣穩(wěn)定性。Ghosh 等人在2010 年通過建立量化模型對多種生物體的蛋白質(zhì)組進行分析，提出蛋白質(zhì)組的穩(wěn)定性并不取決于組內(nèi)蛋白質(zhì)折疊自由能的平均值，而取決于其折疊自由能分布函數(shù)中靠近尾端的蛋白質(zhì)，即蛋白質(zhì)組中折疊穩(wěn)定性相對較差的蛋白質(zhì)［13］。例如，在大腸桿菌（Escherichia coli）里的4300 多種蛋白質(zhì)中，約有15%的蛋白質(zhì)折疊自由能（?Gf）高于-4 kcal/mol。對于這部分蛋白質(zhì)，少許突變或輕微的環(huán)境擾動就可能導致蛋白質(zhì)不能夠正常折疊，進而影響其功能。為了驗證這一點，他們將環(huán)境溫度從37°C升高到41°C，發(fā)現(xiàn)盡管4°C 的溫度變化對蛋白質(zhì)組的平均折疊自由能影響不大（?Gf從-7 kcal/mol提高到-5.6 kcal/mol），卻會直接導致分布函數(shù)中靠近尾端的蛋白質(zhì)變得不穩(wěn)定。這些不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的錯誤折疊不僅會影響蛋白質(zhì)組中其他蛋白質(zhì)的折疊和運作，還需要占用大量分子伴侶和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system）來修復或降解。當細胞中的質(zhì)量控制系統(tǒng)不足以抵擋錯誤折疊蛋白質(zhì)帶來的負面影響，蛋白質(zhì)組整體穩(wěn)定性被破壞，即打破了蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)?？傮w來說，這些實驗結(jié)果不僅強調(diào)了蛋白質(zhì)個體的邊緣穩(wěn)定性，也闡述了少量蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定折疊會直接破壞整體蛋白質(zhì)組的穩(wěn)態(tài)，即蛋白質(zhì)組也存在邊緣穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)是細胞開展正常生理活動的保障，而蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的破壞會引發(fā)細胞、組織甚至器官的生理功能異常，并會直接導致含阿爾茲海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）、亨廷頓病（Huntington’s disease，HD）以及帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病（neurodegenerative diseases）。

2 分子伴侶在蛋白質(zhì)折疊中的重要作用

2.1 分子伴侶家族簡介

由于天然蛋白質(zhì)具有邊緣穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)自身的突變或周圍環(huán)境的細微變化都可能引發(fā)蛋白質(zhì)的錯誤折疊。蛋白質(zhì)的錯誤折疊不僅會使得蛋白質(zhì)喪失正常功能；錯誤折疊蛋白質(zhì)的積累還會破壞細胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)網(wǎng)絡并導致疾?。?4-17］。因此，蛋白質(zhì)折疊過程的質(zhì)量控制對蛋白質(zhì)組的平衡甚至是細胞和有機體的健康至關重要。正因如此，生物進化出了一系列質(zhì)量控制網(wǎng)絡，從介導蛋白質(zhì)正確折疊的分子伴侶，到降解錯誤折疊或聚集蛋白質(zhì)的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，共同維持細胞內(nèi)環(huán)境蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)［18-20］。分子伴侶通?？梢员欢x為幫助其他生物大分子（如蛋白質(zhì)）折疊或組裝成相應功能活性構(gòu)象，但不參與最終結(jié)構(gòu)組成的任何蛋白質(zhì)［21］。最具代表性的分子伴侶是熱休克蛋白。熱休克蛋白在細胞受環(huán)境溫度、壓力或化學物質(zhì)的刺激時被上調(diào)，從參與新生肽的折疊、錯誤折疊蛋白質(zhì)的展開以及重新折疊，到參與寡聚物的組裝、異常蛋白質(zhì)的降解和功能蛋白質(zhì)的運輸，在維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的同時協(xié)助細胞完成特定生理功能［22-25］。

近幾十年來，分子生物學家主要在原核生物中探究分子伴侶的作用機制，這是因為相比于真核生物，原核生物體系更為簡單。真核生物蛋白質(zhì)通常較大，并具有復雜結(jié)構(gòu)域，蛋白質(zhì)構(gòu)效關系也更為多元化。不僅如此，為了有效配合細胞正常執(zhí)行功能，真核生物中分子伴侶分布更為廣泛，例如細胞質(zhì)、細胞核以及線粒體［26］。原核生物體系，尤其是以大腸桿菌為代表的細菌常被作為宿主大量表達用于生物研究的重組蛋白，在細胞生物學中被用于探究生化反應機理，或在生物工程中被用于探究蛋白質(zhì)的定向進化。分子伴侶被證實能夠有效提升外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌內(nèi)的折疊效率，在提升活性外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)率上起到重要作用［27］。了解原核生物體系分子伴侶的作用機理，對于理解更為復雜的真核生物體系，如哺乳動物細胞中分子伴侶的構(gòu)效關系是十分必要的。因此，本章節(jié)主要以大腸桿菌為體系闡述部分重要的分子伴侶的結(jié)構(gòu)及其作用機制。

首先，根據(jù)分子伴侶分子量的大小可以把它們進行簡單分類，如Hsp90家族（約90 kDa）、Hsp70家族（約70 kDa）、Hsp60家族（約60 kDa）以及一些小分子熱休克蛋白（sHsp，12～43 kDa）［23］。不同的分子伴侶側(cè)重的功能也不盡相同。以大腸桿菌分子伴侶為例，主要可以把它們分為：保持酶（holdase）、折疊酶（foldases）和解聚酶（disaggregases）。保持酶主要負責穩(wěn)定新生肽鏈或部分折疊的蛋白質(zhì)，其中包括觸發(fā)因子（trigger factor， TF）和IbpA/IbpB（大腸桿菌內(nèi)小分子熱休克蛋白同源物）［28-29］。折疊酶主要負責在ATP 的驅(qū)動下幫助新生肽鏈折疊，展開錯誤折疊的蛋白質(zhì)并將其進行重新折疊，其中包括DnaK（大腸桿菌內(nèi)Hsp70 同源物）、GroEL（大腸桿菌內(nèi)Hsp60 同源物）和HptG（大腸桿菌內(nèi)Hsp90 同源物）［28，30］。其余不可逆轉(zhuǎn)的蛋白質(zhì)沉淀則被解聚酶ClpB（大腸桿菌內(nèi)Hsp100 同源物）溶解（圖1）［31］。

圖1 大腸桿菌中由分子伴侶和蛋白酶調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)網(wǎng)絡Fig.1 Proteostasis network modulated by molecular chaperones and proteases in E.coli

2.2 保持酶

TF 是大腸桿菌內(nèi)作用于新生肽鏈的首要分子伴侶，主要負責穩(wěn)定新生肽鏈，防止其錯誤折疊［32-33］。它不依賴于ATP，而是通過與核糖體相互作用形成動態(tài)反應循環(huán)［24］。首先，與核糖體的結(jié)合將TF 保持在開放的、活化的構(gòu)象中。當新生肽鏈從核糖體出口處離開核糖體時，TF 會隨即與該段肽鏈結(jié)合，并迅速脫離核糖體（約0.10 秒）。相較于其他分子伴侶，TF 不具有特定底物的結(jié)合位點，而是將整個蛋白質(zhì)內(nèi)腔用于與底物的結(jié)合。TF 內(nèi)腔表面混合分布著疏水性和親水性氨基酸殘基，并同時通過疏水作用和親水作用最大效率幫助TF 與新生肽鏈結(jié)合。隨著肽鏈的不斷延長，多個TF 會相繼進入核糖體對接位點，持續(xù)保護新生成的肽鏈。在核糖體完成翻譯后，新生肽鏈可以直接被轉(zhuǎn)移到下游的分子伴侶如DnaK 和GroEL，并在它們的幫助下完成折疊［28，34-35］。TF 在細胞中處于單體和二聚體之間的動態(tài)轉(zhuǎn)化，前者主要存在于同核糖體結(jié)合時的功能狀態(tài)，而后者主要負責協(xié)助細胞質(zhì)中蛋白質(zhì)的折疊以及其他細胞活動［36］。

