新型乳化劑TR-1制備水楊酸甲酯軟膏的研究

儲曉琴，徐宇航，祝 旗，鄭峙云

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，安徽 合肥 230012)

培麥倫TR-1作為一種新型藥用材料由于它特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，能夠在水包油乳劑中起主要乳化劑的作用[1]。目前已經(jīng)被應(yīng)用于多方面：ShahinM[2]等通過對制備的不同克霉唑乳狀凝膠的流變性能、短期和長期穩(wěn)定性進(jìn)行評價，培麥倫TR-1和TR-2能夠使克霉唑顯示出良好的穩(wěn)定性和較高的釋放率；DeLimaJA[3]等制備含克霉唑陽離子納米膠囊的復(fù)合培麥倫TR-1水凝膠，結(jié)果顯示有較好的鋪展性以及與陰道的兼容性。水楊酸甲酯(Methyl salicylate,MeSA)又被稱為“冬青油”，可由常綠喬木冬青樹的葉子經(jīng)乙醇提取后蒸餾或可由水楊酸與甲醇在硫酸催化下酯化反應(yīng)合成制得[4]。廣泛用于香料和生物防治中，在醫(yī)藥領(lǐng)域也具廣闊的開發(fā)前景：既可以解熱鎮(zhèn)痛，同時還具有抗菌消炎等作用[5]，屬非甾體抗炎藥。但MeSA穩(wěn)定性較低，易水解成水楊酸[6]。若使用不當(dāng)，偶見皮膚刺激如燒灼感，或過敏反應(yīng)如皮疹、瘙癢等[7]。本實驗使用TR-1為新型乳化劑，用水楊酸甲酯為模型藥，探究其制備水楊酸甲酯軟膏的最佳工藝和處方，進(jìn)一步明確TR-1在構(gòu)建經(jīng)皮遞藥系統(tǒng)的作用特點。

1 材料

1.1 儀器EssentiaLC-16高效液相色譜儀(日本島津)，TG16-WS高速離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(常州普天儀器制造有限公司)。

1.2 試劑MeSA原料藥(華陰市錦前程藥業(yè)有限公司，批號：20170321)，黃原膠(阿拉丁試劑有限公司，批號：G104873)，培麥倫TR-1(杭州卡波卡進(jìn)出口有限公司，批號：66018001/5)，三乙醇胺(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20170516)，硬脂酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20161109)，迷迭香精油(廣州市于楠生物科技有限公司，批號：20181123)，復(fù)方水楊酸甲酯軟膏(曼秀雷敦中國藥業(yè)有限公司，批號：H10960282)，PBS緩沖液(博士德生物工程有限公司，批號：20190416)。

1.3 實驗動物SPF級雄性SD大鼠，體重(200±20) g，安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，本實驗通過倫理學(xué)審查。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱：phenomenex C18色譜柱(250 nm×4.60 mm，5 μm)；流動相：水相：水：四氫呋喃：磷酸(50∶1∶0.01，v/v)、有機(jī)相：乙腈，二元高壓梯度；檢測波長：290 nm；總流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 精密稱取MeSA標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，加入乙腈超聲溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，定容，即得100 μg/mL MeSA標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱取MeSA軟膏5 mg，加入乙腈超聲溶解，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。精密稱取不含藥的空白軟膏適量，按“2.1.3”項下操作，即得陰性對照溶液制備。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 以峰面積A為縱坐標(biāo)(Y)，溶液濃度C為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，得水楊酸甲酯回歸方程：Y=20600X-421.58(R2=0.9994)，結(jié)果表明，水楊酸甲酯在1～50 μg/mL濃度范圍內(nèi)關(guān)系良好。

2.1.5 系統(tǒng)適用性考察 分別取適量陰性對照溶液、供試品溶液和MeSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照“2.1.1”項下測定。結(jié)果顯示，供試品溶液在對照品相對應(yīng)位置有色譜峰，陰性對照溶液不干擾主峰的測定，分離度大于1.5。

2.1.6 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一供試品溶液，每隔2 h進(jìn)樣一次，重復(fù)進(jìn)樣6次。峰面積的RSD為1.18%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 精密度考察 精密吸取“2.1.2”項下MeSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。峰面積RSD為1.02%，表明儀器精密度良好。

