液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法測定魚類干制品中甲基汞含量的測量不確定度評估

楊凱峰 李 俊 韓章華 程文東 王 鎖 孫武勇*

1.河南安必諾檢測技術有限公司 河南鄭州 450000

2.海南省市場監(jiān)督管理局食品綜合協(xié)調(diào)與抽檢監(jiān)測處/海南省食品藥品檢驗所五指山分所 海南?？?570100

3.鄭州輕工業(yè)大學 河南鄭州 450000

汞是一種劇毒元素，具有元素汞、無機汞、有機汞多種形態(tài)，而有機汞中甲基汞危害最為嚴重[1]。在日常環(huán)境中，通過各種生物或非生物作用，水環(huán)境中的無機汞可能轉(zhuǎn)化成甲基汞，并且在受污染的環(huán)境中，由于生物富集作用，魚類體內(nèi)可能積累大量的甲基汞[2]，可以通過食物鏈等方式傳遞，從而危害人體健康。因此對水產(chǎn)制品的甲基汞含量檢測對保障食品安全就顯得尤為重要。

GB 5009.17-2021《食品安全國家標準 食品中總汞及有機汞的測定》[3]，首次規(guī)定適用范圍包括水產(chǎn)動物及其制品甲基汞的測定，并新增LC-ICP-MS法。該法前處理過程簡單、干擾小、線性范圍廣、檢出限低，可以很好地對試樣中的汞進行形態(tài)分析和含量檢測[4]。采用該法測定魚類干制品中的甲基汞含量，并根據(jù)JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[5]和CNAS-GL006-2019《化學分析中不確定度的評估指南》[6]提供的方法，通過對測量結果產(chǎn)生影響的主要因素進行分析，評估測量不確定度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

實驗中所用試劑一般為優(yōu)級純(另有說明除外)，水為GB/T6682一級水；

標準溶液(甲基汞)，鹽酸，氨水，甲醇(色譜純)，L-半胱氨酸，乙酸銨(分析純)；

高效液相色譜儀(Ultimate 3000賽默飛)與電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(Icap qc賽默飛)聯(lián)用；

電子天平(AUX120)，電子天平(AUW220D)，均為島津；

高速冷凍離心機(3K15)，德國Sigma；

超聲波清洗器(SB-25-12DTD)，寧波新芝。

1.2 試驗方法

根據(jù)GB 5009.17—2021《食品安全國家標準 食品中總汞及有機汞的測定》[3]規(guī)定的LC-ICP-MS開展實驗。

1.2.1 溶液配制

氨水溶液(1+1)：將氨水(50mL)加入水(50mL)中混勻。

鹽酸溶液(5mol/L)：鹽酸(208mL)用水稀釋至500mL。

L-半胱氨酸溶液(10g/L)：將L-半胱氨酸(0.1g)溶于水(10mL)中混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

甲醇水溶液(1+1)：將甲醇(100mL)與水(100mL)混勻。

流動相(3%甲醇+0.04mol/L乙酸銨+1g/L L-半胱氨酸)：L-半胱氨酸(0.5g)與乙酸銨(1.6g)溶于水(100mL)中，加甲醇(15mL)，然后用水稀釋至500mL。過0.45μm有機濾膜，超聲脫氣30min，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理

購買來自市場售賣的魚類干制品樣品粉碎后，充分攪拌混勻，稱取樣品0.5g至塑料離心管(15mL)中，加入5mol/L鹽酸溶液(10mL)。室溫下超聲水浴提取60min，期間振搖數(shù)次。4℃，8 000r/min離心15min。準確移取上清液(2.0mL)至容量瓶(5mL)中，逐滴加入氨水溶液(1+1)，至樣液pH值3～7。加入10g/L L-半胱氨酸溶液(0.1mL)，用水定容。過0.45μm有機濾膜，待測?？瞻自囼炌稀?/p>

1.2.3 儀器條件

(1)液相色譜條件。

色譜柱：C18分析柱(150mm×4.6mm,5μm)。

流動相：3%甲醇+0.04mol/L乙酸銨+1g/L L-半胱氨酸。

流速：1.0mL/min。

進樣量：50μL。

(2)電感耦合等離子體質(zhì)譜儀條件。

射頻功率：1 500W。

采樣深度：8mm。

霧化室溫度：2℃。

載氣(氬氣)流量：0.85L/min。

補償氣(氬氣)流量：0.15L/min。

積分時間：0.5s。

檢測質(zhì)荷比(m/z)：202。

1.3 測定結果的數(shù)學模型

按公式(1)計算試樣中甲基汞的含量(以Hg計)。

(1)

