基于PRRSV ORF5基因TaqMan qPCR檢測(cè)方法的建立及遺傳變異分析

張 帥，趙云環(huán)，劉 瑩，翟 剛，郭 禹，劉 濤，左玉柱，2*，范京惠，2* (.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 0700；2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 0700)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一種烈性傳染病，臨床上多表現(xiàn)為不同年齡段豬只的發(fā)熱、出血、呼吸道癥狀以及母豬流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)弱胎等為特征的繁殖障礙，該病可產(chǎn)生免疫抑制繼發(fā)其他細(xì)菌和病毒感染[1]。PRRSV是一種易于發(fā)生變異和重組的單股正鏈RNA病毒，呈二十面體結(jié)構(gòu)，其基因組全長約為15 kb，至少包含10個(gè)開放閱讀框(ORF)。其中GP5蛋白是病毒的囊膜糖蛋白，也是病毒最易變異的結(jié)構(gòu)蛋白之一[2]，由ORF5基因編碼，在病毒復(fù)制、感染機(jī)體、誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體中發(fā)揮重要作用[3]。ORF5基因能反映PRRSV的遺傳變異情況，也是PRRSV基因組分型的主要依據(jù)。近年來，高致病性毒株(HP-PRRSV)、NADC30-like PRRSV以及重組毒株的出現(xiàn)，使得PRRSV流行毒株呈現(xiàn)多樣性和復(fù)雜性，使之防控的難度也大大增加，嚴(yán)重影響了中國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[4]。中央一號(hào)文件多次強(qiáng)調(diào)，要加快構(gòu)建現(xiàn)代養(yǎng)殖體系，保護(hù)生豬基礎(chǔ)產(chǎn)能，健全生豬產(chǎn)業(yè)平穩(wěn)有序發(fā)展長效機(jī)制，由此可見國家對(duì)我國生豬養(yǎng)殖業(yè)的重視程度。目前已有多個(gè)檢測(cè)方法:紀(jì)愛英等[5]建立了普通PCR檢測(cè)方法，張杰等[6]建立了SYBR GreenⅠqPCR檢測(cè)方法，但均存在靈敏度低、耗時(shí)長等問題。由于PRRSV分型較多、容易變異、發(fā)病率高、防制尚無特效藥和高效疫苗[7]，且直接對(duì)疑似樣品ORF5基因進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增操作復(fù)雜，因此，在PRRS的防控方面，建立一種操作簡單、特異性強(qiáng)、靈敏度高、耗時(shí)短的通用型TaqMan qPCR檢測(cè)方法，優(yōu)先對(duì)豬場(chǎng)進(jìn)行PRRSV的快速全面篩查，再對(duì)陽性樣品進(jìn)行ORF5基因擴(kuò)增分析，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)豬場(chǎng)不同流行毒株的全面篩查和滿足豬場(chǎng)不同檢測(cè)目的的需求，在病原診斷和分析方面具有更廣闊的應(yīng)用前景。

綜上，本研究根據(jù)PRRSV經(jīng)典、高致病性和NADC30代表毒株的ORF5基因保守序列設(shè)計(jì)1對(duì)熒光引物和探針，建立了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡單的通用型TaqMan qPCR檢測(cè)方法，并對(duì)檢測(cè)為陽性的樣品進(jìn)行ORF5基因擴(kuò)增，不僅可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同毒株的檢測(cè)和病毒拷貝數(shù)準(zhǔn)確定量，還可以為豬場(chǎng)日常檢測(cè)和基因遺傳變異分析提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒及樣品PRRSV、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(RV)均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。34份臨床疑似樣品采集自出現(xiàn)發(fā)熱、咳喘、流產(chǎn)和死亡的規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)中發(fā)病豬的血液和脾臟、肺臟、淋巴結(jié)等組織臟器。

1.2 主要試劑DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：21FB0705)購自北京聚合美生物科技有限公司；DNA純化試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：351102201008)、質(zhì)粒小提試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：121102191017)購自杭州倍沃醫(yī)學(xué)科技有限公司；Fast TaqMan Mixture(生產(chǎn)批號(hào)：21FB1035)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；pMD19-T載體(生產(chǎn)批號(hào)：AL12052A)、DL2000 DNA Marker(生產(chǎn)批號(hào)：21DB0215)購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)NCBI GenBank中PRRSV經(jīng)典毒株CH-1a(登錄號(hào)：AY032626)、高致病性毒株JXA1(登錄號(hào)：EF112445)和NADC30毒株(登錄號(hào)：JN654459)的ORF5基因保守序列，應(yīng)用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)通用型特異性熒光引物PRRSV-F/R與探針PRRSV-P和ORF5全基因擴(kuò)增引物ORF5-F/R(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 qPCR探針及引物

1.4 qPCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備提取PRRSV陽性樣品中的RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用引物PRRSV-F/R進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化回收后連接至pMD19-T載體上并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19T-PRRSV，PCR鑒定為陽性后由生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，作為qPCR標(biāo)準(zhǔn)品，通過Nanodrop 2000測(cè)定質(zhì)粒濃度，換算為質(zhì)粒拷貝數(shù)[8]。