IbpA 和IbpB 是大腸桿菌里兩種小分子熱休克蛋白，與大腸桿菌中包涵體（inclusion body）的形成有關［37］。IbpA/IbpB 主要作為保持酶，與錯誤折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，并將其傳遞給DnaK/DnaJ、ClpB 分子伴侶系統(tǒng)進行重新折疊［38］。這兩種分子伴侶有48%的序列相似性，并且在大腸桿菌內(nèi)以異源二聚體的形式執(zhí)行其功能［39］。然而，IbpA 和IbpB 在功能上存在顯著差異：前者更傾向于與錯誤折疊的蛋白質(zhì)共沉積，甚至形成纖維狀聚集體；而IbpB 能夠激活Lon 蛋白酶對IbpA 的降解［40］。盡管目前對IbpA/IbpB 的作用機理缺乏更為詳細的闡述，但是可以確定的是IbpA 與IbpB 間相互作用對錯誤折疊蛋白質(zhì)的解聚有重要影響。

2.3 折疊酶

Hsp70/Hsp40、Hsp60/Hsp10 以 及Hsp90 是 幫助蛋白質(zhì)折疊的代表性分子伴侶。這些分子伴侶通過與新生多肽或是錯誤折疊蛋白質(zhì)暴露出來的疏水性氨基酸結(jié)合來阻止其進一步的聚集，并在ATP和其他輔助因子的共同作用下進行功能構(gòu)型的動態(tài)循環(huán)，實現(xiàn)對底物的結(jié)合與釋放，從而廣泛參與了蛋白質(zhì)從頭折疊以及重新折疊［22，41］。雖然大腸桿菌內(nèi)大多數(shù)新合成的蛋白質(zhì)能夠自行折疊成其特定三維結(jié)構(gòu)，但是仍有約20%～30%的蛋白質(zhì)被證明需要分子伴侶幫助其折疊成相應的功能構(gòu)型［22-23，42］。

Hsp70/Hsp40 分子伴侶系統(tǒng)在幫助蛋白質(zhì)折疊以及維護蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面起到重要作用［23］。Hsp70主要在共分子伴侶Hsp40 以及核苷酸交換因子（nucleotide exchange factor， NEF）的輔助下完成對底物蛋白質(zhì)的折疊［43］。Hsp40 首先和底物結(jié)合，并將底物帶到Hsp70附近［44］。Hsp70從真核生物到原核生物都高度同源，因此，在許多研究中均以大腸桿菌內(nèi)Hsp70 的同源物——DnaK 為模型來探究其結(jié)構(gòu)和功能。Hsp40在大腸桿菌里的同源物為DnaJ，與Hsp70 不同的是，Hsp40 進化出種類更多的同源物。Hsp40 的多元化決定了不同Hsp40 家族成員具有不同底物結(jié)合位點，從而允許對底物的特異性選擇［45］。DnaK 是一個二聚體，通過其氨基末端ATP 酶結(jié)構(gòu)域（ATPase domain）與羧基末端肽鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域（peptide-binding domain）的變構(gòu)偶聯(lián)實現(xiàn)對底物的結(jié)合和釋放［46-47］。其中肽鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域主要由控制底物進出的α-螺旋蓋（α-helical lid）和β-夾心（β-sandwich）組成，后者負責與DnaJ 帶來的舒展且富含疏水性氨基酸的殘基片段結(jié)合（圖2）［48-50］。當DnaK 的氨基末端與ATP 結(jié)合時，α-螺旋蓋開放，此時DnaK 對肽鏈的親和力較低［51］。DnaJ 和DnaK 之間的相互作用加速了ATP的水解，并促使DnaK 構(gòu)型發(fā)生變化，即α-螺旋蓋閉合形成密閉結(jié)構(gòu)，同時羧基末端與底物的相互作用增強（圖2）［44，52-55］。當DnaJ 從DnaK 解離后，核苷酸交換因子GrpE 的結(jié)合促進了ADP 的解離。而在下一個ATP 與DnaK 結(jié)合并開始新一輪循環(huán)時，α-螺旋蓋再次開放，同時釋放出底物［42，56］。其中一部分底物已經(jīng)完成折疊或仍處于未折疊狀態(tài)，還有一部分底物可能需要被進一步輸送到下游分子伴侶如Hsp90，完成后期加工才能被正常使用［57］。DnaK/DnaJ 在與底物結(jié)合的過程中提供了保護機制，防止蛋白質(zhì)自身或在外界物質(zhì)的影響下錯誤折疊，Hsp70的過表達也被證明能夠有效阻止蛋白質(zhì)的聚集。不僅如此，一些DnaJ 還能夠與已經(jīng)折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合，而在這種情況下，DnaK發(fā)揮展開作用［54］；Hsp70 還可以與Hsp100 ATP 酶合作，分解不可逆大聚集體［58］；Hsp70 的構(gòu)象循環(huán)還可以作為傳輸工具，將蛋白質(zhì)遞送給轉(zhuǎn)運酶，隨后轉(zhuǎn)運酶幫助蛋白質(zhì)穿過細胞器膜［59-60］?？偟膩碚f，Hsp70的作用不僅僅局限于幫助底物折疊，還能夠引導底物的展開與解聚，以及充當運輸工具。

圖2 ADP結(jié)合（左）和ATP結(jié)合（右，PDB代碼：4B9Q）［55］的Hsp70構(gòu)象［在ADP結(jié)合狀態(tài)下，肽鏈結(jié)合結(jié)構(gòu)域（PDB代碼：1DKZ）［50］和ATP酶結(jié)構(gòu)域（PDB代碼：3HSC）［51］通過靈活的氨基酸鏈連接］Fig.2 ADP-bound(left)and ATP-bound(right,PDB code:4B9Q)[55]conformations of Hsp70[In the ADP-bound state,the peptide-binding domain(PDB code:1DKZ)[50]and ATPase domain(PDB code:3HSC)[51]are connected by a flexible linker]

作為Hsp60/Hsp10 的同源物，GroEL/GroES 是大腸桿菌中被研究得最多的分子伴侶［61］。GroEL由14 個相同亞基組成，它們以對稱的方式排列成兩個背對背的七元環(huán)，從而堆疊成一個高約15 nm的圓柱體折疊籠（圖3）［62-65］。折疊籠內(nèi)部是一個直徑約為5 nm 的開口空腔，內(nèi)壁形成光滑的疏水表面，以此選擇性地捕獲因未折疊或錯誤折疊而暴露出的疏水性肽鏈。作為GroEL 的共分子伴侶，GroES 是一個由7 個相同的β 桶組成的七元環(huán)，通過與GroEL 的頂端結(jié)構(gòu)域相互作用形成折疊籠的蓋子［66-67］。當與ATP 結(jié)合后，GroEL 迅 速招 募GroES覆蓋折疊籠的空腔，同時進行結(jié)構(gòu)重組，將疏水性內(nèi)腔轉(zhuǎn)化為親水性、帶負電的封閉室［68-69］。受到封閉的環(huán)境限制，蛋白質(zhì)一旦進入親水腔內(nèi)部，或被迫保持展開狀態(tài)，或遵循其氨基酸序列決定的三維結(jié)構(gòu)進行折疊。當ATP 水解完成后，折疊籠被重新打開，并釋放出蛋白質(zhì)。GroEL的兩個七元環(huán)可以不間斷交替進行ATP 結(jié)合和ATP 水解的循環(huán)，所以當其中一個環(huán)釋放出的蛋白質(zhì)仍處于展開狀態(tài)時可以立即被另外一個環(huán)捕獲，并再次進行折疊嘗試（圖3）［70］。Hsp60 在細胞中不只是作為折疊機器，越來越多的證據(jù)表明Hsp60還能夠協(xié)助很多細胞活動，例如物質(zhì)運輸、信號傳導和細胞增殖，甚至還在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用［71］。

