慢性腎病相關(guān)性瘙癢癥的動物模型研究進(jìn)展

韓壤樂，胡瓊丹，2，王麗*

(1. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心，四川 瀘州 646000；2. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川瀘州 646000)

相關(guān)研究表明，CKD-aP 與皮膚干燥、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)、血漿組胺水平增高、皮膚中二價陽離子濃度增高、周圍神經(jīng)病變、促炎細(xì)胞因子升高、免疫功能障礙及內(nèi)源性阿片類激素失衡相關(guān)[1]。 但有研究表明，組胺受體拮抗劑及肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑對CKD-aP 患者的止癢效果并不明顯[2]。 雖然，甲狀旁腺切除術(shù)可減輕繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)患者的瘙癢[3]，但關(guān)于磷和甲狀旁腺激素等常見臨床實驗室參數(shù)的證據(jù)也相互矛盾[4]。 故CKD-aP的發(fā)病機(jī)制至今尚不完全清楚，并且缺乏公認(rèn)有效的手段緩解及消除瘙癢，因此建立可靠、有效的CKD-aP 動物模型至關(guān)重要，以下就近年來的CKD-aP 相關(guān)的動物模型展開論述。

1 皮內(nèi)注射誘導(dǎo)模型

1.1 磷酸鈣皮膚沉積模型

相關(guān)臨床研究表明，尿毒癥患者口服的碳酸鈣或醋酸鈣將通過皮膚內(nèi)沉積促進(jìn)瘙癢，并在表皮層中產(chǎn)生對瘙癢的周圍敏感性[5]。 為了模擬透析患者的磷酸鈣(CaP)皮膚沉積，Keshari 等[6]將CaP 溶解于雙蒸水中，通過多次皮內(nèi)注射5 mg/mL 的CaP至ICR 小鼠的背部皮膚中以誘發(fā)慢性瘙癢，同時通過計算后爪搔抓注射部位的次數(shù)來評估小鼠對CaP的反應(yīng)。 由此驗證了CaP 皮內(nèi)沉積誘導(dǎo)的瘙癢中的信號傳導(dǎo)通路為白介素6-磷酸化布魯頓酪氨酸激酶-磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(IL-6/p-BTK/p-ERK)[6]。 皮內(nèi)注射CaP 導(dǎo)致小鼠輕度至重度瘙癢呈現(xiàn)為劑量依賴性。 目前在 ICR、C57BL/6 和C57BL/6 野生型(WT)小鼠品系中均已成功制造出CaP 皮膚沉積模型。 盡管此模型模擬出皮膚內(nèi)鈣離子沉積，且表現(xiàn)出與透析患者相同的皮膚瘙癢，為人類對CKD-aP 的機(jī)制及CaP 沉積誘導(dǎo)的瘙癢信號傳導(dǎo)的研究提供了較理想的實驗?zāi)Ｐ停搫游锬Ｐ蛢H模擬了CKD-aP 皮膚CaP 的沉積，與人的CKD-aP 發(fā)病機(jī)制并不完全一致。

1.2 β2-微球蛋白誘發(fā)小鼠瘙癢模型

β2-微球蛋白是體內(nèi)有核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、血小板、多形核白細(xì)胞產(chǎn)生的一種小分子球蛋白。相關(guān)研究表明，β2-微球蛋白水平在透析患者的血漿中明顯升高[7]，且皮膚組織中的β2-微球蛋白會隨著透析時間延長而增加[8]。 在 5/6 腎切除術(shù)NPCT 小鼠的皮膚中也明顯增加[9]。 Andoh 等[10]先將4 ～8 周雄性ICR 小鼠的頸背部毛發(fā)剔除，隨后在頸背部皮內(nèi)注射50 μL β2-微球蛋白可觀察到小鼠搔抓行為。 研究表明，通過β2-微球蛋白誘導(dǎo)的小鼠的搔抓行為呈現(xiàn)劑量依賴性，且可通過TRPV1表達(dá)的初級感覺神經(jīng)元引起瘙癢相關(guān)的反應(yīng)[10]。雖然目前使用該動物模型的研究較少，可供參考的具體實驗經(jīng)驗匱乏，但該造模方法簡便，造模周期短，成功率較高，動物死亡率低，可為透析患者瘙癢癥的發(fā)病及治療研究提供較好的實驗動物模型。

