大小鼠失眠模型和評(píng)價(jià)方法研究進(jìn)展

夏天吉，閆明珠，王智，靳蘇維，劉新民，潘瑞樂(lè)，常琪

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193)

睡眠是維持機(jī)體正常功能的重要生理活動(dòng)，充足、良好的睡眠可以使人恢復(fù)精力和體力。 隨著人們生活節(jié)奏的加快以及人口老齡化的加劇，失眠已成為當(dāng)今社會(huì)普遍存在的健康問(wèn)題。

失眠是指患者對(duì)睡眠時(shí)間和(或)質(zhì)量不滿足并影響日間社會(huì)活動(dòng)的一種主觀體驗(yàn)，主要表現(xiàn)為入睡困難、睡眠難以維持、過(guò)早蘇醒、醒后伴有煩躁、意識(shí)不清或疲勞等[1]，長(zhǎng)期失眠可能會(huì)引起記憶減退、免疫功能降低、情緒障礙，甚至引發(fā)抑郁癥、焦慮癥、糖尿病、高血壓、肥胖癥、心腦血管疾病等。 我國(guó)2017 年大于10 萬(wàn)樣本量的流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)[2-3]，失眠患病率為15%，其中老年人患病率為35.9%。 失眠問(wèn)題日益顯著，因此研發(fā)能夠改善睡眠的藥物或保健品已成為當(dāng)今熱點(diǎn)，而相關(guān)研究需涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，主要包括失眠動(dòng)物模型的建立和評(píng)價(jià)方法。 目前文獻(xiàn)中使用較多的動(dòng)物模型為大鼠和小鼠。 針對(duì)大小鼠失眠模型，構(gòu)建方法甚多，各具特點(diǎn)，可應(yīng)用不同角度的評(píng)價(jià)方法判斷造模是否成功，同時(shí)可采用這些評(píng)價(jià)方法進(jìn)行鎮(zhèn)靜催眠藥物藥效學(xué)的評(píng)價(jià)。 本文將對(duì)常用的大小鼠失眠模型和評(píng)價(jià)方法進(jìn)行綜述，以期為失眠的研究提供參考。

1 失眠模型的文獻(xiàn)分析

利用中國(guó)知網(wǎng)和 PubMed 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)近10 年(2010.01 ～2021.06)發(fā)表的文獻(xiàn)進(jìn)行檢索，關(guān)鍵詞為“失眠動(dòng)物模型(insomnia animal model)”、“失眠(insomnia)”、“睡眠障礙(sleep disorders)”、“睡眠剝奪 (sleep deprivation)” 和 “睡眠干擾 (sleep disturbance)”合并“大鼠(rats)”或“小鼠(mice)”，搜索后得到中文文獻(xiàn)1145 篇、英文文獻(xiàn)3470 篇。在共計(jì)4615 篇的文獻(xiàn)中，大部分是利用失眠動(dòng)物模型進(jìn)行認(rèn)知、焦慮、抑郁、血壓、血糖等方面的研究，而與睡眠直接相關(guān)的文獻(xiàn)僅506 篇，約占11%。 在506 篇研究睡眠相關(guān)的文章中，應(yīng)用物理因素造模共213 篇，主要通過(guò)輕柔刺激法(83 篇)和平臺(tái)水環(huán)境法(69 篇)；化學(xué)因素造模有227 篇，其中采用最多的是對(duì)氯苯丙氨酸(190 篇)，也可利用咖啡因(20篇)干擾睡眠；病理因素造模的文章較少，僅20 篇；亦有采用上述多個(gè)因素相結(jié)合的造模方法，即復(fù)合因素法，有38 篇。 下面對(duì)用于睡眠相關(guān)研究的大小鼠失眠模型進(jìn)行總結(jié)介紹。