圖3 Hsp60七元環(huán)（左，PDB代碼：1IOK）［65］和Hsp60/Hsp10復合物（中，PDB代碼：1AON）［67］的結(jié)構(gòu)，以及Hsp60/Hsp10作用機理（右）Fig.3 Structures of the 7-membered ring in GroEL(left,PDB code:1IOK)[65]and the Hsp60/Hsp10(middle,PDB code:1AON)[67],as well as the working mechanism of Hsp60/Hsp10(right)

Hsp90 是一種高度保守且依賴ATP 的分子伴侶。與其他熱休克蛋白一樣，Hsp90能夠幫助蛋白質(zhì)折疊并預防蛋白質(zhì)聚集［72-73］。與其他分子伴侶不同的是，Hsp90功能更加專一，主要負責細胞信號傳導和發(fā)育相關蛋白質(zhì)的后期折疊，如類固醇激素受體、激酶和腫瘤抑制因子p53 等［74］。對大腸桿菌內(nèi)Hsp90 的同源物HptG 的研究表明，這類分子伴侶呈現(xiàn)出更為動態(tài)的構(gòu)象循環(huán)，以類似剪刀的展開閉合形式快速切換。HptG 二聚體通過羧基端連接形成一個打開的“V”字形，并在內(nèi)部形成疏水結(jié)構(gòu)（圖4）［75-76］。ATP 與HptG 兩氨基端結(jié)合引起二聚體明顯的構(gòu)象變化，進而氨基端相連接，形成扭曲的“分子鉗”（圖4）；ATP 的水解和ADP從氨基端的解離使得HptG 回到初始的“V”字狀態(tài)［77-79］。在這個循環(huán)中還有多個輔助因子的調(diào)節(jié)，如AHA1 刺激ATP 的水解，而CDC37 負責抑制ATP 酶的活性［80-81］。這些輔助因子共同幫助HptG進行構(gòu)象轉(zhuǎn)變，從而實現(xiàn)對靶蛋白的捕獲與釋放。除了單獨作用外，Hsp90還能和其他分子伴侶，例如Hsp70 相互作用，共同優(yōu)化關鍵調(diào)控蛋白的折疊［22］。在這個過程中，Hsp70 負責底物初期的折疊，通過共分子伴侶將釋放出的底物直接傳遞給下游的Hsp90完成最終的折疊［57］。

圖4 ADP結(jié)合（左，PDB代碼：2O1V）［79］和ATP結(jié)合（右，PDB代碼：2CG9）［76］的Hsp90構(gòu)象Fig.4 ADP-bound(left,PDB code:2O1V)[79]and ATP-bound(right,PDB code:2CG9)[76]conformations of Hsp90

除了大腸桿菌，上述所有分子伴侶在其他原核生物以及真核生物中都有許多對應的同源物，執(zhí)行著相似或不同的功能。例如，人類Hsp70同源物HspA 主要負責協(xié)調(diào)細胞應激反應。其中，HspA1A 被發(fā)現(xiàn)可以促進肝癌細胞增殖；HspA1B也在細胞增殖以及腫瘤生長上起到重要作用［82-83］。Hsp40在人類細胞中也存在相應同源物，主要可以分為DnaJA、DnaJB與DnaJC［84］。其中DnaJA與大腸桿菌中DnaJ 最為相似，而有些DnaJA 和DnaJB分子伴侶能夠獨立展開工作［85］。Hsp60 在人類線粒體中的同源物HspD 主要負責線粒體中蛋白質(zhì)的折疊，但是與細菌中GroEL 不同的是，HspD 活性結(jié)構(gòu)可以在單環(huán)和雙環(huán)間交替，并且兩個環(huán)可以同時和HspE（Hsp10在人類線粒體中的同源物）結(jié)合，以此提升折疊效率［86］。在細胞質(zhì)中，Hsp60的同源物為CCT，由8個不同的亞基組成，主要負責細胞質(zhì)中蛋白質(zhì)的折疊［87］。Hsp90在人類細胞質(zhì)中的同源物為Hsp90α 和Hsp90β，同時，Hsp90 還存在于線粒體（TRAP-1）以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（GRP94），它們在細胞中的廣泛分布強調(diào)了Hsp90在細胞穩(wěn)態(tài)中的重要作用［88］。

2.4 解聚酶

錯誤折疊蛋白質(zhì)的聚集被視為細胞衰老以及疾病的標志。為了維持正常的細胞環(huán)境，無法被重新折疊或者重新折疊失敗的蛋白質(zhì)會被進一步水解。蛋白水解系統(tǒng)識別錯誤折疊的蛋白質(zhì)，并使用AAA+（ATPases associated with diverse cellular activities）相關的蛋白酶如ClpP，以及ATP 酶如ClpA/X，直接參與維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。ClpP 是一個高度保守的絲氨酸蛋白酶，由兩個堆疊的七元環(huán)形成空腔，并允許蛋白質(zhì)在空腔內(nèi)部發(fā)生降解。每個ClpP 亞基中N 端環(huán)可以控制軸向開口；核心結(jié)構(gòu)域有負責水解底物的絲氨酸-組氨酸-天冬氨酸催化三聯(lián)體；相鄰亞基在ClpP頂端形成疏水裂縫，作為ATP 酶的結(jié)合位點。ClpA/X 是Hsp100 分子伴侶家族在大腸桿菌中的同源物，分別通過與ClpP形成復合物控制ClpP 的水解功能。這些ATP 酶由6 個相同的亞基形成六元環(huán)。每個亞基都有不止一個AAA+結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域負責ATP 的結(jié)合和水解。通過ATP 的結(jié)合和水解，ClpA/X 構(gòu)型發(fā)生變化，并運用積累的能量展開底物，隨后將底物推入ClpP 空腔內(nèi)部進行進一步水解。除了大腸桿菌中的ClpA/ClpX，維管植物中也存在多種Hsp100同源物，如擬南芥的葉綠體中就有ClpC1、ClpC2、ClpD 和ClpB3。Hsp100 不僅能夠通過與蛋白酶相互作用促進底物的水解，還能夠與其他分子伴侶形成雙分子伴侶體系。例如，酵母中發(fā)現(xiàn)的Hsp104 以及大腸桿菌中的ClpB 均為Hsp100 的同源物，它們均能夠與相應體系Hsp70的同源物協(xié)同作用，展開異常蛋白質(zhì)，并幫助其重新折疊。研究表明，該雙分子伴侶體系對底物有一定的選擇性，即ClpB 與DnaK 的親和力根據(jù)DnaK 結(jié)合的底物種類有很大差異。例如，當DnaK 與大分子量蛋白質(zhì)聚集體結(jié)合時，ClpB對DnaK表現(xiàn)出更高的親和力。不僅如此，ClpB-DnaK 的激活需要兩個分子伴侶的耦合活性，才能夠有效將底物從DnaK 轉(zhuǎn)移至ClpB。