1.3 組胺誘發(fā)小鼠瘙癢模型

組胺存在于肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞內(nèi)，是介導(dǎo)瘙癢的重要的物質(zhì)之一。 Stockenhuber 等[11]通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，與沒有瘙癢的透析患者相比:瘙癢患者的血漿組胺水平明顯升高。 推測組胺水平的增高與尿毒癥患者皮膚柱狀細(xì)胞數(shù)量增加有關(guān)。具體造模方法為:首先剔除小鼠頸背部毛發(fā)， 暴露約2 cm × 2 cm 皮膚，然后再在小鼠的脫毛部位皮下注射組胺。 組胺在小鼠中引起的搔抓行為為計量依賴性[12]。 相對于其他品系的小鼠，ICR 小鼠對組胺引起瘙癢更為敏感[13]。 在使用相同劑量的組胺時，D75 小鼠比 D45 小鼠搔抓時間更長，由此推測不同年齡組的小鼠對組胺誘導(dǎo)的瘙癢感存在不同的感知水平[14]。 但此模型的瘙癢持續(xù)時間過短，故多用于急性瘙癢動物模型。 盡管抗組胺藥物可在一定程度上緩解CKD-aP 患者瘙癢，但相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)CKD-aP 與血漿組胺濃度并無相關(guān)性[15]。

1.4 磷酸氯喹誘發(fā)小鼠瘙癢模型

磷酸氯喹(CQ)是一種抗瘧藥，已知對人和動物有瘙癢的副作用。 CQ 通過其對分子受體Mas 相關(guān)G 蛋白偶聯(lián)受體C11(MrgprC11)的作用引起嚴(yán)重瘙癢[16]，這與組胺誘發(fā)的瘙癢中涉及的組胺H1 和H4受體不同。 該模型常用于誘導(dǎo)非組胺依賴型瘙癢。Aman 等[17]將CQ 稀釋至生理鹽水中(3.2 mg/mL)，并以32 mg/Kg 的劑量注射到雌性BALB/c 小鼠皮下誘發(fā)瘙癢。 研究表明，在治療人類瘧疾過程中發(fā)現(xiàn)氯喹導(dǎo)致瘙癢的嚴(yán)重程度與患者年齡呈正相關(guān)，即老年患者比年輕患者瘙癢更頻繁、更嚴(yán)重[18]，但這一觀點尚未在動物實驗中得到證實。 CQ 誘發(fā)的瘙癢和慢性腎病相關(guān)性瘙癢均有內(nèi)源性阿片類受體參與[19]，由此猜測兩者間有共同的病理生理機(jī)制。 但氯喹所致瘙癢是一種急性瘙癢，通常僅能維持 2 ～ 7 d。

2 物理介導(dǎo)

