miRNA-30C減輕高糖誘導(dǎo)H9c2大鼠心肌細(xì)胞損傷研究

李欣欣，張明宇，田莉娜，郭素芬，吳 琦，張 欣，韓昊丞，成永霞

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院功能科，黑龍江 牡丹江 157011；3.佳木斯大學(xué)宏大醫(yī)院神經(jīng)外科，黑龍江 佳木斯 154005；4.佳木斯大學(xué)醫(yī)學(xué)部19級臨床醫(yī)學(xué)六班，黑龍江 佳木斯 154007)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)作為糖尿病引發(fā)的一種重要并發(fā)癥，其主要的病理特征為心臟肥大、心室結(jié)構(gòu)改變以及舒張和收縮功能障礙[1]。DCM會增加糖尿病患者心力衰竭的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，這主要是由于心肌細(xì)胞大量凋亡引發(fā)的[2]。心肌細(xì)胞凋亡與糖尿病心肌病密切相關(guān)，而p53與心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)[3]。MicroRNAs (miRNAs) 是一類單鏈小分子的非編碼單鏈RNA，通過與目標(biāo)mRNA 的3'-非翻譯區(qū) (3'-UTR) 結(jié)合，誘導(dǎo) mRNA 降解或翻譯抑制，從而對基因表達(dá)的調(diào)控具有顯著的影響[4]。有研究表明，miR-30c的高水平可以降低心肌細(xì)胞肥大，從而在糖尿病心肌代謝中具有保護(hù)作用[5]。有報(bào)道指出，miR-30c可以通過下調(diào)p53的表達(dá)，進(jìn)而降低心肌缺血再灌注損傷中心肌細(xì)胞凋亡的程度[6]。因此，我們將更近一步研究miR-30c通過調(diào)控p53減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡研究。

1 材料與方法

1.1 材料H9c2大鼠心肌細(xì)胞株(上海酶研生物科技有限公司)；DMEM(美國Gibico公司)和胎牛血清(德國 PAN公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；miR-30c mimics、mimics control和Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Primer試劑盒(廣州市銳博生物科技有限公司)；DCFH-DA、JC-1熒光探針和Annexin V檢測試(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；β-actin、p53、Bcl-2和Cleaved Caspase-3抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 H9c2大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理方法 將H9c2大鼠心肌細(xì)胞株在DMEM培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素)中培養(yǎng)。細(xì)胞置于5% CO2及37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。H9c2大鼠心肌細(xì)胞給予35 mM高糖(HG組)孵育48 h，5.0 mM葡萄糖處理48 h作為對照(NG組)。以每孔20000細(xì)胞密度接種于6孔板中，按照lipofectamineTM2000 操作說明進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，將miR-30c mimics和mimics control轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞給予35 mM HG孵育48 h。根據(jù)不同的處理方法將所有細(xì)胞分為四組：5.0 mM葡萄糖組(NG組)；35 mM葡萄糖刺激組(HG組)；轉(zhuǎn)染miR-30c mimics后再進(jìn)行35 mM葡萄糖刺激組(miR-30c mimics+HG組)；轉(zhuǎn)染mimics control再進(jìn)行35 mM葡萄糖刺激組(mimics control+HG組)。

1.2.2 miR-30c表達(dá)水平檢測方法 以每孔20000細(xì)胞的密度接種于6孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM制成單細(xì)胞懸液，在5% CO2及37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，把培養(yǎng)細(xì)胞的6孔板每孔換成2 mL無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，在HG組加入高糖培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，根據(jù)Total RNA Kit 說明書從培養(yǎng)細(xì)胞中分離獲得總RNA。并使用1 μg總RNA利用Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Primer試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再通過引物序列進(jìn)行擴(kuò)增。U6 為作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法分析miR-30c的相對表達(dá)量。

1.2.3 CCK-8細(xì)胞活性檢測 以每孔3000細(xì)胞的密度接種于96孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM制成單細(xì)胞懸液，在5% CO2及37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，把培養(yǎng)有細(xì)胞的96板每孔換成100 μL無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，HG組、mimics control+HG組、miR-30c mimics+HG組加入高糖培養(yǎng)48 h，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育1 h后，應(yīng)用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測光密度OD值。