除了ClpP，Lon蛋白酶也能幫助降解并清除受損或錯誤折疊的蛋白質(zhì)，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。Lon 蛋白酶是一種高度保守的蛋白酶，存在于細菌、真核生物線粒體以及其他細胞器中。同許多分子伴侶一樣，Lon 蛋白酶也是一種壓力應激蛋白，同時也屬于AAA+蛋白家族。Lon 蛋白酶是第一個被發(fā)現(xiàn)的ATP 依賴性蛋白酶，由相同亞基組成同源寡聚體。與ClpP 不同的是，Lon 蛋白酶每個亞基同時攜帶ATP 酶和蛋白酶結(jié)構(gòu)域。其N 端結(jié)構(gòu)域負責與底物結(jié)合，中間ATP 酶結(jié)構(gòu)域負責調(diào)節(jié)ATP的結(jié)合和水解，C端的絲氨酸和賴氨酸形成催化二聯(lián)體，在底物水解中起重要作用。大腸桿菌中，Lon蛋白酶還能降解許多具有調(diào)節(jié)功能的蛋白質(zhì)，而這些蛋白質(zhì)并非處于錯誤折疊狀態(tài)。除此之外，Lon蛋白酶同樣也在正常生理功能中起著重要調(diào)節(jié)作用。例如，在哺乳動物中，Lon蛋白酶展現(xiàn)出類似于分子伴侶的特征，能夠在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和缺氧期間被上調(diào)，為細胞提供保護功能。

3 提高蛋白質(zhì)（組）穩(wěn)定性手段的研究

3.1 過量表達分子伴侶

既然分子伴侶能夠幫助蛋白質(zhì)正確折疊，那么針對容易聚集的蛋白質(zhì)，是否可以通過過量表達分子伴侶來降低蛋白質(zhì)聚集的風險？早在1996 年Thomas 和Baneyx 就已經(jīng)在大腸桿菌內(nèi)驗證了這種方法的可行性［27］。他們選取的蛋白模型是一個三組分融合蛋白（preS2-S'-β-galactosidase），該蛋白質(zhì)兩結(jié)構(gòu)域之間被插入一段含有30 個氨基酸的短疏水序列，使其高度易聚集［89］。在明確了過度表達分子伴侶對融合蛋白的合成速率沒有顯著影響后，他們直接過量表達質(zhì)粒編碼的DnaK/DnaJ 來探究分子伴侶的過度表達對融合蛋白酶活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)DnaK/DnaJ 的過度表達不僅能夠顯著增強該蛋白質(zhì)在高溫下（42°C）的酶活性，還能夠在低溫（30°C）和正常溫度（37°C）下進一步提高活性酶的回收率。

關于過度表達分子伴侶對酶活性的提升，主要可以從兩種機理解釋：一是分子伴侶能夠通過與蛋白質(zhì)相互作用促進其正確折疊。在沒有過量表達分子伴侶時，小部分的蛋白質(zhì)消耗掉了環(huán)境中可用的分子伴侶，剩下大部分沒有結(jié)合分子伴侶的蛋白質(zhì)更易錯誤折疊從而聚集；隨著分子伴侶濃度增加，更多的蛋白質(zhì)能夠在其幫助下正確折疊，從而降低錯誤折疊蛋白質(zhì)的比例。二是分子伴侶能夠解聚已經(jīng)聚集的蛋白質(zhì)。即通過解聚已經(jīng)存在于包涵體內(nèi)的蛋白質(zhì)聚集體，從而幫助恢復蛋白質(zhì)正確折疊。進一步的免疫共沉淀實驗結(jié)果指向前一種機理，即該融合蛋白的短疏水序列具有與DnaK 特異性結(jié)合的條件，并能夠與DnaK 形成穩(wěn)定復合物。因此，DnaK 通過直接與新生多肽相互作用，促進新合成蛋白質(zhì)的正確折疊以及組裝，從而產(chǎn)生更多具有活性的融合蛋白。

3.2 過量表達熱休克轉(zhuǎn)錄因子

盡管已經(jīng)有很多研究證明過量表達分子伴侶能夠幫助更多目標蛋白質(zhì)正確折疊，但這并非調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)組穩(wěn)定性的最佳解決辦法。首先，分子伴侶對底物具有一定的特異性，蛋白質(zhì)組的折疊需要多種分子伴侶協(xié)同作用。這往往需要大量的實驗來確定能夠作用于特定蛋白質(zhì)的分子伴侶組合；并且分子伴侶與目標蛋白同時過表達會因細胞內(nèi)代謝環(huán)境限制而相互影響，例如二者對于有限的RNA 聚合酶的競爭，或是目標蛋白轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的大量積累，可能會抑制分子伴侶的表達。因此，該方法需要篩選出最佳條件來優(yōu)化分子伴侶效應。其次，除了前面提到的直接過量表達質(zhì)粒編碼的分子伴侶，還可以通過增加細胞內(nèi)環(huán)境壓力，如升溫或化學誘導來間接實現(xiàn)分子伴侶的過量表達。但這種方法也很容易導致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)被破壞，從而造成細胞損傷甚至是凋亡。因此，人們想到了在維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的同時，通過過量表達負反饋缺陷型熱休克轉(zhuǎn)錄因子σ32來提高大腸桿菌內(nèi)重組蛋白的產(chǎn)量［90］。σ32能夠在細胞承受壓力時與核心RNA 聚合酶結(jié)合，從而誘導許多分子伴侶以及輔助因子以自然進化出特定的化學計量進行表達［91-92］。相比于單一的某個或多個分子伴侶的過表達，這種整體水平提升的方式不需要特別明確途徑中哪些代表性分子伴侶對目標蛋白質(zhì)有顯著的作用，使得同時增加多種正確折疊的蛋白質(zhì)成為可能。盡管已經(jīng)有工作嘗試過表達σ32來提升重組蛋白的產(chǎn)量，但是σ32會受到分子伴侶介導的負反饋途徑的影響，如細胞內(nèi)GroEL/GroES 水平的升高會降低σ32的活性，所以野生型σ32的作用只是短暫的。然而，Yura 等發(fā)現(xiàn)僅僅單位點的突變就可以在幾乎不改變σ32與RNA 聚合酶結(jié)合能力的同時突破負反饋調(diào)節(jié)的影響，從而實現(xiàn)σ32突變體的長效作用［93］。Zhang 等人將其中一個σ32突變體I54N 運用于優(yōu)化大腸桿菌重組目標蛋白的表達，即通過整體重塑或加強蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)網(wǎng)絡來最大限度地提高重組目標蛋白的數(shù)量和質(zhì)量［90］。σ32-I54N 的過表達使得細胞內(nèi)形成類似熱休克響應情況下的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡，并且除了熱休克響應相關的基因，絕大多數(shù)大腸桿菌蛋白質(zhì)組都沒有受到影響。兩種重組蛋白——逆醛縮酶（retro-aldolase，RA）和內(nèi)切木聚糖酶（endoxylanase，XynA），作為模型蛋白被用來研究σ32-I54N 表達的情況下增強的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)網(wǎng)絡對重組蛋白的影響。在正常情況下，這兩種模型蛋白主要在大腸桿菌內(nèi)形成包涵體；然而在增強的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)網(wǎng)絡中，兩種模型蛋白的溶解度分別提高了2 倍和3 倍。不僅如此，具有正常功能的模型蛋白數(shù)量也在增強的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)網(wǎng)絡中得到了不同程度的提升。這些結(jié)果表明σ32-I54N 表達不僅可以提升正確折疊蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，還能夠增加具有正常功能的蛋白質(zhì)數(shù)量。后面針對轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（transthyretin，TTR）A25T 突變體的實驗也進一步證實σ32-I54N 在重組蛋白質(zhì)過表達時的積極作用。這種方法有望被廣泛運用到不同體系實現(xiàn)不同重組蛋白過表達的優(yōu)化，尤其是具有復雜結(jié)構(gòu)的大分子量蛋白質(zhì)，為體外探究特定生化反應機理提供技術支持。