CKD 患者通常伴有皮膚干燥的現(xiàn)象，且皮膚干燥與瘙癢的發(fā)生率存在顯著的相關(guān)性[20]。 2002 年Miyamoto 等[21]首 次 采 用 丙 酮/乙 醚 - 蒸 餾 水(acetone-ether-water，AEW)貫序涂抹法制備小鼠皮膚干燥癥瘙癢模型。 在造模3 d 前需將ICR 小鼠背脊部毛發(fā)剔除，隨后將丙酮和乙醚(1 ∶1)的混合物涂抹于ICR 小鼠背脊部已脫毛的特定區(qū)域(約15 mm × 15 mm)15 s，然后立即用蒸餾水浸泡 30 s，每天2 次，共8 d。 丙酮/乙醚可有效破壞皮膚的脂質(zhì)屏障，蒸餾水浸泡可使水分隨著有機(jī)溶劑的揮發(fā)進(jìn)一步減少，從而模擬人類皮膚干燥癥瘙癢。 相對于其他品系的小鼠，C57BL/6 小鼠更易誘發(fā)出搔抓行為[22]。 根據(jù)相關(guān)研究報道，使用AEW 處理后的小鼠搔抓行為至少會持續(xù)2 周[23]，當(dāng)經(jīng)AEW 處理后皮膚出現(xiàn)角化過度、表皮明顯增厚時即提示干性皮膚瘙癢模型造模成功[22]。 Miyamoto 等[21]分別將阿片類受體拮抗劑納洛酮和納曲酮皮下注射于AEW處理5 d 的ICR 小鼠后發(fā)現(xiàn)其自發(fā)性搔抓明顯減少，由此證實了AEW 小鼠的抓撓是由瘙癢導(dǎo)致的。目前皮膚干燥癥瘙癢的機(jī)制尚不完全清楚。 研究表明，AEW 使缺乏肥大細(xì)胞小鼠和正常小鼠均增加了自發(fā)抓撓，由此認(rèn)為肥大細(xì)胞可能并不參與AEW處理后的自發(fā)性瘙癢[21]，這與臨床觀察中，H1 組胺受體拮抗劑通常對皮膚干燥癥瘙癢無效一致。 使用AEW 貫序涂抹法能高效地制造慢性皮膚干燥癥瘙癢模型，雖然該造模方法較為繁瑣，但實驗藥品易獲得，成功率高，可為慢性皮膚干燥癥瘙癢癥的發(fā)病及治療研究提供較好的疾病動物模型。

3 自發(fā)病變

3.1 ICR 源性腎小球腎炎小鼠模型(ICGN 小鼠)

ICGN 小鼠是一種涉及張力蛋白2 基因突變并具有遺傳性腎病綜合征的近交系小鼠[24]，因其在幼年時表現(xiàn)出蛋白尿，隨后出現(xiàn)低蛋白血癥、高脂血癥、貧血和全身水腫[25]，所以是研究特發(fā)性腎病綜合征的良好模型。 Miyamoto 等[26]發(fā)現(xiàn)，ICGN 小鼠在21 周或27 周時即可出現(xiàn)持續(xù)或間歇性搔抓，伴隨部分小鼠肌酐明顯升高，故考慮ICGN 小鼠的搔抓行為也許與腎功能障礙相關(guān)。 由此認(rèn)為小鼠肌酐升高是ICGN 小鼠瘙癢模型成功的關(guān)鍵。 相關(guān)研究表明，雄性ICGN 小鼠的肌酐值升高得更為顯著[27]。 ICGN 小鼠在后期可出現(xiàn)促紅細(xì)胞生成素代謝紊亂、腎性貧血、腎間質(zhì)纖維化等與人類慢性腎病相似的病理表現(xiàn)[28]。 該模型造模時間較長，產(chǎn)生搔抓行為具有一定不確定性，且到目前為止無關(guān)于使用ICGN 小鼠瘙癢的研究報告，故該模型應(yīng)用于CKD-aP 的研究還應(yīng)開展進(jìn)一步研究。

3.2 MRL/lpr 小鼠瘙癢模型

MRL/lpr 小鼠是攜帶Fas 缺失突變基因lpr 的MRL/Mp 小鼠[29]，能自發(fā)地發(fā)展出各種自身免疫性疾病，包括腎小球腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多動脈炎、關(guān)節(jié)炎和唾液腺炎等[30]。 常用于研究類似于人類狼瘡性腎炎的免疫復(fù)合物腎小球腎炎。 Umeuchi等[31]發(fā)現(xiàn)18 ～20 周的 MRL/lpr 小鼠在無病原體環(huán)境中有自發(fā)持續(xù)搔抓行為，由此猜測，此類抓撓行為與人類自身免疫性疾病相關(guān)瘙癢類似。 其搔抓行為會隨著小鼠年齡的增長而增加。 MRL/lpr 小鼠中出現(xiàn)IgG3 抗體是導(dǎo)致自發(fā)性腎小球破壞和功能障礙原因之一[32]。 此模型的優(yōu)勢在于演繹了慢性腎病相關(guān)性瘙癢癥的免疫機(jī)制，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 CKD-aP 動物模型中搔抓行為的評估