2 大小鼠失眠模型的構(gòu)建方法

2.1 物理因素

2.1.1 觸碰法

觸碰法指通過(guò)輕柔觸碰動(dòng)物、晃動(dòng)或拍打鼠籠以干擾動(dòng)物的睡眠造成動(dòng)物失眠的方法。 觸碰的方式可為人工手動(dòng)觸碰，也可利用儀器，選取毛刷、杠桿或木棒進(jìn)行自動(dòng)觸碰[4]。 晃動(dòng)籠具既可手動(dòng)搖晃，也可將其放在搖床或可移動(dòng)的平面上以達(dá)到使動(dòng)物保持清醒的目的。 該方法具有刺激強(qiáng)度小、對(duì)動(dòng)物干擾小的優(yōu)點(diǎn)，且無(wú)持續(xù)性壓力。 人工干預(yù)的方法較易實(shí)施，但對(duì)實(shí)驗(yàn)者的專注力、體力要求較高，只適合短時(shí)間造模。 若采用儀器進(jìn)行自動(dòng)干擾，短期或長(zhǎng)期造模均可。 Wallace 等[5]利用此方法研究睡眠碎片化對(duì)小鼠的影響。 動(dòng)物放入含杠桿的鼠籠中，杠桿每2 min 自動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)10 s，當(dāng)觸碰到動(dòng)物時(shí)，動(dòng)物被喚醒。 腦電監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，這一過(guò)程中動(dòng)物的非快動(dòng)眼睡眠(nonrapid eye movements sleep，NRMES)和快動(dòng)眼睡眠(rapid eye movement sleep，REMS)時(shí)間顯著減少，覺(jué)醒次數(shù)明顯增加。研究多利用此方法觀察不同處理的小鼠在短時(shí)睡眠剝奪后，睡眠恢復(fù)的差異性。 現(xiàn)已成為最常用的睡眠剝奪方法。

2.1.2 平臺(tái)水環(huán)境法

平臺(tái)水環(huán)境法的原理是動(dòng)物進(jìn)入REM 睡眠后肌肉張力消失，從平臺(tái)掉落水中驚醒，造成REM 睡眠剝奪。 造模方法為將動(dòng)物放在實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)直徑較小的平臺(tái)上，平臺(tái)對(duì)于小鼠多設(shè)定為直徑約2 cm、高約5 cm；對(duì)于大鼠直徑約6.5 cm，高約8 cm。 實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)注入自來(lái)水，水面高度距離平臺(tái)面約0.5 ～1 cm。 此方法包括:(1)單平臺(tái)法即實(shí)驗(yàn)籠內(nèi)僅設(shè)置一個(gè)平臺(tái)，可避免動(dòng)物相互干擾，但會(huì)造成單籠飼養(yǎng)的隔離應(yīng)激，甚至出現(xiàn)社交障礙；(2)多平臺(tái)法可同時(shí)進(jìn)行多只動(dòng)物的REM 睡眠剝奪[6]，并且動(dòng)物可在各平臺(tái)上自由活動(dòng)。 故多平臺(tái)法應(yīng)用較廣泛。 該方法可針對(duì)性剝奪REM 睡眠，缺點(diǎn)是若造模時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或強(qiáng)度過(guò)大，可能出現(xiàn)動(dòng)物掉落水中因體力不支無(wú)法返回平臺(tái)而死亡的現(xiàn)象。 故不適合長(zhǎng)期且高強(qiáng)度造模[7]。 Machado 等[8]應(yīng)用直徑為6.5 cm 的平臺(tái)，對(duì)大鼠進(jìn)行單平臺(tái)法和多平臺(tái)法的睡眠剝奪，發(fā)現(xiàn)在造模期間，兩種方法不僅能基本完全剝奪動(dòng)物的REM 睡眠，更顯著減少慢波睡眠。