3.3 化學手段重塑胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊環(huán)境

除了過量表達，對分子伴侶的抑制有時也可以作為針對蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)被破壞的潛在治療手段，如抑制Hsp90。Hsp90 是一種在細胞中極為豐富的分子伴侶，在正常情況下約占細胞總蛋白質(zhì)數(shù)量的1%～2%，但在細胞應激時被過度表達，總占比提升至4%～6%。不僅如此，人們發(fā)現(xiàn)Hsp90 在幫助實現(xiàn)或維持關鍵致癌蛋白的活性構(gòu)象方面起到重要作用，這些蛋白質(zhì)在細胞中功能十分廣泛，從簡單的信號傳導、蛋白質(zhì)運輸，到染色質(zhì)重塑和細胞增殖［94-95］。目前，處于臨床評估的絕大多數(shù)Hsp90 抑制劑通過阻斷ATP 與Hsp90 N 端結(jié)構(gòu)域的結(jié)合起作用，從而誘導許多Hsp90依賴性致癌蛋白的降解［96-98］。與之類似，研究發(fā)現(xiàn)對HSF1（heat shock factor 1）的調(diào)控也能在一定程度上影響內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。除了正常的細胞生存和增殖進化，HSF1 還可以幫助細胞適應蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡導致的病理生理紊亂，從而引發(fā)惡性疾病［99］。Dai 等通過基因敲除證明HSF1 不僅促進小鼠體內(nèi)腫瘤的初步形成，還可能幫助具有潛在惡性缺陷的人類癌細胞的生長和存活［99］。因此，針對HSF1 相關轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡的抑制可以作為廣泛且有效治療癌癥的策略。截至目前，已經(jīng)有很多相關的抑制劑被接連報道，例如化合物KRIBB11 被發(fā)現(xiàn)可以通過與HSF1 直接作用或通過影響HSF1 下游靶蛋白的表達來抑制腫瘤的生長［100］；還有一種RNA 適體（RNA aptamer）被證實能夠阻止HSF1 與其靶基因結(jié)合，從而誘導細胞凋亡并避免了癌細胞的聚集［101］。Vilaboa 等報道了一例能夠直接靶向HSF1的小分子化合物IHSF115，該化合物能夠與分離的HSF1 DNA 結(jié) 合 域片段 結(jié) 合［102］。IHSF115 不 影響熱休克條件下HSF1 的寡聚化、細胞核定位以及與特定DNA 的結(jié)合。然而，免疫沉淀物的蛋白質(zhì)印跡分析顯示IHSF115 能夠干擾HSF1 與激活轉(zhuǎn)錄因子1（activating transcription factor 1， ATF1）之間的相互作用，從而影響HSF1 靶基因的熱誘導轉(zhuǎn)錄。實驗發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)情況下IHSF115 的存在抑制了受HSF1 控制的相關基因的表達，其中主要包括控制蛋白質(zhì)折疊的基因，如包涵體組裝的負調(diào)控、蛋白質(zhì)的重新折疊；還有一部分包括控制生物正常功能的基因，如對激素刺激的反應、骨骼肌分化、細胞生長的負調(diào)節(jié)等。不僅如此，實驗還發(fā)現(xiàn)IHSF115 能夠有效激活熱休克響應時HSF1 抑制的特定基因，如核小體的組裝、以DNA 為模板的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等?？傮w而言，IHSF115 能夠通過與HSF1 的相互作用影響其調(diào)控的靶基因，從而幫助重塑細胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊環(huán)境。

4 分子伴侶與定向進化

4.1 蛋白質(zhì)穩(wěn)定性是影響蛋白質(zhì)進化的重要因素

生物體內(nèi)絕大多數(shù)生理活動都離不開蛋白質(zhì)，例如：免疫蛋白參與機體防御機制［103-104］，多肽類激素參與調(diào)節(jié)細胞代謝［105-106］，以及酶參與底物的特異性催化［107-108］。蛋白質(zhì)穩(wěn)定性決定生物體內(nèi)生化反應是否能夠正常、持續(xù)進行，然而生物多樣性的形成離不開蛋白質(zhì)的進化。蛋白質(zhì)進化往往與基因突變和環(huán)境選擇有關。其中，基因突變與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性也有著密不可分的聯(lián)系，因此，人們猜測蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性影響蛋白質(zhì)的進化。圍繞這一猜想的關鍵問題是蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和可進化性如何相關，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的增強究竟是提升了可進化性還是降低了可進化性。

2005 年Drummond 等在使用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）探究高表達蛋白質(zhì)進化緩慢的機理時，提出蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的增強會延緩蛋白質(zhì)進化的假設［109］。他們認為高表達蛋白質(zhì)產(chǎn)生錯誤翻譯的可能性提高，導致其更容易發(fā)生錯誤折疊。而這些錯誤折疊的蛋白質(zhì)會在細胞內(nèi)聚集，喪失其功能并產(chǎn)生細胞毒性。為降低下游錯誤折疊蛋白質(zhì)產(chǎn)生的負面作用，細胞產(chǎn)生了相應機制，使得蛋白質(zhì)即使翻譯錯誤也能維持正常折疊，也就是提升對翻譯錯誤的容忍性，被稱為“翻譯穩(wěn)健性”（translational robustness）。適度增加蛋白質(zhì)熱力學穩(wěn)定性能夠增加對蛋白質(zhì)錯誤折疊的包容度。因此，在表達水平增加時，細胞內(nèi)壓力使得蛋白質(zhì)穩(wěn)定性增強，從而增強對蛋白質(zhì)突變或翻譯錯誤引起錯誤折疊的包容度，并減緩蛋白質(zhì)的進化。Bloom 等在2004 年利用一個簡單模型蛋白質(zhì)也得到類似的結(jié)論［110］。該模型蛋白質(zhì)僅有18 個氨基酸，可以自行折疊成二維晶體結(jié)構(gòu)，并能與特定配體結(jié)合。在五個不同溫度參數(shù)下對模型蛋白質(zhì)進行500代進化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在更高溫度參數(shù)下，即對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性強選擇的情況下，蛋白質(zhì)突變體與原配體結(jié)合能力降低。因此，他們認為具有低穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)才能更有效地進化配體結(jié)合功能。

然而就在兩年后，Bloom 等修正了之前的理論，并認為具有較高穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)才能增加有益變異的可能性［111］。同之前一樣，他們利用類似的模型蛋白質(zhì)來探究蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和可進化性的關系。但與之前不同的是，本次實驗引入了新的篩選機制，即增加了4種新配體。首先，他們發(fā)現(xiàn)折疊更穩(wěn)定的蛋白質(zhì)能容納更多的突變體。與天然蛋白質(zhì)相似，原始親本蛋白僅具有邊緣穩(wěn)定性（?Gf= -0.5 kcal/mol）。通過兩輪隨機誘變篩選出的突變體——穩(wěn)定親本蛋白對同種配體有相同的結(jié)合力度，卻更加穩(wěn)定（?Gf= -1.5 kcal/mol）［圖5（a）］。其中，兩種模型蛋白質(zhì)折疊自由能的差值可被視為穩(wěn)定親本蛋白具有的額外穩(wěn)定性。同原始親本蛋白相比，穩(wěn)定親本蛋白能夠產(chǎn)生更多數(shù)量的正常折疊的突變體，這證實了更穩(wěn)定的蛋白質(zhì)對突變的包容度更大。同時他們還發(fā)現(xiàn)，提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性可以增加有益變異的可能性。例如，盡管絕大多數(shù)穩(wěn)定親本蛋白的改良突變體穩(wěn)定性都有所下降，但多個改良突變體與4種新配體的結(jié)合力度增強［圖5（a）、（b）］，初步證實了穩(wěn)定性更好的蛋白質(zhì)可進化性也更高。為了進一步驗證這一結(jié)論，他們對細胞色素P450 BM3 血紅素結(jié)構(gòu)域（heme domain）的兩種突變體21B3 和5H6進行隨機突變，并篩選出它們在抗炎藥萘普生（naproxen）、3-苯氧基甲苯、苯氧乙酸、β-腎上腺素受體阻滯劑普萘洛爾（propranolol）和2-甲基苯并呋喃5種底物上功能改進的突變體。21B3和5H6這兩種突變體均可催化12-對硝基苯氧基羧酸的羥基化反應，且對5 種底物的催化活性也基本一致。但相比于21B3，5H6 熱穩(wěn)定性更強，穩(wěn)定性的增強提升了5H6 產(chǎn)生的功能改進的突變體數(shù)量（從4個到13個），進一步證實了穩(wěn)定的蛋白質(zhì)具有更大的進化潛力［圖5（c）、（d）］。