式中：

X—試樣中甲基汞的含量(以Hg計)，mg/kg；

c—經(jīng)標準曲線得到的測定液中甲基汞的濃度，μg/L；

c0—經(jīng)標準曲線得到的空白溶液中甲基汞的濃度，μg/L；

v—加入提取試劑的體積，mL；

f—稀釋因子，2.5；

m—試樣稱樣量，g；

1 000—換算系數(shù)。

2 結果與分析

2.1 引入不確定度的來源

通過研究食品中甲基汞檢測的實驗過程和評估測量不確定度的方法，分析對測定結果產(chǎn)生影響的原因，以此確定不確定度分量來源。測定結果主要受樣品測量重復性、樣品的稱量過程、樣品前處理過程、標準溶液及標準曲線擬合等方面的影響。

2.2 不確定度分量的評估

2.2.1 評估重復測量引入的不確定度urel(rep)

樣品中甲基汞的測定結果見表1。

表1 樣品中甲基汞的測定結果Table 1 Measurement results of methylmercuryin samples

檢測實驗室用于食品中甲基汞檢測新方法開驗的樣品之一魚類干制品經(jīng)過反復測定，確認含量穩(wěn)定，稱取過程應保持穩(wěn)定，盡量降低結果偏差。準確稱取混勻后魚類干制品樣品10份，分別測定其中的甲基汞含量。

測量重復性以通過貝塞爾公式(2)計算得標準偏差表示：

(2)

其中：

xi—第i次的測量值;

n—獨立重復測量次數(shù);

計算樣品中，甲基汞重復性實驗引入的標準不確定度：

相對標準不確定度:

2.2.2 評估樣品稱量引入的不確定度urel(m)

樣品采購于周口某市場，檢測備樣保存期滿后，實驗室新方法開驗選用，粉碎充分、均勻，此處不考慮其引入的不確定度。在此過程中對樣品稱量結果影響較大的是電子天平的使用。通過對使用的萬分之一電子天平的校準證書進行查詢，結果顯示：U=0.0009g，k=2。

根據(jù)檢測方法操作，稱量樣品0.500g，引入的標準不確定度如下：

u(m)=U/k=0.00045g

相對標準不確定度：

urel(m)=u(m)/m=0.0009

2.2.3 評估樣品前處理過程引入的不確定度urel(v)

樣品前處理過程中，因移取提取液及定容等操作需要用到10mL、1mL移液器和5mL容量瓶。

實驗溫度在(20±5)℃時，ΔT=5℃，此時水的膨脹系數(shù)為α=0.00021/℃。

溫度引入的標準不確定度計算公式(3)：

(3)

移液器(10mL、1mL)和容量瓶(5mL)的使用而引入的不確定度見表2。

合成計算得樣品前處理過程中引入的不確定度評定結果：

2.2.4 評估標準溶液引入的不確定度urel(c)

標準溶液的使用要考慮其純度，儲備液的配制過程，中間工作液的配制過程以及標準曲線系列溶液的配制過程等方面的影響，相關不確定度的評估從這幾方面入手。

(1)評估標準溶液純度引入的不確定度urel(c1)。

查詢標準溶液(甲基汞)證書((63.5±2.4)μg/g，k=2)，折算單體純品率93%，標準不確定度為：

u(c1)=2.4/2=1.2μg/g。

相對標準不確定度：

urel(c1)=1.2/63.5=0.019

(2)評估儲備液配制引入的不確定度urel(c2)。

①評估稱量引入的不確定度urel(c2-1)。

通過查詢此過程所用的十萬分之一電子天平的校準證書可得，校準結果顯示：載荷值0.1g時，U=0.00006g，k=2。準確稱量標準物質(zhì)0.0847g，計算得標準不確定度:

u(c2-1)=U/k=0.00003g

相對標準不確定度：

urel(c2-1)=u(c2-1)/m=0.0004

②評估定容引入的不確定度urel(c2-2)。

定容用容量瓶(5mL)。溫度引入的標準不確定度計算方法同上。

使用5mL容量瓶引入的不確定度評定結果見表3。

表3 使用5mL容量瓶引入的不確定度評定結果Table 3 Uncertainty Evaluation Results Introduced by Using a 5 mLvolumetric Flask