2.1.3 滾筒法

滾筒法(轉(zhuǎn)輪法)的原理是將動(dòng)物放入滾筒等裝置中，裝置自動(dòng)旋轉(zhuǎn)，動(dòng)物被迫隨裝置轉(zhuǎn)動(dòng)而運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致無(wú)法入睡或短暫睡眠后覺(jué)醒。 實(shí)驗(yàn)除設(shè)有對(duì)照組和睡眠剝奪組外，常增加強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)組，目的在于排除運(yùn)動(dòng)對(duì)動(dòng)物睡眠相關(guān)指標(biāo)的影響。 強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)組的裝置轉(zhuǎn)速多設(shè)置為睡眠剝奪組的兩倍，時(shí)間減少一半，保證充足的睡眠[9]。 此方法的特點(diǎn)為造模強(qiáng)度大，可實(shí)現(xiàn)完全睡眠剝奪，重復(fù)性和可靠性高，但對(duì)動(dòng)物的體力消耗大，對(duì)儀器的穩(wěn)定性要求較高。 Dispersyn 等[10]將小鼠放入滾筒(外徑35.6 cm，內(nèi)徑 20.9 cm)中，滾筒以 3 m/min 轉(zhuǎn) 3 s，停12 s 的方式自動(dòng)旋轉(zhuǎn)，以探究睡眠剝奪24 h 和恢復(fù)期48 h 內(nèi)小鼠睡眠的變化。 結(jié)果表明小鼠24 h 內(nèi)覺(jué)醒時(shí)間達(dá)97%，恢復(fù)期第1 天7:00 ～19:00，小鼠NREM 和REM 睡眠明顯反彈。

除觸碰法、平臺(tái)水環(huán)境法和滾筒法外，水上網(wǎng)格法、水上轉(zhuǎn)盤法等也可應(yīng)用于失眠動(dòng)物的造模，但據(jù)近十年文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)已較少應(yīng)用。

2.1.4 慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激

慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激模型( chronic unpredictable mild stress，CUMS)，早期又名慢性溫和應(yīng)激模型(CMS)，由 Katz 等[11]于 1981 年首先建立。 造模期間動(dòng)物歷經(jīng)潮濕墊料、空瓶、禁食、冰水游泳、熱水游泳、夾尾、晝夜顛倒、電擊等操作，最終造成快感缺失、焦慮、抑郁和學(xué)習(xí)記憶障礙等[12]。此模型大多用于焦慮、抑郁、認(rèn)知等方面的研究，也有研究顯示其會(huì)對(duì)睡眠造成影響。 Mou 等[13]對(duì)SD大鼠進(jìn)行28 d 的慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激后，向大鼠腹腔注射50 mg/kg 戊巴比妥鈉，觀察到模型大鼠的睡眠時(shí)間顯著縮短。 Nollet 等[14]對(duì)小鼠進(jìn)行9 周的CUMS 造模，并間隔進(jìn)行腦電監(jiān)測(cè)。 結(jié)果顯示，造模僅3 d 即可使小鼠的REMS 時(shí)間顯著增加，并持續(xù)至造模結(jié)束；NREMS 在整個(gè)周期內(nèi)時(shí)長(zhǎng)無(wú)顯著變化，但呈碎片化。

2.1.5 慢性束縛

束縛是將動(dòng)物放入狹小的束縛裝置中，限制動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)空間和范圍，造成心理和生理的雙重壓力，具有簡(jiǎn)單易操作、無(wú)痛且持久的特點(diǎn)[15]。 慢性束縛不僅使動(dòng)物情緒、學(xué)習(xí)記憶等行為學(xué)指標(biāo)、炎癥指標(biāo)發(fā)生變化[16-17]，也可造成睡眠障礙。 陸婷婷[18]將ICR 小鼠放入50 mL 離心管制成的束縛器中，進(jìn)行 3、5 或 7 d 的束縛造模，每天 9 h 或 12 h，并于束縛結(jié)束后腹腔注射戊巴比妥鈉誘導(dǎo)動(dòng)物入睡，觀察睡眠潛伏期和睡眠時(shí)間。 束縛后的各組小鼠睡眠潛伏期均延長(zhǎng)、睡眠時(shí)間均縮短，以每天束縛9 h，持續(xù) 7 d 最為顯著。 Yasugaki 等[19]對(duì) C57BL/6J小鼠進(jìn)行3 周的浸水和束縛實(shí)驗(yàn)，將小鼠放入束縛管內(nèi)，垂直放入水中。 每天2 h，每周6 d，并于各周第7 天進(jìn)行腦電監(jiān)測(cè)。 小鼠在給予1、2 和3 周的壓力刺激后24 h 內(nèi)均顯示出覺(jué)醒時(shí)間減少，NREMS和REMS 時(shí)間增加，其中第1 周結(jié)果最顯著，同時(shí)伴隨REMS 次數(shù)明顯增加。

