姜黃素類似物H8對(duì)糖尿病大鼠腎臟炎癥和氧化應(yīng)激的改善

王 猛，張 蒙，楊 威，李嘉麗，高雪玲，袁曉環(huán)

(牡丹江醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人民生活質(zhì)量日漸提高，高糖高脂飲食、營(yíng)養(yǎng)過剩、缺乏運(yùn)動(dòng)等不良習(xí)慣導(dǎo)致糖尿病 (diabetes mellitus,DM) 患病率呈現(xiàn)出迅猛增長(zhǎng)的趨勢(shì)[1]。根據(jù)2015年至2017年中華醫(yī)學(xué)會(huì)的一項(xiàng)全國(guó)糖尿病流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)18歲以上人群糖尿病患病率已經(jīng)達(dá)到11.2%。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，同時(shí)也是引起終末期腎病(ESRD)的主要原因。流行病學(xué)研究表明，到2030年全球范圍內(nèi)DM患者將超過3億人，其中DN患者就將達(dá)到1億人[2]。糖尿病腎病不僅給患者帶來巨大痛苦還會(huì)造成巨額醫(yī)療費(fèi)用支出，由于該病的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，一旦發(fā)展到終末期，往往比其他腎臟疾病的治療更加棘手，因此，迫切需要尋找一種對(duì)糖尿病腎病有效的防治手段[3]。姜黃素( curcumin，Cur) 是從姜黃等姜科植物中提取的一種黃色酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化以及抗腫瘤等多種藥理作用，應(yīng)用前景十分廣泛，且已用于糖尿病腎病的治療，但姜黃素依然存在不足之處，表現(xiàn)為溶解度不高、穩(wěn)定性差、代謝較快等問題，這導(dǎo)致了其生物利用度較低[4]。本實(shí)驗(yàn)室以姜黃素為母體研發(fā)了姜黃素類似物H8，其分子量更小，性質(zhì)也更穩(wěn)定，相較于姜黃素有較高的生物利用度。已有前期實(shí)驗(yàn)表明H8具有改善胰島素敏感性和糖代謝的作用[5]。本實(shí)驗(yàn)通過建立2型糖尿病大鼠模型，探討姜黃素類似物H8對(duì)糖尿病腎臟炎癥和氧化應(yīng)激損傷的改善作用及機(jī)制，旨在為糖尿病腎病損傷的預(yù)防和治療提供新的思路和方法，也為糖尿病腎病損傷的新藥開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供的30只健康清潔級(jí)雄性SD大鼠(160～200 g)，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)2015- 0001。大鼠維持飼料(遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司)，高脂飼料(每100 kg含大鼠維持飼料73.6 kg，豬油15 kg，蛋黃粉10 kg，膽固醇1 kg，膽酸鈉0.1 kg，丙硫氧嘧啶0.1 kg，北京小黍有泰生物有限公司)。飼養(yǎng)于牡丹江醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物室，12 h光晝交替，溫度維持為20 ℃。本校倫理審查會(huì)已批準(zhǔn)此次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)操作。