圖5 穩(wěn)定性的增加增強了模型晶格蛋白和P450 BM3血紅素結(jié)構(gòu)域的可進化性［111］Fig.5 Increased stability enhances evolvability of model lattice protein and P450 BM3 heme domain[111]

Bloom 等前后兩次實驗得到完全相反的結(jié)論，主要原因在于實驗方法的不同。首先，前一次實驗主要通過強選擇得到穩(wěn)定性相同的蛋白質(zhì)突變體；后一次實驗主要通過對兩種具有不同穩(wěn)定性的模型蛋白質(zhì)進行隨機突變。更為重要的是，前一次的實驗僅關注于突變體與原配體的結(jié)合力度，限制了研究對象；而后一次實驗注重于突變體與5 種新配體的結(jié)合力度，更能夠體現(xiàn)出突變體改進的功能，即進化。因此，從實驗方案的合理性上看，后者得到的結(jié)論更為可靠，即更穩(wěn)定的蛋白質(zhì)對突變更穩(wěn)健，從而能夠積累一定程度的突變，增加進化的可能性。

Zheng 等用黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）的例子同樣證明了增強蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有利于蛋白質(zhì)的進化［112］。在實驗的第一階段，他們首先對具有黃色熒光表型的祖先種群進行不同強度的選擇，即強選擇（種群S）、弱選擇（種群W）或不選擇（種群N）。結(jié)果顯示強選擇進化出的種群S相比于其他兩種選擇顯示出更好的熱力學穩(wěn)定性。為了了解強進化種群對突變的包容程度，他們接著對前面不同選擇強度下進化出的種群進行隨機誘變。對比實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)種群S產(chǎn)生了更多保持黃色熒光的突變體，說明穩(wěn)定性的提高增強了原始黃色熒光表型的突變穩(wěn)健性。在實驗的第二階段，他們在相同的選擇壓力下將種群向具有綠色熒光的新表型進行定向進化。結(jié)果顯示種群S最快產(chǎn)生適應性進化，并且進一步的研究發(fā)現(xiàn)種群S氨基酸變化數(shù)量和遺傳多樣性方面的增加均大于種群W 和N。因此，該實驗說明了強選擇條件下穩(wěn)定性的增強提高了突變穩(wěn)健性，從而有助于增加遺傳多樣性。與此同時，這個結(jié)論也證實了達爾文的進化論，即在通過強選擇增加種群進化潛力的情況下，面對氣候變化等環(huán)境挑戰(zhàn)時種群的進化拯救可能會更容易。

區(qū)別于天然蛋白質(zhì)僅有單一折疊狀態(tài)（即能量最低態(tài)）的傳統(tǒng)觀點，還有其他觀點認為許多天然蛋白質(zhì)存在多個折疊形態(tài)，是一種多構(gòu)象的集合（native state ensemble）［113］。蛋白質(zhì)的功能與這個集合中的折疊形態(tài)一一對應。由于這些折疊狀態(tài)能量相同或者近似，蛋白質(zhì)可以在不同折疊狀態(tài)間切換。Tawfik等認為這些折疊狀態(tài)的多樣性是蛋白質(zhì)進化的重要基礎，并探究了關鍵位置突變對于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和進化性的影響［114］。他們發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)關鍵位置的突變會打破多構(gòu)象的相近折疊能分布，產(chǎn)生一個或幾個熱力學更加穩(wěn)定的優(yōu)勢構(gòu)象，這些新構(gòu)象為新功能的產(chǎn)生提供了結(jié)構(gòu)基礎，并在自然選擇下發(fā)生進化。Kamerlin等的工作也通過計算的手段詳述了蛋白質(zhì)復雜構(gòu)象動力學（conformational dynamics）對于其可進化性的重要意義［115］。Sun等于近期發(fā)表的工作運用實驗與計算相結(jié)合的手段，創(chuàng)新性開發(fā)了鋅依賴性乙醇脫氫酶（zinc-dependent alcohol dehydrogenase fromThermoanaerobacter brockii，TbSADH）定向進化的方法［116］。TbSADH 存在著一段結(jié)構(gòu)靈活的底物結(jié)合位點區(qū)域，野生型的TbSADH 依靠這一區(qū)域產(chǎn)生復雜的構(gòu)象動力學行為。該區(qū)域由9個氨基酸組成，其與底物相互作用關鍵的殘基是第84 位的脯氨酸（P84）。作者通過對P84進行大規(guī)模的突變篩選，改變了原有酶活性位點的大小與底物手性識別能力，并進化出具有可容納新底物、對底物具有手性選擇性的新突變。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)定向進化領域側(cè)重于在蛋白質(zhì)不改變天然結(jié)構(gòu)的情況下進行探討，而這些工作提出的新觀點，即蛋白質(zhì)通過突變定向進化出具有新功能的新構(gòu)象，極大地豐富了蛋白質(zhì)定向進化領域的認知。

無論是Drummond 等認為的“翻譯穩(wěn)健性”，還是Bloom、Zheng 等提出的“蛋白質(zhì)增強的穩(wěn)定性更加包容突變”，都強調(diào)了蛋白質(zhì)穩(wěn)定性對蛋白質(zhì)進化的重要影響，卻得到完全不同的結(jié)論。其中的主要原因在于實驗條件的選擇。達爾文進化論肯定了基因突變和自然選擇在物種進化上的重要影響，蛋白質(zhì)進化同樣也離不開這兩個重要因素。Drummond 等并沒有考慮“條件選擇”這一因素；不僅如此，他們也沒有意識到蛋白質(zhì)高表達時細胞面對壓力產(chǎn)生的質(zhì)量調(diào)控機制，將實驗條件過分簡化，從而得到相反的結(jié)論。天然蛋白質(zhì)的邊緣穩(wěn)定性在一定程度上限制了進化，但是“邊緣穩(wěn)定”并不代表“不穩(wěn)定”；恰恰相反，“邊緣穩(wěn)定”維護了生物系統(tǒng)的整體穩(wěn)定性。例如，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的突變體都會比“邊緣穩(wěn)定”的野生型更加不穩(wěn)定，進而很快就會被淘汰，這在一定程度上維持了蛋白質(zhì)性質(zhì)和功能的穩(wěn)定性；蛋白質(zhì)的降解也變得更加容易，因為細胞不需要花費過多能量去強制展開過度穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，從而有利于維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。辯證性地看待蛋白質(zhì)穩(wěn)定性與進化的關系能夠更好地幫助我們理解大自然的進化規(guī)律，同時深化對疾病或癌癥的機理性研究，促進藥物開發(fā)以及做到提前預防。