2.1.6 慢性社會(huì)挫敗

2.4.4產(chǎn)業(yè)鏈短，產(chǎn)品附加值不高中藥材深加工對(duì)技術(shù)和資金實(shí)力要求較高，由于技術(shù)落后和資金缺乏，鎮(zhèn)內(nèi)中藥材加工較少，產(chǎn)業(yè)鏈短，使得產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)附加值不高，難以產(chǎn)生較高的經(jīng)濟(jì)效益。以覆盆子加工為例，加工場(chǎng)地狹小，設(shè)備落后，手段較為原始，只是簡(jiǎn)單的烘干或是人工曬干。

慢性社會(huì)挫敗動(dòng)物模型模擬人在社會(huì)環(huán)境中因社會(huì)地位等問(wèn)題產(chǎn)生的心理壓力，最終導(dǎo)致社交恐懼和興趣缺失[20]。 動(dòng)物模型常采用C57BL/6J 小鼠，將其放入CD1 小鼠的籠中，因CD1 小鼠的領(lǐng)地中突然出現(xiàn)其他動(dòng)物，會(huì)攻擊C57BL/6J 小鼠。 造模一般采用每天攻擊10 min，其余時(shí)間用透明隔板隔開(kāi)的方式。 該方法不僅會(huì)引起動(dòng)物的社交障礙，同時(shí)會(huì)改變其睡眠節(jié)律。 Henderson 等[21]對(duì)C57BL/6J 小鼠進(jìn)行10 d 慢性社會(huì)挫敗造模，在第1、3、10 天進(jìn)行腦電監(jiān)測(cè)。 結(jié)果顯示 1、3、10 d 社會(huì)挫敗后3 h 內(nèi)覺(jué)醒時(shí)間顯著增加，REMS 時(shí)間顯著減少，NREM 睡眠減少；造模后10 ～22 h 出現(xiàn)睡眠反彈，覺(jué)醒時(shí)間極顯著減少，NREM 睡眠極顯著增加，REM 睡眠增加。 Wells 等[22]同樣用 C57BL/6J小鼠造成社會(huì)挫敗模型，并每日監(jiān)測(cè)腦電變化。 發(fā)現(xiàn)造模期間，模型組REMS 平均時(shí)間顯著增加，在第4、5、6、7、9 天與對(duì)照組有顯著性差異，REMS 次數(shù)對(duì)應(yīng)增加。 慢波睡眠時(shí)間也呈上升趨勢(shì)，同時(shí)伴隨覺(jué)醒時(shí)間減少。

2.1.7 空瓶刺激

空瓶刺激模型由林文娟等[23]建立，指動(dòng)物經(jīng)過(guò)定時(shí)喂水訓(xùn)練后，形成條件反射，隨后進(jìn)行不定時(shí)空瓶刺激，1 d 內(nèi)1 ～ 2 次，以誘發(fā)其情緒應(yīng)激。 于鑫[24]應(yīng)用慢性情緒應(yīng)激造大鼠失眠模型。 大鼠經(jīng)歷10 d 定時(shí)喂水訓(xùn)練后，進(jìn)行14 d 空瓶刺激，應(yīng)激后大鼠睡眠總時(shí)間、慢波睡眠、REM 睡眠均縮短。