1.1.2 試劑 H8(牡丹江醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院)，STZ、伊紅、蘇木素染色液(北京Solarbio公司)，檸檬酸、檸檬酸三鈉(天津恒興有限公司)，羧甲基纖維素鈉CMC-Na(上海aladdin公司)，mRNA提取試劑盒(美國(guó)Omega公司)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Roche公司)，兔源一抗TNF-α(北京Bioss公司)，鼠源一抗IL-6、兔源一抗IL-17、兔源一抗TGF-β1、兔源一抗NF-κB、兔源一抗 βactin(美國(guó)Abcam公司)，ECL特超敏顯色液(韓國(guó)Biosharp公司)，SYBR Green(美國(guó)Origene公司)，過氧化氫酶(CAT)試劑盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 儀器 包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)、生物顯微鏡(德國(guó)Leica公司)，臺(tái)式高速離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)，血糖儀(美國(guó)Roche公司)，全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)，超微量蛋白核酸測(cè)定儀(美國(guó)Thermo公司)，熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，超靈敏多功能成像儀(美國(guó)Genera Electric公司)，紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立與分組 將30只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為對(duì)照組、模型組及H8組，n=10。對(duì)照組給予正常維持飼料飼養(yǎng)，模型組和H8組則給予高脂飼料飼養(yǎng)。8周后，模型組和H8組大鼠腹腔注射STZ(25 mg/kg)溶液；對(duì)照組大鼠腹腔注射等劑量的檸檬酸緩沖液。48 h后連續(xù)3 d測(cè)定大鼠空腹血糖，若血糖值大于11.1 mmol/L則表示成功建立2型糖尿病模型。配置濃度為6 mg/mL的H8溶液(溶于1% CMC-Na)，H8組大鼠以H8(6 mg/kg)溶液每日灌胃；對(duì)照組和模型組以等量1% CMC-Na溶液每日灌胃，干預(yù)4周。在處死大鼠前第3天將各組大鼠置于代謝籠中1 d，禁食且不禁水，收集24 h尿液，離心(3000×g，20 min)，取上清液備用。末次給藥后禁食14 h，稱重，麻醉后以眥眼法取血，離心(5000×g，10 min)，取上清液備用。

1.2.2 生化指標(biāo)檢測(cè) 全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中CR、UR、UA水平和尿液中UmAlb、UNAG，血糖儀測(cè)定GLU水平。

1.2.3 Real-time PCR法檢測(cè)腎組織TNF-α、IL-6、IL-17、TGF-β1、NF-κB基因的表達(dá) 提取大鼠腎組織總mRNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行real-time PCR。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，53 ℃～60 ℃退火30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。引物列表詳見表1。

表1 基因引物序列表

1.2.4 Western blot法檢測(cè)腎組織中TNF-α、IL-6、IL-17、TGF-β1、NF-κB蛋白的表達(dá) 提取大鼠腎組織總蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后加入相應(yīng)一抗 ( Anti-TNF-α 1∶1000、Anti-IL-6 1∶1000、Anti-IL-17 1∶1000、Anti-TGF-β 1∶1000、Anti-NF-κB 1∶1000抗體)，在4 ℃環(huán)境下孵育過夜，用TBST洗膜后用相對(duì)應(yīng)的二抗(辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體1∶10000、辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體1∶10000) 常溫孵育，再次洗膜后，于膜上均勻滴加ECL顯色液顯色，分析各組結(jié)果的灰度值。

1.2.5 腎組織病理形態(tài)學(xué)檢測(cè) 取大鼠腎組織置于10%甲醛溶液中固定，梯度乙醇溶液脫水，包埋后切片，厚度約為5 μm，進(jìn)行HE染色、PAS染色，中性樹脂封片，于正置顯微鏡下觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.2.6 腎組織氧化應(yīng)激損傷檢測(cè) 檢測(cè)腎組織中過氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)的含量，取大鼠腎組織研磨并制成10%的組織勻漿。計(jì)算勻漿液濃度后，采用紫外分光光度法，按照試劑盒說明書操作，測(cè)定各組光密度(OD)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用單因素方差分析法進(jìn)行多組間比較，采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行事后兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重和生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組大鼠體重減輕，血清中GLU、CR、UR、UA水平均升高(P<0.05，P<0.01，P<0.001)；與模型組比較，H8組大鼠體重?zé)o明顯變化，血清中GLU、CR、UR、UA水平均降低(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠體重及血液生化指標(biāo)

與對(duì)照組比較，模型組大鼠尿液中UmAlb、UNAG水平均升高(P<0.01)；與模型組比較，H8組大鼠尿液中UmAlb、UNAG水平均降低(P<0.01)，見表3。

表3 各組大鼠尿液生化指標(biāo)

2.2 各組大鼠腎組織中TNF-α、IL-6、IL-17、TGF-β1、NF-κB基因表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織TNF-α、IL-6、IL-17、TGF-β1、NF-κB mRNA表達(dá)增加(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，與模型組比較，H8組大鼠腎組織中TNF-α、IL-6、IL-17、TGF-β1、NF-κB mRNA表達(dá)減少(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織中TNF-α、IL-6、IL-17、TGF-β1、NF-κB mRNA表達(dá)情況

