高脂飲食和酒精依賴對(duì)大鼠記憶及前額葉TGF-β/Smad通路的影響

江清梅，尹昌浩，朱曉峰

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)三科；3.黑龍江省缺血性腦卒中防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 牡丹江 157011)

酒精及高脂飲食的過(guò)度食用通常始于青春期，已經(jīng)成為一個(gè)重要的全球健康問(wèn)題，其相關(guān)的并發(fā)癥逐漸備受大眾關(guān)注[1]。青少年酒精暴露會(huì)導(dǎo)致大腦結(jié)構(gòu)和功能的改變，從而導(dǎo)致行為改變，如焦慮增加、酗酒傾向或認(rèn)知缺陷[2]。約30%～80%酒精依賴的患者有認(rèn)知障礙[3]。在大量的動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)，慢性酒精攝入、高脂飲食造成顯著的學(xué)習(xí)記憶損傷、感覺(jué)運(yùn)動(dòng)障礙和神經(jīng)炎癥增加[4]。在一項(xiàng)針對(duì)酒精依賴患者執(zhí)行認(rèn)知任務(wù)的功能磁共振成像研究中，該類患者表現(xiàn)出認(rèn)知網(wǎng)絡(luò)(PFC、紋狀體、小腦)的激活較低[5]，說(shuō)明酒精相關(guān)認(rèn)知障礙與PFC存在重要的聯(lián)系，但這種聯(lián)系的具體機(jī)制仍不明確。

TGF-β(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β)是一個(gè)多效性超家族，有三種亞型(TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)，參與發(fā)育、疾病和組織修復(fù)關(guān)鍵步驟的調(diào)節(jié)。最近的發(fā)現(xiàn)表明，患有癡呆的患者的大腦中TGF-β1的含量異常增加，在這些患者的大腦中，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子、趨化因子和自由基可能會(huì)促進(jìn)炎癥、氧化狀態(tài)和TGF-β1的慢性過(guò)度分泌，從而促進(jìn)微血管變性[6-7]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谕ㄟ^(guò)建立高脂飲食及酒精依賴大鼠模型，觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化情況，通過(guò)檢測(cè)PFC中TGF-β1、Smad3、Smad4表達(dá)情況探討其發(fā)病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組及造模8周齡(200±20)g雄性SD大鼠24只[由牡丹江醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SYXK(黑)2019-006]，室溫(20±2)℃，光照/黑暗比例12 h∶12 h。經(jīng)過(guò)適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按隨機(jī)區(qū)組法將大鼠分為對(duì)照組(control，n=8)、酒精組(alcohol，n=8)、酒精+高脂飲食組(alcohol+HFD，n=8)。對(duì)照組、酒精組給予正常飼料，酒精+高脂組給予高脂高糖飲食(66.5%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+1%膽鹽)，因高脂高糖飼料相對(duì)硬度不夠，故兩天更換一次糧食并給予大鼠磨牙棒；各組均采用單瓶自由飲方式攝入液體，對(duì)照組飲用無(wú)菌水，酒精組、酒精+高脂飲食組第1周飲用3%的酒精，之后逐漸增加酒精濃度，即每周增加3%，直至第4周增加至12%[8]。

1.2 主要試劑及儀器高脂高糖飼料(小黍有泰生物科技有限公司,北京)，伊紅染色液(索萊寶G1100)，蘇木素染色液(索萊寶G1140)，β-Actin(Cell Signaling#8457T)，P-Smad3一抗(Cell Signaling#9520)，SMAD4一抗(Cell Signaling#46535)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(碧云天A0208)，Morris水迷宮(成都泰盟軟件有限公司)，正置顯微鏡(德國(guó)徠卡公司)，超靈敏多功能成像儀(美國(guó)GE公司)。

1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)在造模28 d后，各組大鼠進(jìn)行為期7 d的Morris水迷宮(直徑120 cm，高50 cm)實(shí)驗(yàn)，包括：(1)定位航行訓(xùn)練：訓(xùn)練歷時(shí)6 d，每天上午、下午各一次。實(shí)驗(yàn)員將大鼠從水迷宮任意象限面朝池壁入水，大鼠由入水至站立平臺(tái)(不可見(jiàn))的時(shí)間為潛伏期，限時(shí)60 s，電腦通過(guò)監(jiān)視系統(tǒng)追蹤大鼠位置記錄游行路線，當(dāng)大鼠發(fā)現(xiàn)平臺(tái)后，讓其在平臺(tái)上站立15 s。若未找到平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)員則引導(dǎo)大鼠至平臺(tái)停留15 s，熟悉周圍環(huán)境。每只大鼠實(shí)驗(yàn)后均用毛巾擦拭或吹風(fēng)機(jī)給予暖風(fēng)處理，防治動(dòng)物感冒等不良事件。(2)空間探索試驗(yàn)：第7天撤掉水下平臺(tái)，取隨機(jī)一點(diǎn)投大鼠入水，通過(guò)監(jiān)控記錄大鼠60 s內(nèi)第一次到達(dá)原平臺(tái)位置的時(shí)間及穿越平臺(tái)的次數(shù)。