2.1.8 電擊

電擊是可使動(dòng)物產(chǎn)生恐懼的壓力源，大量研究表明其會(huì)對(duì)動(dòng)物的睡眠產(chǎn)生影響。 王芳等[25]通過(guò)電刺激造大鼠失眠模型，參數(shù)為電流0.5 mA，頻率1 Hz，刺激 30 s 間隔 30 min，觀察到 8 h 電刺激后SD 大鼠睡眠總時(shí)間、慢波睡眠、REM 睡眠均減少，覺(jué)醒時(shí)間增加。 Yan 等[26]也應(yīng)用相同參數(shù)電擊造模，觀察大鼠經(jīng)受刺激前后睡眠的變化，結(jié)果與上述研究一致。

觸碰法、平臺(tái)水環(huán)境法和滾筒法模擬因?yàn)橥饨绛h(huán)境干擾所致的睡眠不足，根據(jù)造模時(shí)間可造成完全睡眠剝奪或部分睡眠剝奪，使動(dòng)物表現(xiàn)出以睡眠時(shí)間減少為特征的失眠癥狀。 慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激、慢性束縛、慢性社會(huì)挫敗、空瓶刺激和電擊是通過(guò)心理和生理的雙重應(yīng)激，造成動(dòng)物睡眠障礙，普遍表現(xiàn)為覺(jué)醒時(shí)間增加，睡眠時(shí)間減少。 然而，經(jīng)歷慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激的動(dòng)物多表現(xiàn)為睡眠時(shí)間增加。 此外，創(chuàng)傷后應(yīng)激、沖突性心理應(yīng)激也可造成動(dòng)物睡眠障礙，出現(xiàn)失眠癥狀[27-28]。

2.2 化學(xué)因素

對(duì)氯苯丙氨酸(4-chloro-DL-phenylalanine，PCPA)是色氨酸羥化酶的選擇性和不可逆性抑制劑，色氨酸羥化酶是合成5-HT 的起始酶和限速酶。 5-HT 已被證實(shí)在睡眠-覺(jué)醒的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，而 PCPA 可有效阻斷95%以上5-HT 合成[29]。 腹腔注射PCPA 造成失眠模型，常用的劑量為300 ～ 500 mg/(kg·d)，連續(xù)注射 1 ～ 3 d。注射PCPA 后，動(dòng)物體內(nèi)5-HT 在至少7 d 內(nèi)維持較低水平，9 d 后可基本恢復(fù)正常[30]。 該方法造模成功率高，穩(wěn)定性好，動(dòng)物出現(xiàn)的失眠癥狀與人類相似，目前已廣泛用于失眠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究。 本文從動(dòng)物品系、周齡或體重、給藥劑量和方式等方面總結(jié)近幾年P(guān)CPA 造成大小鼠失眠模型的方法，見(jiàn)表1。

表1 PCPA 造大/小鼠失眠模型的方法Table 1 Methods of insomnia models of rats and mice caused by PCPA

2.2.2 咖啡因誘導(dǎo)失眠模型

咖啡因是腺苷A1和A2A受體的拮抗劑，其對(duì)二者的親和力相似，無(wú)選擇性。 咖啡因在體內(nèi)進(jìn)一步被代謝為黃嘌呤和茶堿，其代謝物可更有效地拮抗A1和 A2A受體[38]。 腺苷通過(guò)與 A1和 A2A受體結(jié)合發(fā)揮促進(jìn)睡眠的作用，故攝入咖啡因后會(huì)對(duì)睡眠造成影響。 該方法非常經(jīng)典，具有安全性高、成本低、作用明確的優(yōu)點(diǎn)。 但腺苷A2A受體基因的功能多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致咖啡因損害睡眠質(zhì)量的個(gè)體差異[39]，造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)波動(dòng)較大。 咖啡因的造模劑量多選用5 ～15 mg/kg，也可使用 25、30 或 50 mg/kg 等較高劑量。 在睡眠實(shí)驗(yàn)檢測(cè)前30 ～60 min 腹腔注射咖啡因，可成功影響動(dòng)物的睡眠。 總結(jié)近幾年采用咖啡因造模的文獻(xiàn)，如表2 所示。

表2 咖啡因造大/小鼠失眠模型的方法Table 2 Methods of insomnia models of rats and mice caused by caffeine