人類感受到瘙癢刺激時會引起兩種反應(yīng)，一種是與感覺有關(guān)，如用語言表達(dá)出“我感覺到了輕微的瘙癢”，另一種是對瘙癢的反應(yīng)，即用動作來緩解或消除瘙癢(例如抓撓)。 因此，癢通常被定義為一種令人不快的感覺，并引起抓撓的欲望[33]。 梳理毛發(fā)是小鼠用于清潔皮膚或皮毛的常見行為，其動作常常與搔抓反應(yīng)非常相似(見圖1A)。 同時，不同種類的動物、性別及誘導(dǎo)瘙癢介質(zhì)的劑量均對動物的搔抓反應(yīng)具有不同影響[34]。 如Klein 等[35]發(fā)現(xiàn)，在SD 大鼠的頸背部注射組胺后并未引起明顯的后肢抓撓。 在SLIGRL-NH2 誘導(dǎo)的瘙癢中，雌性小鼠的抓撓次數(shù)明顯高于雄性小鼠[36]。 除此之外，Yu等[37]研究表明小鼠的搔抓行為與人類打哈欠類似，均具有傳染性，即小鼠在觀察到同種搔抓行為后會出現(xiàn)模仿性抓撓。 由此可見，建立準(zhǔn)確評估動物搔抓行為機(jī)制尤為重要。

辣椒素和組胺通常分別被作為致痛劑與致癢劑用于小鼠。 Shimada 等[38]通過相關(guān)實驗表明，小鼠對臉頰疼痛刺激表現(xiàn)為前肢擦拭面部(見圖1B)，而小鼠通過后肢搔抓臉頰(見圖1C)通常表明小鼠瘙癢所致行為。 同時他們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在雄性CD-1小鼠的臉頰分別注射辣椒素和組胺時，小鼠分別表現(xiàn)出用前肢擦拭臉頰和用后肢搔抓臉頰，但當(dāng)在小鼠的頸背部分別注射辣椒素和組胺時，小鼠均表現(xiàn)為后肢搔抓。 故相對于頸背部皮膚注射，臉頰的注射更有利于區(qū)分小鼠的瘙癢和疼痛。 所以，在造模時，除了要謹(jǐn)慎選擇造模方法，更要嚴(yán)格選擇合適的致癢部位以將實驗誤差降到最低。 通常將一次搔抓行為定義為:小鼠后肢從抬起到著地或放嘴里之間的搔抓為一次搔抓，無論在此期間小鼠搔抓多少次[39]。 目前常用的評估小鼠瘙癢的方法包括肉眼觀察、聲學(xué)檢測和搔抓運動產(chǎn)生的感應(yīng)電流檢測[40-42]。 但是肉眼觀察費時費力，而聲學(xué)檢測及感應(yīng)電流檢測方法需要專業(yè)設(shè)備與分析軟件。 最近，Kobayashi 等[43]研究出的一種卷積遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(CRNN)可以精確檢測出小鼠的抓撓，并且準(zhǔn)確地區(qū)分動物的搔抓與梳理毛發(fā)行為。

圖1 小鼠梳理毛發(fā)、疼痛及瘙癢的行為Note. A. Mice grooming behavior due to clean skin. B. Mice rubbing their faces with their forelimbs due to localized pain in the cheeks. C.Mice scratching their faces with their hindlimbs due to itching.Figure 1 Grooming， painful and itchy behavior in mice

5 總結(jié)與展望

慢性腎病相關(guān)性瘙癢癥的發(fā)病機(jī)制在近20 年的研究中得到越來越多的證實，但其動物模型建立仍然面臨極大的挑戰(zhàn)與困難。 慢性腎病相關(guān)性瘙癢癥是由多方面因素導(dǎo)致，但目前的動物模型均采用單一的致癢因素建立，未能綜合反應(yīng)慢性腎疾病的病理過程。 同時，不同種類的動物、性別及致癢介質(zhì)的劑量均對動物的搔抓反應(yīng)具有不同影響。鑒于當(dāng)前的CKD-aP 發(fā)病機(jī)制的主要假設(shè)，建立一個免疫系統(tǒng)功能障礙和內(nèi)源性阿片類激素失衡的動物模型也許能更完善地開展相關(guān)研究。 除此之外，在慢性腎病的動物模型上再加以多種致癢因素共同致癢也許更為適用。