2.3 各組大鼠腎組織中TNF-α、IL-6、IL-17、TGF-β1、NF-κB 蛋白表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織TNF-α、IL-6、IL-17、TGF-β1、NF-κB蛋白表達(dá)增加(P<0.05，P<0.01，P<0.001)；與模型組相比，H8組大鼠腎組織中TNF-α、IL-6、IL-17、TGF-β1、NF-κB蛋白表達(dá)減少(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織中TNF-α、IL-6、IL-17、TGF-β1、NF-κB 蛋白表達(dá)情況

2.4 各組大鼠腎組織中CAT、T-SOD、GSH-PX、MDA含量的測(cè)定結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織中CAT、T-SOD、GSH-PX水平降低，MDA水平升高(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，與模型組比較，H8組大鼠腎組織中CAT、T-SOD、GSH-PX水平升高，MDA水平降低(P<0.05，P<0.01)，見圖3。

圖3 各組大鼠腎組織中CAT、T-SOD、GSH-PX、MDA的含量

2.5 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)變化HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠腎組織中細(xì)胞數(shù)量正常，腎小球各項(xiàng)形態(tài)健康；與對(duì)照組相比，模型組大鼠腎組織中細(xì)胞數(shù)量減少，球囊腔明顯擴(kuò)大;與模型組相比，H8組大鼠腎組織中細(xì)胞數(shù)量增加，球囊腔輕度擴(kuò)大，見圖4。

圖4 各組大鼠腎組織HE染色圖(×400)

PAS染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)與形態(tài)均正常，無顯著病理改變；與對(duì)照組相比，模型組大鼠腎組織中系膜基質(zhì)增多，球囊腔擴(kuò)大;與模型組相比，H8組大鼠腎組織中系膜基質(zhì)增多情況有所改善，球囊腔輕度擴(kuò)大，見圖5。

圖5 各組大鼠腎組織PAS染色圖(×400)

3 討論

糖尿病腎病是一種較為嚴(yán)重的糖尿病并發(fā)癥，其發(fā)生機(jī)制主要與血液中持續(xù)的高糖水平有關(guān)，高血糖可導(dǎo)致腎臟出現(xiàn)局部炎癥及氧化應(yīng)激損傷，腎小球、腎小管的增生肥大標(biāo)志著早期DN的形成，腎臟功能發(fā)生異常，進(jìn)一步導(dǎo)致腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化等不可逆損傷的出現(xiàn)，最終造成終末期腎功能衰竭[6]。本實(shí)驗(yàn)室前期已通過實(shí)驗(yàn)探究了不同濃度的H8對(duì)大小鼠糖尿病的影響，基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故選用6 mg/kg劑量的H8進(jìn)行此次實(shí)驗(yàn)研究[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中CR、UR、UA水平升高，尿液中UmAlb、UNAG水平升高，腎臟組織中TNF-α、IL-6、IL-17、TGF-β1、NF-κB基因及蛋白水平過表達(dá)，CAT、T-SOD、GSH-PX水平降低，MDA水平升高，且腎小球形態(tài)異常，腎組織存在明顯的病理形態(tài)學(xué)損傷。與模型組相比，經(jīng)H8給藥后的糖尿病大鼠血清中CR、UR、UA水平降低，尿液中UmAlb、UNAG水平降低，炎癥和氧化應(yīng)激損傷情況減輕，腎小球形態(tài)趨于正常，腎組織病理形態(tài)學(xué)損傷減輕，提示姜黃素類似物H8可對(duì)糖尿病大鼠腎臟起保護(hù)作用。