PCPA 和咖啡因造模都會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物覺(jué)醒時(shí)間增加，入睡潛伏期延長(zhǎng)和睡眠時(shí)間減少，其中REMS、NREMS 均減少。 除腹腔注射PCPA 和咖啡因外，給予動(dòng)物乙醇，形成乙醇依賴，戒斷后可造成動(dòng)物覺(jué)醒時(shí)間增加，REM、NREM 睡眠時(shí)間顯著減少[46]。中樞微量注射去甲腎上腺素、食欲素或促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素等，皮下注射阿樸嗎啡、氟西汀或育亨賓等同樣可導(dǎo)致動(dòng)物失眠[47]。

2.3 病理因素

慢性疼痛常引發(fā)失眠，現(xiàn)常采用坐骨神經(jīng)部分結(jié)扎造神經(jīng)痛模型，研究動(dòng)物睡眠的變化。 模型動(dòng)物表現(xiàn)出覺(jué)醒時(shí)間、次數(shù)增加，NREM、REM 睡眠時(shí)間及次數(shù)減少[48-49]。

此外，精神類疾病如抑郁癥、焦慮癥、創(chuàng)傷后應(yīng)激綜合癥、癲癇、自閉癥等也會(huì)引發(fā)失眠，高血壓、缺血性中風(fēng)同樣會(huì)抑制睡眠。

2.4 復(fù)合因素

根據(jù)研究目的不同，常采用多種誘因的復(fù)合因素造成失眠模型。 應(yīng)用線栓法(MCAO)和PCPA 聯(lián)合造模研究腦缺血后睡眠障礙，雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞(BCCAO)和平臺(tái)水環(huán)境法造模研究慢性腦缺血伴發(fā)失眠，去勢(shì)或卵巢切除聯(lián)合電刺激或觸碰等方法研究激素水平降低導(dǎo)致的失眠。 負(fù)重游泳和PCPA模擬運(yùn)動(dòng)性失眠大鼠。

此外，郜紅利等[50]采用母乳鼠分離、多種焦慮刺激和注射PCPA 造心腎不交大鼠失眠模型，動(dòng)物表現(xiàn)為睡眠時(shí)間減少，血象水平降低，下丘腦-垂體-腎上腺軸紊亂。 何博賽[51]通過(guò)對(duì)Wistar 大鼠連續(xù)5 d 腹腔注射50 mg/(kg·d)氫化可的松，再連續(xù)4 d 腹腔注射300 mg/(kg·d)PCPA，動(dòng)物出現(xiàn)弓腰無(wú)力、毛發(fā)少光澤、睡眠減少等現(xiàn)象，造成肝陰虛-失眠模型。 林臘梅[52]建立肝血虛失眠模型，切除SD 大鼠全肝的70%且恢復(fù)后，利用平臺(tái)水環(huán)境法進(jìn)行72 h REM 睡眠剝奪，動(dòng)物呈現(xiàn)口唇、爪甲淡粉色，爪甲欠光滑，目光呆滯、反應(yīng)遲鈍等狀態(tài)。 黃攀攀等[53]對(duì)動(dòng)物連續(xù)28 d 皮下注射D-半乳糖60 mg/(kg·d)，疊加8 d 腹腔注射咖啡因30 mg/(kg·d)，再利用多平臺(tái)水環(huán)境法進(jìn)行7 d 睡眠剝奪，造成大鼠的睡眠時(shí)間減少、心率加快、血壓升高、耳溫升高，成功建立老年陰虛失眠動(dòng)物模型。 朱潔等[54]采用夾尾和注射PCPA 復(fù)合法造大鼠肝郁證失眠模型，連續(xù)20 d 每天夾尾45 min，疊加連續(xù)2 d 腹腔注射400 mg/(kg·d)PCPA。 何林熹等[55]采用慢性束縛法復(fù)合夾尾15 d造成肝郁化火證失眠大鼠模型。