4.2 分子伴侶協(xié)助蛋白質(zhì)定向進化

除了幫助蛋白質(zhì)折疊，分子伴侶還可以作為不穩(wěn)定突變的緩沖系統(tǒng)，促進遺傳的多樣性和加快適應速度。Tokuriki 等在2009 年發(fā)現(xiàn)Hsp60/Hsp40分子伴侶系統(tǒng)可以協(xié)助不穩(wěn)定酶突變體的折疊，從而促進酶進化［117］。其中，他們主要探究大腸桿菌內(nèi)GroEL/GroES 對于攜帶改變或改進酶功能的突變體的作用。在對4種GroEL/GroES依賴性不同的酶進行隨機突變漂移（random mutational drifts）后，他們發(fā)現(xiàn)GroEL/GroES 過表達的情況下，依賴于GroEL/GroES 的酶產(chǎn)生了更多正常折疊且具有催化活性的突變體。在對這些突變體序列進行比對后發(fā)現(xiàn)，依賴于GroEL/GroES 的酶能夠承受更多在核心區(qū)域的殘基替代。相比于蛋白質(zhì)表面，在蛋白質(zhì)內(nèi)部核心區(qū)域發(fā)生的殘基替代更有可能導致蛋白質(zhì)錯誤折疊，這也解釋了依賴于GroEL/GroES 的酶突變體平均穩(wěn)定性更低的原因。因此，GroEL/GroES可能在與蛋白質(zhì)相互作用過程中緩沖了突變帶來的不穩(wěn)定性。不僅如此，他們還發(fā)現(xiàn)在GroEL/GroES 過表達情況下，適應突變體改進的特異性和活性是沒有過表達情況下的至少10 倍，說明分子伴侶的存在更有利于有益變異的產(chǎn)生?？偟膩碚f，GroEL/GroES的過表達可以顯著增加具有改進功能或新功能的酶突變體的數(shù)量和倍數(shù)，是分子伴侶協(xié)助蛋白質(zhì)定向進化的有力證據(jù)。

2018 年Phillips 等發(fā)現(xiàn)分子伴侶能夠促進流感核 蛋 白（nucleoprotein， NP） 產(chǎn) 生 適 應 性 突變［118］。他們采用化學誘導HSF1 抑制劑的方法降低細胞溶質(zhì)分子伴侶水平，并結(jié)合深度突變掃描探究單個氨基酸的取代在宿主細胞缺失分子伴侶情況下的適應性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在細胞處于類似發(fā)熱溫度（39°C）時，絕大多數(shù)NP突變體在沒有分子伴侶的條件下適應性降低，只有幾個特定位點氨基酸的取代顯著升高了NP 的適應性。其中，位點283 的脯氨酸對于人類抗病毒限制因子MxA（myxovirus resistance protein A）免疫系統(tǒng)逃逸有很大貢獻，而其他氨基酸如甲硫氨酸和丙氨酸在該位點的取代使得NP 變體在沒有分子伴侶的情況下相比于野生型更穩(wěn)定。進一步研究發(fā)現(xiàn)脯氨酸在這個位點的取代降低了282～284 位點α-螺旋含量，導致Pro283 NP 變體結(jié)構(gòu)更加不穩(wěn)定，且更容易聚集。這種不穩(wěn)定性在環(huán)境溫度升高且沒有分子伴侶的情況下更為明顯，說明分子伴侶可以幫助調(diào)節(jié)流感中免疫逃逸突變體的適應性。除了流感核蛋白，他們還研究了宿主細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶對分泌途徑蛋白突變的影響。同樣的，他們發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶能夠影響流感血凝素（hemaggluttinin，HA）對突變的耐受程度［119］。當環(huán)境溫度升高時，許多HA 變體變得不穩(wěn)定，從而數(shù)量急劇降低。但是在XBP1s 或是ATF6f/XBP1s存在的情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶水平上升，并幫助這些不穩(wěn)定HA 變體正確折疊。這些工作指出了分子伴侶在協(xié)助蛋白質(zhì)定向進化中的重要作用，為抗病毒藥物的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

除了前面提到的蛋白質(zhì)類分子伴侶外，人們發(fā)現(xiàn)化學伴侶（chemical chaperone）也可以幫助體內(nèi)蛋白質(zhì)進化?；瘜W伴侶是一類能夠影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的小分子，主要被分為滲透液、疏水化合物和藥理伴侶。Bandyopadhyay 等在研究滲透液對蛋白質(zhì)突變的緩沖能力時，發(fā)現(xiàn)細胞的化學環(huán)境可能改變細胞內(nèi)特定蛋白質(zhì)突變體折疊的途徑［120］。首先，他們采用模型滲透液三甲胺正氧化物（trimethylamineN-oxide，TMAO）來研究滲透液是否能通過幫助蛋白質(zhì)折疊來緩沖遺傳變異。TMAO 是一種膽堿、甜菜堿和肉堿通過腸道微生物代謝產(chǎn)生的小分子［121］。在研究TMAO 對野生型麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose binding protein， MBP）及其突變體折疊速率的影響時發(fā)現(xiàn)，MPB 僅單位點氨基酸的取代就可大幅提高蛋白質(zhì)折疊對TMAO 的依賴程度，進而提升蛋白質(zhì)在滲透液中的折疊速率。這些MBP 突變體與野生型具有類似的天然構(gòu)型，說明TMAO 的輔助功能可能主要由蛋白質(zhì)的折疊途徑?jīng)Q定。為了驗證這一假設，他們通過引入甘氨酸增加蛋白質(zhì)鏈的靈活性，并從實驗中發(fā)現(xiàn)TMAO 能夠特異地緩沖導致蛋白質(zhì)折疊途徑中柔性驅(qū)動陷阱（flexibility-driven traps）的突變，而非通過產(chǎn)生其他分子伴侶來作用。不僅如此，在通過對5000 個單位點突變體的篩選后發(fā)現(xiàn)，不同的滲透液對不同突變的緩沖能力也不盡相同，主要體現(xiàn)在不同的滲透液能夠獨特地緩沖不同的突變區(qū)間。例如，TMAO 允許在蛋白質(zhì)高度保守且容易導致聚集的區(qū)域進行替換；而脯氨酸允許在蛋白質(zhì)表面且不易導致聚集的區(qū)域進行替換。這表明不同的滲透液可能以不同的方式驅(qū)動蛋白質(zhì)進化，主要基于化學伴侶在蛋白質(zhì)折疊途徑上的不同作用機制。因此，研究化學伴侶對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊以及特殊變異的緩沖，不僅為探究蛋白質(zhì)穩(wěn)定性與可進化性關系提供多維線索，還能夠從化學小分子層面探測影響蛋白質(zhì)構(gòu)效關系的決定性因素。

4.3 分子伴侶自身的定向進化

通常來講，分子伴侶的普遍性使得分子伴侶在自然進化過程中會高度保守，因為一旦發(fā)生變異就很有可能喪失掉相應的功能，從而不被保留下來。其中，Hsp70就是這樣一個進化保守的分子伴侶。不管在原核生物還是真核生物細胞內(nèi)，Hsp70家族有超過一半的相似氨基酸序列。然而并非所有分子伴侶都是這樣。比如Hsp40家族，它們僅僅只有一個結(jié)構(gòu)域J 是相似的，而且就是通過這個結(jié)構(gòu)域刺激ATP 酶活性幫助Hsp70 折疊蛋白質(zhì)［85］。J 結(jié)構(gòu)域包含70 個氨基酸殘基，由四個螺旋以及螺旋Ⅱ和Ⅲ之間的環(huán)區(qū)組成［122］。人們發(fā)現(xiàn)，在生物體內(nèi)，Hsp40 的種類數(shù)量遠多于Hsp70。例如，在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了6 種DnaJ 的同系物［123］；在惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum）中，至少發(fā)現(xiàn)了10 種DnaJ 相關的蛋白質(zhì)［124］；而在人類蛋白質(zhì)組中，也有140 種蛋白質(zhì)與DnaJ 相關。不僅如此，不同的DnaJ 蛋白也進化出了不一樣的功能。例如，在酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)現(xiàn)了3種DnaJ的同系物，每一種都專門用于調(diào)節(jié)酵母內(nèi)Hsp70的同系物——Kar2的不同功能。其中Sec63是一種重要的跨膜蛋白，可幫助Kar2 將新生蛋白轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，Scj1 可以幫助Kar2 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中折疊和組裝蛋白質(zhì)，而Jem1 主要通過與Kar2p 相互作用，在核膜融合中發(fā)揮重要作用［125-127］。由此可見，在不同條件下，底物蛋白質(zhì)的進化也能夠刺激分子伴侶的進化，以提升其對底物蛋白質(zhì)的特異性，為物種多樣性奠定了基礎。