1.4 解剖大鼠PFC組織各組大鼠完成Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)后，腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL/100g)進(jìn)行麻醉，取PFC，每組各取2只大鼠的PFC由4%多聚甲醛進(jìn)行固定，其余PFC由-80 ℃冰箱進(jìn)行保存，完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 顯微鏡觀察大鼠PFC神經(jīng)元結(jié)構(gòu)4%多聚甲醛固定72 h后經(jīng)梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下拍照記錄各組大鼠PFC神經(jīng)元結(jié)構(gòu)。

1.6 ELISA檢測(cè)各組大鼠PFC組織中TGF-β1含量從-80 ℃冰箱取出各組PFC組織，由預(yù)冷的PBS清洗，稱取15 mg，按照1∶9的重量體積比量取含有蛋白酶抑制劑的PBS，于冰上充分研磨，離心，取上清，在TGF-β1包被的微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣本、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)37 ℃溫育及洗板、顯色，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，計(jì)算樣品濃度。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)PFC中P-Smad3、Smad4的表達(dá)用預(yù)冷的PBS清洗各組PFC20 mg，按照1:10的比例加入含有蛋白酶、磷酸酶抑制劑的裂解液，離心、取上清，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)各組織蛋白濃度，用蛋白上樣緩沖液將各組蛋白濃度配平后煮沸變性，進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉1 h，用P-Smad3一抗(1∶1000)、Smad4一抗(1∶1000)和抗β-actin抗體(1∶1000)孵育過(guò)夜。洗膜后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶1000)孵育1 h，洗膜后涂加顯色劑、曝光。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 24.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其圖像分析測(cè)量軟件為 Image J，計(jì)量數(shù)據(jù)表示為“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”。多組比較采用單因素方差分析(ANOVA)后進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食、酒精依賴對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響在定位航行訓(xùn)練中，每組潛伏期逐漸縮短，但每天酒精組、酒精+高脂組大鼠的潛伏期較對(duì)照組均延長(zhǎng)，在第6天時(shí)與對(duì)照組潛伏期相比，酒精組(P=0.034)、酒精+高脂組(P=0.022)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)?？臻g探索試驗(yàn)中，記錄到對(duì)照組經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)為(6.00±0.91)次，酒精組經(jīng)過(guò)平臺(tái)(4.25±0.53)次，酒精+高脂組大鼠經(jīng)過(guò)(3.60±0.46)次；結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，酒精+高脂組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018)，表明酒精、酒精+高脂對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力造成了損害作用。

表1 各組大鼠定位航行訓(xùn)練潛伏期

2.2 顯微鏡觀察大鼠PFC神經(jīng)元結(jié)構(gòu)HE染色觀察各組PFC結(jié)果顯示，對(duì)照組錐體細(xì)胞數(shù)量多，排列整齊緊密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，核圓且大；酒精組錐體細(xì)胞數(shù)量有所減少，部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)深染，結(jié)構(gòu)不規(guī)則，胞核染色不清晰；酒精+高脂組錐體細(xì)胞數(shù)量明顯減少且形態(tài)不規(guī)則，神經(jīng)元細(xì)胞深染較多，說(shuō)明酒精及高脂飲食對(duì)大鼠PFC神經(jīng)元細(xì)胞造成了嚴(yán)重?fù)p傷(圖1)。

圖1 各組大鼠前額葉HE染色對(duì)比圖(×200)

2.3 酒精及高脂飲食對(duì)大鼠前額葉TGF-β1水平的影響本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組、酒精組、酒精+高脂組大鼠前額葉TGF-β1表達(dá)分別為(1578.75±136.25)pg/mL、(3031.81±431.17)pg/mL、(3824.17±113.04)pg/mL。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，與對(duì)照組相比，酒精組(P=0.043)、酒精+高脂組(P=0.006)大鼠PFC的TGF-β1表達(dá)水平顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 酒精及高脂飲食對(duì)大鼠前額葉皮質(zhì)P-Smad3、Smad4水平的影響在檢測(cè)各組P-Smad3表達(dá)中,觀察到對(duì)照組、酒精組、酒精+高脂組大鼠的表達(dá)呈上升趨勢(shì)，酒精+高脂組大鼠的P-Smad3表達(dá)與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.035)(圖2A、2B)；檢測(cè)Smad4中，與對(duì)照組相比，同樣是酒精+高脂組大鼠的Smad4表達(dá)呈上升趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011)(圖2A、2C)。