3 評(píng)價(jià)方法

常用的評(píng)價(jià)方法為巴比妥類藥物協(xié)同睡眠實(shí)驗(yàn)，空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)和腦電、肌電或眼動(dòng)監(jiān)測(cè)。 這些方法既可用于評(píng)價(jià)失眠模型，也可用于藥效學(xué)評(píng)價(jià)。 巴比妥類藥物協(xié)同睡眠實(shí)驗(yàn)可初步判斷動(dòng)物的睡眠情況，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、成本低，但結(jié)果指標(biāo)較少。 空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)是通過(guò)觀察動(dòng)物一定時(shí)間內(nèi)的運(yùn)動(dòng)參數(shù)，判斷其生理狀態(tài)，多用于鎮(zhèn)靜催眠藥物的評(píng)價(jià)。 腦電和肌電監(jiān)測(cè)可直接將動(dòng)物的睡眠狀態(tài)通過(guò)波形、波頻率等指標(biāo)呈現(xiàn)，但實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求高。

3.1 巴比妥類藥物協(xié)同睡眠實(shí)驗(yàn)

巴比妥類藥物是常用的催眠藥物，可應(yīng)用其來(lái)誘導(dǎo)動(dòng)物入睡，通過(guò)觀察動(dòng)物的行為得到有效結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)分為3 類:戊巴比妥鈉閾下劑量協(xié)同睡眠實(shí)驗(yàn)觀察動(dòng)物的入睡率、戊巴比妥鈉閾上劑量協(xié)同睡眠實(shí)驗(yàn)觀察睡眠時(shí)間、巴比妥鈉(或戊巴比妥鈉)實(shí)驗(yàn)觀察入睡潛伏期。 閾下劑量指80% ～90%動(dòng)物翻正反射不消失的戊巴比妥鈉最大劑量，閾上劑量指動(dòng)物100%入睡的戊巴比妥鈉最小劑量。 此外，巴比妥類藥物硫噴妥鈉等也可用于該實(shí)驗(yàn)。

動(dòng)物入睡以翻正反射消失為判斷標(biāo)準(zhǔn)。 給藥后待動(dòng)物基本停止運(yùn)動(dòng)時(shí)，對(duì)其體位進(jìn)行翻轉(zhuǎn)，即呈仰臥位，若動(dòng)物30 min 內(nèi)仰臥位達(dá)60 s 以上，判斷其翻正反射消失進(jìn)入睡眠狀態(tài)。 一段時(shí)間后，當(dāng)翻正反射首次恢復(fù)時(shí)，立即將其翻轉(zhuǎn)成仰臥位，30 s內(nèi)若再次恢復(fù)，判斷為動(dòng)物覺(jué)醒，并記錄首次恢復(fù)翻正反射的時(shí)間為睡眠終止時(shí)間；若30 s 內(nèi)未恢復(fù)，則在動(dòng)物翻正反射再次恢復(fù)后重復(fù)翻轉(zhuǎn)，直至判定為睡眠結(jié)束[56]。

3.2 空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)

空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)是將動(dòng)物放入實(shí)驗(yàn)箱的中心，適應(yīng)2～5 min 后，記錄并分析動(dòng)物在一段時(shí)間內(nèi)(一般為5 ～15 min)的運(yùn)動(dòng)路程、運(yùn)動(dòng)時(shí)間、站立次數(shù)和運(yùn)動(dòng)軌跡等指標(biāo)，或?qū)?dòng)物穿越網(wǎng)格數(shù)或直立次數(shù)進(jìn)行水平、垂直評(píng)分以反映動(dòng)物的自主活動(dòng)情況。 失眠動(dòng)物常表現(xiàn)為自主活動(dòng)增加，而給予動(dòng)物鎮(zhèn)靜催眠藥物后，則表現(xiàn)為自主活動(dòng)減少。