1.2.4 DCFH-DA活性氧、JC-1線粒體膜電位與Annexin V細(xì)胞凋亡檢測方法 以每孔10000細(xì)胞的密度接種于激光共聚焦小皿中，用含10%胎牛血清的DMEM制成單細(xì)胞懸液，在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，向HG組、mimics control+HG組、miR-30c mimics+HG組加入高糖培養(yǎng)48 h，按照試劑盒操作說明進(jìn)行檢測，用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照，應(yīng)用Image J軟件對熒光圖片進(jìn)行半定量分析。

1.2.5 Western blot檢測 以每孔20000細(xì)胞的密度接種于6孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM制成單細(xì)胞懸液，在5% CO2及37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，把培養(yǎng)有細(xì)胞的6孔板每孔換成2 mL無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，向HG組、mimics control+HG組、miR-30c mimics+HG組加入高糖培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，離心棄上清，RIPA裂解液重懸細(xì)胞，在4 ℃冰箱搖床孵育5 min，4 ℃下12000 rpm離心10 min，取上清，Nano Drop 2000測濃度，用上樣緩沖液稀釋蛋白，100 ℃沸水中煮10 min，取40 μg蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)模、封閉、一抗β-actin、p53、Bcl-2和Cleaved Caspase-3(1∶1000)4 ℃孵育過夜、洗膜，二抗1∶10000室溫1 h，洗膜、顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0版軟件用于統(tǒng)計(jì)分析，采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)。兩個(gè)組以上的比較采用單向方差分析(ANOVA)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.01被認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 高糖對H9c2大鼠心肌細(xì)胞miR-30c的表達(dá)水平的影響與NG組相比，HG組處理的心肌細(xì)胞miR-30c的表達(dá)水平明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說明高糖環(huán)境會抑制miR-30c的表達(dá)。見表1。

表1 兩組大鼠心肌細(xì)胞中miR-30c的表達(dá)情況

2.2 轉(zhuǎn)染后H9c2大鼠心肌細(xì)胞miR-30c表達(dá)水平與mimics control+HG組相比，miR-30c mimics+HG組可以顯著的增加H9c2細(xì)胞中miR-30c的表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(P<0.001)，證明miR-30c轉(zhuǎn)染成功。見表2。

表2 轉(zhuǎn)染后兩組大鼠心肌細(xì)胞中miR-30c的表達(dá)情況

2.3 miR-30c過表達(dá)對高糖處理H9c2大鼠心肌細(xì)胞活力的影響與NG組相比，HG組顯著的抑制H9c2細(xì)胞的活力，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與mimics control+HG組相比，miR-30c mimics+HG組可以一定程度增加細(xì)胞的活力水平(P<0.01)。提示miR-30c對高糖處理的H9c2心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。見表3。

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞中細(xì)胞存活率的情況

2.4 miR-30c過表達(dá)對高糖處理H9c2大鼠心肌細(xì)胞活性氧水平的影響與NG組相比，HG組心肌細(xì)胞綠色熒光顯著增強(qiáng)，半定量結(jié)果顯示胞內(nèi)的活性氧水平顯著升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(P<0.001)；與mimics control+HG組相比，miR-30c mimics+HG組心肌細(xì)胞綠色熒光明顯減弱，半定量結(jié)果顯示胞內(nèi)的活性氧水平顯著被抑制，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(P<0.001)。以上結(jié)果表明miR-30c過表達(dá)可以抑制高糖誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細(xì)胞活性氧水平的升高。見圖1，表4。

圖1 DCFH-DA熒光探針檢測各組細(xì)胞活性氧的水平(×200)

表4 各組大鼠心肌細(xì)胞中活性氧相對熒光強(qiáng)度的表達(dá)情況

2.5 miR-30c過表達(dá)對高糖處理H9c2大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位水平的影響NG組紅色熒光較強(qiáng)，表明細(xì)胞線粒體功能較好，與NG組相比，HG組心肌細(xì)胞紅色熒光明顯減弱，半定量結(jié)果顯示細(xì)胞線粒體膜電位下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(P<0.001)；與mimics control+HG組相比，miR-30c mimics+HG組心肌細(xì)胞紅色熒光增強(qiáng)，半定量結(jié)果顯示細(xì)胞線粒體膜電位降低被改善，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明miR-30c過表達(dá)可以抑制高糖誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細(xì)胞線粒體功能障礙。見圖2，表5。