2.1.8 重復(fù)性考察 按“2.1.3”項下方法分別制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測定，峰面積RSD為1.42%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.9 回收率實驗 精密稱取適量MeSA對照品，添加至空白軟膏中，按“2.1.4”項下方法制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8%、10%、12%的MeSA軟膏。結(jié)果顯示，平均回收率為98.90%，RSD為1.11%，回收率良好。

2.2 軟膏的評價指標(biāo)以藥物含量、離心穩(wěn)定性和pH值作為軟膏的評價指標(biāo)[8-11]。藥物含量按“2.1.3”項下操作，HPLC進(jìn)樣測定。稱取1 g樣品置于1.5 mL離心管中，在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min，取出后觀察，是否出現(xiàn)油水分層、變軟、液化或硬化等現(xiàn)象。無現(xiàn)象得5分；略有分層得4分；變軟得3分；液化得2分；硬化得1分。稱取樣品100 mg至燒杯中，加入10倍量超純水至完全溶解，搖勻后測定樣品pH值。人體皮膚正常pH值范圍為4.0～6.0，但考慮到水楊酸甲酯軟膏一般用于治療皮膚病，皮膚受損后，pH值會升高，且O/W型乳劑基質(zhì)的軟膏pH應(yīng)小于8.3[11]，故參考以pH 6.0～8.0為合格，其余均為不合格。

2.3 水楊酸甲酯軟膏的工藝篩選

2.3.1 水楊酸甲酯軟膏的制備工藝 根據(jù)預(yù)實驗及文獻(xiàn)調(diào)研，確定基本處方：10%的MeSA、0.5% TR-1、0.5%三乙醇胺、0.2%黃原膠、87%水、2%迷迭香精油。最佳工藝：將適量TR-1均勻散于水上，900 r/min攪拌20 min，滴加三乙醇胺，4 ℃貯存24 h后取出，于80 ℃下預(yù)熱備用；取油相成分(MeSA、黃原膠)置于水浴上加熱至80 ℃，熔化混勻后，攪拌下將油相緩慢滴加入水相，乳化5～6 min，轉(zhuǎn)至室溫攪拌30 s，加入精油攪拌20 min至近冷凝。

2.3.2 乳化操作的影響 考慮到MeSA和TR-1作為乳化劑的性質(zhì)以及預(yù)實驗結(jié)果[11]，TR-1在攪拌溶脹下，4 ℃貯存24 h后其乳化性質(zhì)較佳，成品粘稠度較高，所以將傳統(tǒng)乳化法作為候選方法之一。

方法一：取油相成分(TR-1、MeSA)置容器中，于水浴上加熱至80 ℃使熔化；取水相成分(水、三乙醇胺、黃原膠)置另一容器中于水浴中亦加熱至80 ℃使其混勻，在攪拌下將水相以細(xì)流狀滴入油相，乳化5～6 min，再室溫下攪拌30 s后，加入精油攪拌20 min至近冷凝。方法二：“2.3.1”項下最佳工藝。方法三[11]：將水相緩慢滴入油相中，其余同方法二。方法四：將三乙醇胺加入到足量水中，混勻后將TR-1鋪撒其上，900 r/min攪拌20 min，4 ℃存放24 h后取出預(yù)熱80 ℃?zhèn)溆?；后續(xù)操作同方法二。按照方法二，考察乳化溫度對于軟膏性能的影響，三個梯度乳化溫度：60 ℃、70 ℃、80 ℃，分別記為M5，M6，M7。通過以上多種實驗方法優(yōu)選出最佳制備工藝：工藝二溶脹法；最佳乳化溫度：80 ℃。

表1 水楊酸甲酯軟膏的工藝篩選

2.4 水楊酸甲酯軟膏的處方優(yōu)化以外觀性狀表現(xiàn)、離心穩(wěn)定性、pH值、含量為評價指標(biāo)，按照最佳工藝操作，單因素考察不同軟膏基質(zhì)、TR-1用量及不同載藥量對軟膏性能的影響，優(yōu)選最佳處方。