圖2 酒精及高脂飲食對(duì)大鼠前額葉P-Smad3、Smad4水平的影響

3 討論

人們?cè)诖罅繑z入高脂飲食及酒精的情況下，直接導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)的抑制、腦血管功能的改變和神經(jīng)毒性，使得早發(fā)型認(rèn)知障礙的出現(xiàn)[9]。在本研究中，大鼠在飲酒、高脂飲食28 d后，進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，酒精組、酒精+高脂組記憶力較對(duì)照組有不同程度損傷，酒精+高脂組損傷較為顯著，說(shuō)明在危險(xiǎn)因素雙重壓力下，認(rèn)知能力受損比單個(gè)危險(xiǎn)因素要嚴(yán)重。與既往研究一致，Woods AJ等人[10]研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論患者年齡大小，既往或現(xiàn)在有酒精依賴史的人都有明顯的神經(jīng)認(rèn)知障礙，在學(xué)習(xí)、記憶、運(yùn)動(dòng)功能和注意力、任務(wù)執(zhí)行功能等方面存在明顯的損傷，并證實(shí)這樣整體認(rèn)知障礙的癥狀與終生酒精依賴史相關(guān)。一項(xiàng)針對(duì)1159名中國(guó)老年人的縱向研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期高脂飲食造成了總膽固醇和低密度脂蛋白水平升高，這與認(rèn)知能力加速下降之間存在關(guān)聯(lián)[11]。

PFC似乎對(duì)酒精誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性變特別敏感，在本研究中，分別對(duì)3個(gè)組的PFC進(jìn)行HE染色，鏡下觀察到與對(duì)照組相比，2個(gè)模型組神經(jīng)元數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，存在凋亡細(xì)胞，表明酒精、酒精+高脂對(duì)大鼠PFC造成了明顯的損傷。既往研究表明，大鼠長(zhǎng)期攝入酒精及暴飲暴食導(dǎo)致PFC星形膠質(zhì)細(xì)胞突起范圍減少[12]。在一項(xiàng)基于體視學(xué)系統(tǒng)對(duì)酒精對(duì)大鼠PFC區(qū)域的體積、面積估計(jì)的研究中，觀察到長(zhǎng)期飲酒導(dǎo)致PFC和前扣帶回體積減少，PFC平均神經(jīng)元體積減少且神經(jīng)元總體積減少[13]。另一項(xiàng)動(dòng)物研究中，將幼年大鼠暴露于高脂飲食中，發(fā)育階段PFC發(fā)生的變化，影響社會(huì)記憶和可塑性，表明青少年時(shí)期急性攝入高脂飲食與PFC、社會(huì)記憶受損有關(guān)，并與PFC氧水平降低有關(guān)[14]。

酒精及高脂飲食對(duì)中樞神經(jīng)的影響，其機(jī)制研究備受人們關(guān)注。TGF-β1通過(guò)Smad家族的磷酸化蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周器官之間充當(dāng)信號(hào)介質(zhì)，調(diào)節(jié)大腦的認(rèn)知功能機(jī)制，其在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用受到了廣泛關(guān)注。在一項(xiàng)關(guān)于的星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)阿爾茲海默病的病理機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，淀粉樣蛋白前體變性與TGF-β/ Smad信號(hào)激活有關(guān)，促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、淀粉樣斑塊形成和認(rèn)知障礙加重，表明TGF-β/Smad信號(hào)激活與認(rèn)知功能損害和淀粉樣斑塊積聚有必然的聯(lián)系[15]。本實(shí)驗(yàn)與既往研究結(jié)果一致，在探究酒精、酒精+高脂飲食對(duì)大鼠認(rèn)知功能造成明顯損傷作用后，繼續(xù)采用ELISA、Western blotting法對(duì)大鼠PFC中的TGF-β1、P-Smad3、Smad4進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示隨著危險(xiǎn)因素疊加的對(duì)認(rèn)知損害嚴(yán)重程度的增加。大鼠PFC中的TGF-β1、P-Smad3、Smad4表達(dá)逐漸增加，可能是酒精、高脂飲食刺激了前額葉TGF-β/ Smad通路的過(guò)度表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)化合物的積累和腦血管粥樣硬化及β-淀粉樣蛋白積聚[6]，導(dǎo)致認(rèn)知障礙。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)觀察了28 d給予大鼠酒精、高脂飲食+酒精喂養(yǎng)后，對(duì)大鼠認(rèn)知行為的改變及PFC神經(jīng)元變化情況，并觀察到PFC內(nèi)炎癥因子TGF-β1、P-Smad3、Smad4表達(dá)與認(rèn)知障礙程度呈正相關(guān)，可能與TGF-β/Smad信號(hào)通路激活造成大腦中的β-淀粉樣蛋白沉積和神經(jīng)炎性斑塊聚集，加重學(xué)習(xí)和記憶障礙，本研究為預(yù)防高脂飲食及酒精依賴相關(guān)認(rèn)知障礙提供了更精準(zhǔn)的分子靶點(diǎn)，未來(lái)可能通過(guò)抑制外周及中樞神經(jīng)組織中的TGF-β/Smad信號(hào)通路的異常增高，來(lái)達(dá)到預(yù)防和治療認(rèn)知障礙的目的。