圖2 JC-1熒光探針檢測各組細(xì)胞線粒體膜電位的水平(×200)

表5 各組大鼠心肌細(xì)胞中線粒體膜電位相對熒光強(qiáng)度的表達(dá)情況

2.6 miR-30c過表達(dá)對高糖處理H9c2大鼠心肌細(xì)胞凋亡水平的影響與NG組相比，HG組心肌細(xì)胞的綠色熒光顯著增強(qiáng)，半定量結(jié)果顯示細(xì)胞發(fā)生凋亡增加，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(P<0.001)；與mimics control+HG組相比，miR-30c mimics+HG組心肌細(xì)胞綠色熒光明顯減弱，半定量結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡被抑制，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。以上結(jié)果表明miR-30c過表達(dá)可抑制高糖誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡反應(yīng)。見圖3，表6。

圖3 Annexin V熒光探針檢測各組細(xì)胞凋亡的水平(×200)

表6 各組大鼠心肌細(xì)胞中細(xì)胞凋亡相對熒光強(qiáng)度的表達(dá)情況

2.7 miR-30c過表達(dá)對高糖處理H9c2大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p53、Bcl-2和Cleaved Caspase-3的影響與NG組相比，HG組心肌細(xì)胞抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，促凋亡蛋白p53和Cleaved Caspase-3的表達(dá)明顯上調(diào)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(P<0.001)；與mimics control+HG組相比，miR-30c mimics+HG組心肌細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)上調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，促凋亡相關(guān)蛋白p53和Cleaved Caspase-3的表達(dá)顯著下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(P<0.001)。以上結(jié)果表明miR-30c過表達(dá)可負(fù)性調(diào)節(jié)p53蛋白，證明其可以減輕高糖誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細(xì)胞凋亡損傷。見圖4，表7。

圖4 Western blot檢測各組細(xì)胞p53、Bcl-2和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)情況

表7 各組大鼠心肌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、p53和Cleaved Caspase-3表達(dá)情況

3 討論

糖尿病心肌損傷的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程，盡管多數(shù)研究認(rèn)為高血糖是導(dǎo)致糖尿病心肌損傷的主要危險(xiǎn)因素，目前尚未完全了解誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的分子作用機(jī)制[7]。既往研究表明高血糖會導(dǎo)致p53的表達(dá)上調(diào)，從而引發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡與DCM的進(jìn)程密不可分[8]。糖尿病心肌病的代謝異常涉及多種機(jī)制，其中氧化應(yīng)激被認(rèn)為是重要的途徑之一，細(xì)胞內(nèi)ROS的水平可以反映細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的程度[9]。過量的 ROS 產(chǎn)生可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的線粒體功能障礙，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。線粒體的完整性對于維持線粒體的生物功能非常重要，線粒體功能障礙作為DCM 的一個(gè)重要特征，在異常糖脂暴露后，線粒體膜電位和細(xì)胞內(nèi) ATP 濃度降低，引起心臟組織和功能的損傷[10]。

miRNA是DCM發(fā)展的關(guān)鍵參與者[11]。大量的實(shí)驗(yàn)表明，miRNA可以通過調(diào)控其靶基因從而調(diào)節(jié)心肌纖維化、和線粒體功能障礙以及心肌細(xì)胞凋亡[12]。已有證據(jù)顯示miR-30c可以調(diào)控不同的通路及靶點(diǎn)在糖尿病心肌病和腎病中發(fā)揮著重要的作用[13-14]。在糖尿病模型的心臟組織中，miR-30c的表達(dá)受到抑制，提示miR-30c可能與糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[5]。有研究表明，miR-30c 可以通過靶向p53-p21 通路介導(dǎo)高血糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大和凋亡，但具體的作用機(jī)制還未完全闡明[13]。在本次研究中，我們證實(shí)了高糖環(huán)境可以抑制miR-30c的表達(dá)，引起細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累，轉(zhuǎn)染miR-30c可以緩解高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累以及線粒體的損傷。miR-30c可以通過調(diào)節(jié)p53的表達(dá)減少高糖誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞損傷、起到抗凋亡的作用，對心肌細(xì)胞凋亡有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，本研究確定了miR-30c在高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用，為DCM

的治療提供了一種新的策略，但是，miR-30c在線粒體功能的潛在作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。