2.4.1 增稠劑和TR-1用量的影響 考察不同增稠劑(硬脂酸、液體石蠟)的影響，與方法二比較，分別記為F1、F2、F3?？疾觳煌琓R-1(0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%)對軟膏整體性能的影響，分別記為N1，N2，N3，N4，N5。結(jié)果見表2。比較F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3可知加入硬脂酸，軟膏離心穩(wěn)定性較差，含量偏低；加入液體石蠟，軟膏離心穩(wěn)定性優(yōu)，但含量偏低。綜合考慮，不加增稠劑比較好。乳化劑含量增加到0.8%以上時，其外觀以及離心穩(wěn)定性表現(xiàn)良好，結(jié)合成本，優(yōu)選TR-1含量為0.8%。

表2 增稠劑和乳化劑含量的影響

2.4.2 載藥量影響 制備載藥量為10%、12%、14%的MESA軟膏，記為T1、T2、T3。結(jié)果如圖1、表3，三個處方性能均較佳，故在10%～14%內(nèi)調(diào)整藥物投放量，對軟膏的綜合性能無影響。

圖1 不同載藥量軟膏外觀圖

表3 載藥量的影響

2.5 體外經(jīng)皮滲透實驗

2.5.1 體外透皮實驗 將預(yù)處理的大鼠皮膚固定于改良Franz擴(kuò)散池中，角質(zhì)層面向供給池，接受池中注入 pH=6.8的PBS溶液8 mL，排凈氣泡；擴(kuò)散池內(nèi)放入0.5 g樣品，分別為市售軟膏和自制水楊酸甲酯10%的軟膏，置透皮擴(kuò)散試驗儀中，(37.0±0.5) ℃ 恒溫水浴，攪拌轉(zhuǎn)速為120 r/min，于0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、10 h、12 h、24 h 吸取接收液1 mL，并補(bǔ)充相同體積PBS溶液，樣品過0.45 μm 濾膜，續(xù)濾液用 HPLC 法測定含量。

2.5.2 數(shù)據(jù)處理與分析 含量測定后，按照如下計算公式計算累積滲透量(Qn)，以累積滲透量(Qn)對時間(t)進(jìn)行線性回歸，回歸方程的斜率為滲透速率(Js) ，計算24 h的透過速度和Js。并用統(tǒng)計學(xué)方法(統(tǒng)計分組法)對實驗結(jié)果進(jìn)行處理分析。

V表示接收池體積(8 mL)；V0表示取樣體積(1 mL)；S為藥物擴(kuò)散時的有效透過面積(3.14 cm2)

結(jié)果顯示，在相同載藥量下，自制水楊酸甲酯軟膏的體外透皮累積滲透量是市售軟膏的1.70倍，說明TR-1能顯著促進(jìn)水楊酸甲酯的透皮性能。見圖2、表4。

圖2 加入TR-1的軟膏和市售水楊酸甲酯軟膏的透皮曲線圖

表4 加入TR-1的軟膏和市售水楊酸甲酯軟膏的透皮吸收試驗結(jié)果

3 討論

水楊酸甲酯軟膏因其可能會導(dǎo)致不良反應(yīng)且穩(wěn)定性較差，所以臨床應(yīng)用得到限制，而TR-1在乳劑系統(tǒng)中的最大優(yōu)點是具有乳化和穩(wěn)定雙重作用，能夠明顯提高藥物穩(wěn)定性及釋放率，且有較高的鋪展性。因此考慮應(yīng)用TR-1來制備軟膏是提高藥物穩(wěn)定性以及經(jīng)皮給藥的生物利用度的有效手段之一。TR-1對于軟膏劑具有良好的作用，與其分子中存在的親水和疏水部分使其具有乳化作用，且可在較大范圍內(nèi)調(diào)節(jié)兩相黏度有關(guān)。本實驗制備的水楊酸甲酯軟膏，透皮性能為市售相同載藥量的水楊酸甲酯復(fù)方軟膏的1.70倍。在應(yīng)用劑型方面，TR-1作為一種優(yōu)良的藥用合成高分子輔料既可作為乳化劑，用于外用O/W型乳劑，也可作為顆粒劑和片劑的黏合劑和在內(nèi)服或外用液體制劑中增黏等等，因此TR-1的應(yīng)用價值具有很大的開發(fā)潛能。如果把TR-1具體應(yīng)用到劑型研究應(yīng)用上，不僅可以解決某些劑型選擇上的不足，也能極大地提高藥物的生物利用度。