3.3 腦電圖、肌電圖、眼點(diǎn)圖

腦電圖(EEG)和肌電圖(EMG)監(jiān)測(cè)是將動(dòng)物麻醉，插入電極，恢復(fù)7 ～ 14 d 后，通過(guò) EEG、EMG觀察并統(tǒng)計(jì)動(dòng)物覺(jué)醒、REM 睡眠、NREM 睡眠時(shí)長(zhǎng)，時(shí)相出現(xiàn)次數(shù)、持續(xù)時(shí)間、轉(zhuǎn)換次數(shù)等指標(biāo)。 失眠動(dòng)物常表現(xiàn)為睡眠總時(shí)間縮短，覺(jué)醒增加，各相睡眠時(shí)間不同程度縮短；睡眠呈碎片化，即時(shí)相出現(xiàn)次數(shù)、轉(zhuǎn)換次數(shù)增多，持續(xù)時(shí)間縮短；波形與正常動(dòng)物存在差異。 腦電圖(EEG)和肌電圖(EMG)可準(zhǔn)確反映睡眠過(guò)程，為最直接、可靠的評(píng)價(jià)方法，同時(shí)也可應(yīng)用眼點(diǎn)圖(EOG)進(jìn)行輔助研究。

4 小結(jié)和展望

理想的動(dòng)物模型需遵循以下原則，動(dòng)物疾病模型與人類疾病具有相似的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，具備該疾病的主要癥狀和體征，針對(duì)藥物治療，與人類疾病具有相似的反應(yīng)，模型可重復(fù)。 常用的大鼠、小鼠失眠模型從不同角度模擬人類失眠特征。 物理因素造模模擬外界環(huán)境刺激，例如觸碰、滾筒、束縛和社會(huì)挫敗等模擬心理生理壓力造成的失眠；化學(xué)因素造模針對(duì)特異性靶點(diǎn)，使動(dòng)物出現(xiàn)失眠癥狀；病理、復(fù)合因素模擬各種原因伴發(fā)的失眠。 然而，人類的失眠原因復(fù)雜，失眠動(dòng)物模型仍存在一定局限性，需進(jìn)一步研發(fā)和摸索。 僅應(yīng)用物理因素或化學(xué)因素造模，無(wú)法全面模擬人類失眠的特征，可依據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)要求選擇復(fù)合因素造模。 復(fù)合因素造模應(yīng)明確各個(gè)因素的意義，避免盲目選擇。 針對(duì)方法學(xué)研究，應(yīng)進(jìn)一步詳細(xì)和清晰造模方法的時(shí)間和強(qiáng)度以及影響睡眠的程度，為今后的科學(xué)研究提供有力的理論依據(jù)。

常用的評(píng)價(jià)方法為巴比妥類藥物協(xié)同睡眠實(shí)驗(yàn)、空?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)和腦電、肌電監(jiān)測(cè)。 目前的評(píng)價(jià)手段較單一，且存在諸多問(wèn)題。 巴比妥類藥物協(xié)同睡眠實(shí)驗(yàn)中，關(guān)鍵的判斷指標(biāo)為翻轉(zhuǎn)反射消失，但手動(dòng)翻轉(zhuǎn)動(dòng)物這一操作對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有一定主觀影響?？?qǐng)鰧?shí)驗(yàn)中，若采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)5 ～15 min，無(wú)法全面反映動(dòng)物在整個(gè)睡眠周期中的行為學(xué)改變，無(wú)法真實(shí)反映動(dòng)物的睡眠情況。 腦電、肌電監(jiān)測(cè)需在動(dòng)物腦內(nèi)插入電極，會(huì)造成創(chuàng)傷而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。故針對(duì)現(xiàn)存的問(wèn)題，需研發(fā)新型儀器設(shè)備或改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法。 例如通過(guò)儀器對(duì)動(dòng)物進(jìn)行翻轉(zhuǎn)以判斷是否入睡，進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間睡眠監(jiān)測(cè)；研究新的實(shí)驗(yàn)方法，通過(guò)動(dòng)物的行為學(xué)指標(biāo)判斷睡眠情況，避免造成創(chuàng)傷，更加科學(xué)地進(jìn)行評(píng)價(jià)，為失眠動(dòng)物模型、新型鎮(zhèn)靜催眠藥物的研發(fā)和睡眠的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。