認識到分子伴侶在蛋白質(zhì)折疊以及進化過程中起到的重要作用后，人們想到可以通過定向進化已知分子伴侶來優(yōu)化其功能。Wang 等早在2002年就發(fā)現(xiàn)可以通過定向進化GroEL/GroES 優(yōu)化其對特定底物的折疊效率［128］。首先，他們使用多輪體內(nèi)篩選和體外DNA 改組，篩選出能夠顯著提高綠色熒光蛋白（green fluorescent protein， GFP）折疊能力的GroEL/GroES 突變體。在對突變體序列進行分析后發(fā)現(xiàn)，突變主要集中在負責與ATP酶結(jié)合的區(qū)域。ATP的結(jié)合與水解為GroEL/GroES折疊循環(huán)提供動力，同時也與GroEL 功能構(gòu)象變化有關。實驗分析表明，ATP結(jié)合區(qū)域的突變顯著提高ATP 酶的催化活性。不僅如此，他們還發(fā)現(xiàn)GroES突變體帶電氨基酸殘基增多。作為折疊腔的蓋子，GroES靜電環(huán)境的改變降低了折疊腔內(nèi)部的疏水性。因此，他們推測GroEL/GroES 突變體這兩個方面的改變顯著提升了GFP 的折疊效率，即GroEL/GroES在底物范圍方面具有可塑性。然而有趣的是，在GroEL/GroES 變體提升對GFP 的折疊效率時，對其他種類蛋白質(zhì)如HrcA 的折疊效率卻降低，揭示出分子伴侶特異性和普遍性可能的內(nèi)在沖突。這種沖突說明了分子伴侶能夠根據(jù)特定底物的性質(zhì)產(chǎn)生進化，從而為探究分子伴侶與底物相互作用機制、底物對分子伴侶進化的影響提供理論支持。

分子伴侶的定向進化也為治療由蛋白質(zhì)錯誤折疊引起的幾種常見神經(jīng)退行性疾病提供了新思路。受到酵母（yeast）中Hsp104 對朊病毒嚴格調(diào)控的啟發(fā)，Jackrel 等在2015 年報道了Hsp104 的增強突變體，該突變體可被用于有效解聚與肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）和帕金森病相關的錯誤折疊蛋白質(zhì)［129］。野生型Hsp104 對人類神經(jīng)退行性疾病相關蛋白質(zhì)沒有明顯的解聚效果。然而，通過對Hsp104 不同結(jié)構(gòu)域的隨機變異，他們發(fā)現(xiàn)中部的螺形線圈結(jié)構(gòu)域的突變能夠明顯增強Hsp104 對TDP-43、FUS 以及αsynuclein 在酵母中有毒聚集體形成的抑制。值得注意的是，只需要將Hsp104 第503 位的丙氨酸突變成任意氨基酸（脯氨酸除外），該突變體就能夠降低上述蛋白質(zhì)在酵母中的毒性。除此之外，Hsp104 突變體增強的抑制作用并不來自于對蛋白質(zhì)質(zhì)量控制體系的激活，如自噬或泛素-蛋白酶體系統(tǒng)；而是作為遺傳抑制因子根除蛋白質(zhì)聚集體，同時加速底物的易位。進一步對Hsp104 突變體作用機制進行探究后，發(fā)現(xiàn)與野生型不同的是，這些功能增強的突變體并不需要Hsp70/Hsp40 的協(xié)助；而對Hsp70/Hsp40 的依賴只會妨礙其抑制作用。Hsp104 增強突變體的獨立性有望被運用到不同生物體系，幫助優(yōu)化不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的過量表達，并進一步開發(fā)專門針對特定一種或多種蛋白質(zhì)的增強變體，以最大限度減少脫靶效應，從而開發(fā)出高效率治療劑。

5 總結(jié)與展望

生物體的正常運行離不開蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，生物的多樣性離不開蛋白質(zhì)的可進化性。天然蛋白質(zhì)正常折疊時并非處于其最穩(wěn)定狀態(tài)，因為多數(shù)天然蛋白質(zhì)能夠在保持甚至提高功能的同時得到穩(wěn)定性增強的突變體。蛋白質(zhì)的折疊自由能為-10 kcal/mol 左右，僅具有邊緣穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)組的穩(wěn)定性取決于蛋白質(zhì)組中折疊不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，因而也具有邊緣穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)的進化往往離不開一級結(jié)構(gòu)上的關鍵氨基酸突變。絕大多數(shù)突變，甚至是可能導致新功能的突變都會在蛋白質(zhì)邊緣穩(wěn)定的基礎上進一步降低其穩(wěn)定性。這些不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)突變體很容易被細胞質(zhì)量調(diào)控網(wǎng)絡清除，從而不再具有進化的可能性。因此，蛋白質(zhì)的邊緣穩(wěn)定性限制了蛋白質(zhì)的進化。為了突破這個限制，科學家們想到了從源頭上解決問題——調(diào)控蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的增加提升了其對突變的包容度，即能夠在產(chǎn)生更多突變時仍正確折疊，從而在功能不損傷的情況下積累一定的有益突變。其實，積累有益突變的過程就是在進化。從許多實驗室定向進化得到的具有增強或更新功能的突變體來看，往往少數(shù)的突變，甚至是一個位點的突變，就能夠部分或完全改變蛋白質(zhì)的功能。分子伴侶除了可以幫助蛋白質(zhì)折疊、展開錯誤折疊的蛋白質(zhì)，還作為緩沖系統(tǒng)幫助蛋白質(zhì)積累一定的突變，從而幫助蛋白質(zhì)進化。同樣作為蛋白質(zhì)的分子伴侶也能夠進化。在實驗室中，分子伴侶能夠通過定向進化來優(yōu)化其折疊功能，或用作疾病相關易聚集蛋白質(zhì)的解聚劑。自然界中的分子伴侶在不同生物體內(nèi)，甚至是同種生物不同細胞器內(nèi)也進化出功能相似或完全不同的同源物，為物種多樣性提供物質(zhì)基礎。因此，分子伴侶和蛋白質(zhì)的進化是相輔相成的：分子伴侶可以幫助蛋白質(zhì)進化，而蛋白質(zhì)的進化也需要分子伴侶產(chǎn)生相應改變來適應進化的蛋白質(zhì)。希望在不久的將來，我們能夠利用更為豐富的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫以及更精密的計算模型系統(tǒng)地探索分子伴侶與蛋白質(zhì)進化的相互作用關系，從而為模擬自然界生物進化提供更為堅實的理論基礎。作為影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定和進化的重要分子機器，分子伴侶不僅在基礎生物學研究領域，還在生物工程和生物醫(yī)藥等領域都彰顯出不可小覷的實力。其中，定向進化分子伴侶抑制細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的聚集為治療相關神經(jīng)退行性疾病提供了新方向。相比于以往的小分子藥物，分子伴侶更易生產(chǎn)、可操控性高且生物相容性好，有望作為預防和治療蛋白質(zhì)錯誤折疊相關疾病的重要手段。