在臨床中常用UmAlb、UNAG、CR、UR、UA作為檢測(cè)腎功能的指標(biāo)。腎小球損傷后其基膜通透性降低，白蛋白過量排出，因此尿微量白蛋白水平是判斷早期腎臟病變的重要標(biāo)準(zhǔn)[8]。腎小管上皮細(xì)胞的溶酶體中存在大量尿N-乙酰-β氨基葡萄糖苷酶，其排泄較為穩(wěn)定，而腎急性損傷發(fā)生時(shí)會(huì)增加該酶的活度，導(dǎo)致其在尿中的水平升高[9]。腎小球?yàn)V過率(glomerular filtration rate,GFR)可用來診斷早期腎功能衰退情況，其中血肌酐是評(píng)價(jià)GFR的重要指標(biāo)，血肌酐值較高往往標(biāo)志著腎臟功能損傷[10]。尿素主要由腎小球?yàn)V過以尿液的形式排出體外，在機(jī)體代謝循環(huán)穩(wěn)定時(shí)，血清中尿素的濃度由腎臟功能決定，所以血尿素值也可以反應(yīng)GFR的情況[11]。機(jī)體內(nèi)約70 %的尿素都經(jīng)由腎臟排出，若體內(nèi)血尿素含量異常升高，可說明腎小球?yàn)V過能力下降，提示腎臟功能出現(xiàn)損傷。血尿酸在腎中經(jīng)重吸收作用，絕大部分均由腎小球?yàn)V過而從尿液中排出體外，當(dāng)GFR降低時(shí)，血尿酸排出能力下降，其在血清中的濃度也將異常升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H8組大鼠UmAlb、UNAG、CR、UR、UA水平相較于模型組均降低，提示H8可以發(fā)揮對(duì)腎臟損傷的保護(hù)作用。

有研究表明核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號(hào)通路是炎癥反應(yīng)發(fā)生的重要途徑之一，該通路的過渡激活與機(jī)體內(nèi)持續(xù)性的高血糖環(huán)境相關(guān)，體內(nèi)的高糖環(huán)境將產(chǎn)生過量的晚期糖化終產(chǎn)物，這可促進(jìn)NF-κB及其下游炎癥信號(hào)如TNF-α、IL-6、TGF-β1的過表達(dá)，加重炎癥反應(yīng)發(fā)生[12]。IL-17作為早期炎性反應(yīng)啟動(dòng)因子,可誘導(dǎo)激活T細(xì)胞、上皮細(xì)胞從而產(chǎn)生IL-6等炎性細(xì)胞因子來放大炎癥反應(yīng)[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H8組大鼠腎臟組織中TNF-α、IL-6、IL-17、TGF-β1、NF-κB的基因及蛋白水平較模型組均下降，提示為H8可以通過改善糖尿病大鼠腎臟組織炎癥反應(yīng)來發(fā)揮其對(duì)腎臟損傷的保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激(Oxidative Stress,OS)是一種機(jī)體內(nèi)氧化反應(yīng)與抗氧化反應(yīng)不平衡，從而導(dǎo)致氧自由基產(chǎn)生過多的現(xiàn)象，這將造成體內(nèi)的過氧化環(huán)境，該環(huán)境下會(huì)破壞細(xì)胞修復(fù)進(jìn)程，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，氧化應(yīng)激反應(yīng)與晚期糖化終產(chǎn)物也同樣是機(jī)體衰老、炎癥發(fā)生等慢性疾病的重要誘因。抗氧化系統(tǒng)可清除氧自由基，機(jī)體的氧化損傷程度可以由CAT、T-SOD、GSH-Px等酶類抗氧化物的活性來反應(yīng)[14]。氧自由基可與細(xì)胞膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并形成脂質(zhì)過氧化酸MDA，其不但能攻擊線粒體并造成線粒體損傷，也能對(duì)生物膜造成損害。且有研究表明早期DN患者的腎臟中MDA水平顯著增高，腎臟對(duì)抗氧化反應(yīng)功能的異常，MDA水平可反應(yīng)機(jī)體中細(xì)胞氧化損傷的程度[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，H8組大鼠腎臟組織中CAT、T-SOD、GSH-PX的水平升高且MDA水平下降，表明 H8 可改善糖尿病大鼠腎臟的氧化損傷程度。

綜上所述，姜黃素類似物H8可對(duì)糖尿病大鼠腎臟產(chǎn)生保護(hù)作用，其一方面可以通過改善腎臟炎癥起作用，另一方面則可能與改善腎臟氧化損傷相關(guān)。