合成計算得標準溶液儲備液配制引入的不確定度評定結果：

(3)評估中間工作液配制引入的不確定度urel(c3)。

該過程引入的不確定度主要受使用移液器(1mL)和容量瓶(10mL)的影響。溫度引入的標準不確定度計算方法同上。

使用移液器(1mL)和容量瓶(10mL)引入的不確定度評定結果見表4。

表4 標準溶液中間工作液配制引入的不確定度評定結果Table 4 Evaluation Results of Uncertainty Introduced in the Preparation of Standard Solution Intermediate Working Solution

合成計算得標準溶液中間工作液配制所引入的不確定度評定結果：

(4)評估標準曲線系列溶液配制引入的不確定度urel(c4)。

該過程引入的不確定度主要是需要使用容量瓶(1mL)，移液器(1mL，0.2mL)的影響，配制濃度分別為0.5、1、5、10、20、50ng/mL，用0.2mL移液器分別移取0.005、0.01、0.05、0.1、0.2mL，用1mL移液器移取0.5mL。溫度引入的標準不確定度計算方法同上。

容量瓶(1mL)共使用6次，引入的不確定度見表5。

表5 使用1mL容量瓶引入不確定度評定結果Table 5 Using a 1mL volumetric flask to introduce uncertainty evaluation results

0.5、1、5、10、20、50ng/mL系列標準溶液配制引入不確定度評定結果見表6。

表6 標準曲線系列溶液各點引入不確定度評定結果Table 6 Evaluation results of introducing uncertainty at each point of standard curve series solution

續(xù)表6

合成計算得標準曲線系列溶液的配制引入不確定度評定結果：

最后合成計算得引入的不確定度評定結果：

urel(c)=

2.2.5 評估標準曲線擬合引入的不確定度urel(q)

根據(jù)所得的甲基汞標準曲線Y=aX+b，對各濃度系列標準溶液進行重復測定，標準曲線系列溶液測定結果見表7。

表7 標準曲線系列溶液濃度測定結果Table 7 Standard curve series solution concentration determination result

標準曲線擬合所引入的不確定度可以通過公式(4)和公式(5)進行計算[7]。

標準曲線標準差計算公式為：

(4)

(5)

式中：

Ci—實際繪制擬合直線各點標準溶液濃度，ng/mL;

X—標準曲線系列標準溶液濃度，ng/mL;

S—標準曲線標準偏差;

Ai—標準曲線系列標準溶液質(zhì)量濃度的峰面積;

a—斜率20 731.0560;

b—截距2 168.4969;

n—校準溶液測試總次數(shù)18;

P—樣品測試次數(shù)10;

C0—樣品實測平均濃度。

經(jīng)計算得出：

C0=1.8700ng/mL

S=2075.7889

標準曲線擬合引入的標準不確定度：

u(q)=0.049ng/mL

標準曲線擬合引入的不確定度評定結果：

2.3 合成標準不確定度

各分量相對標準不確定度評定結果見表8。

表8 各分量相對標準不確定度評定結果Table 8 Evaluation results of relative standard uncertainty of each component

合成相對標準不確定度：

urel(X)=

魚類干制品中甲基汞含量測定的平均值為0.093mg/kg。

合成標準不確定度：

u(X)=urel(X)×0.093mg/kg=0.007mg/kg

2.4 擴展不確定度及不確定度結果報告

置信區(qū)間為95%的情況下，取包含因子k=2，擴展不確定度評定結果為：

U(X)=k×u(X)=0.014mg/kg

魚類干制品中甲基汞含量結果:

(0.093±0.014)mg/kg，k=2

3 結論

采用GB 5009.17—2021《食品安全國家標準 食品中總汞及有機汞的測定》中第二篇第二法，液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用法，測定魚類干制品中甲基汞含量，并進行測量不確定度評定。從不確定度評定過程來看，考慮到該樣品是用于新方法開驗樣品之一，實驗人員嚴格規(guī)范控制實驗過程，操作謹慎，同時樣品中甲基汞含量較低，測量過程中對結果影響較大的因素主要是標準溶液純度及配制、曲線擬合，但作為日常檢測中測量不確定度主要來源的測量重復性同樣重要，日常檢測工作的開展要應重點關注這些方面。由此可知實驗設備的精度、操作的規(guī)范性，對測量不確定度有較大影響，實驗過程中注意對各因素進行有效控制可以提高檢測準確性。