1.5 qPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立通過設(shè)置不同變量(質(zhì)粒濃度、退火溫度)對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化；將標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋后，選取7個(gè)濃度(2.19×108～2.19×102拷貝/μL)作為模板，在最優(yōu)反應(yīng)條件下進(jìn)行TaqMan qPCR擴(kuò)增，并設(shè)立陰、陽性對(duì)照，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。對(duì)擴(kuò)增結(jié)果利用LightCycler 96軟件分析后建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 特異性試驗(yàn)用DNA/RNA提取試劑盒提取PRV、PCV2陽性樣品的DNA；PRRSV(高致病性毒株、經(jīng)典毒株、NADC30類毒株 )、PEDV、CSFV、TGEV、RV陽性樣品的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，在最優(yōu)反應(yīng)條件下進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，驗(yàn)證該方法的特異性[10]。

1.7 敏感性試驗(yàn)將倍比稀釋好的重組質(zhì)粒pMD19T-PRRSV作為模板在最優(yōu)反應(yīng)條件下進(jìn)行TaqMan qPCR擴(kuò)增，同時(shí)用普通PCR方法擴(kuò)增，對(duì)2種檢測(cè)方法得到的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比來驗(yàn)證本方法的敏感性。

中國特色社會(huì)主義道路，展開來說，是由一系列具體道路共同構(gòu)成的道路體系。從目前黨的文獻(xiàn)來看，涉及的具體道路主要包括：中國特色社會(huì)主義政治發(fā)展道路；中國特色社會(huì)主義文化發(fā)展道路；中國特色社會(huì)主義新型工業(yè)化、信息化、城鎮(zhèn)化、農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化道路；中國特色社會(huì)主義自主創(chuàng)新道路；中國特色反腐倡廉道路；和平發(fā)展道路；等等。這些具體道路，進(jìn)一步豐富了黨對(duì)中國特色社會(huì)主義道路的認(rèn)識(shí)。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)：將倍比稀釋好的重組質(zhì)粒pMD19T-PRRSV(2.19×108，2.19×105，2.19×102拷貝/μL)作為模板在最優(yōu)反應(yīng)條件下進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，每個(gè)濃度設(shè)立3個(gè)重復(fù)，根據(jù)每個(gè)濃度的Ct值計(jì)算組內(nèi)變異系數(shù)(CV)。

組間重復(fù)試驗(yàn)：將倍比稀釋好的重組質(zhì)粒pMD19T-PRRSV(2.19×108，2.19×105，2.19×102拷貝/μL)作為模板在最優(yōu)反應(yīng)條件下進(jìn)行3次qPCR擴(kuò)增，根據(jù)每個(gè)濃度的Ct值計(jì)算組間變異系數(shù)(CV)[11]。

1.9 臨床樣品的檢測(cè)對(duì)采集的34份疑似樣品提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，用本研究建立的TaqMan qPCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用本實(shí)驗(yàn)室建立的普通PCR方法進(jìn)行樣品檢測(cè)，比較2種方法檢測(cè)結(jié)果。

1.10 ORF5全基因的擴(kuò)增對(duì)檢出的PRRSV陽性樣品用ORF5-F/R進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化回收后由生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.11 ORF5基因進(jìn)化樹的構(gòu)建和氨基酸序列分析從NCBI GenBank上選取具代表性的毒株39條，用MEGA 7.0軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建，用DNAStar 7.0軟件進(jìn)行氨基酸序列同源性的比較和分析[12]。

2 結(jié)果

2.1 PRRSV重組質(zhì)粒pMD19T-PRRSV標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD19T-PRRSV作為模板，用合成的PRRSV-F/R進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，得到目的條帶大小為123 bp(圖1)，膠回收送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，結(jié)果均與預(yù)期相符，表明正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD19T-PRRSV標(biāo)準(zhǔn)品。經(jīng)測(cè)重組質(zhì)粒pMD19T-PRRSV濃度，換算成拷貝數(shù)為2.19×1010拷貝/μL。

M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對(duì)照；2.重組質(zhì)粒pMD19T-PRRSV圖1 重組質(zhì)粒pMD19T-PRRSV的PCR鑒定

2.2 qPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立經(jīng)優(yōu)化后確定了最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，TaqMan qPCR反應(yīng)體系為15.0 μL：2×Fast Probe Mixture 7.5 μL；PRRSV-F/PRRSV-R/PRRSV-P(10 μmol/L)各0.3 μL；RNase-Free ddH2O 5.1 μL；模板1.5 μL。最佳反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性10 s，56℃退火20 s，72℃延伸10 s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束收集熒光信號(hào)。

1～7.不同稀釋度的重組質(zhì)粒pMD19T-PRRSV(2.19×108～2.19×102 拷貝/μL)；8.陰性對(duì)照?qǐng)D2 不同稀釋梯度標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線(A)、qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(B)

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果用1.6中提取的核酸作為模板，設(shè)立陰性對(duì)照，用本研究建立的TaqMan qPCR在最優(yōu)反應(yīng)條件下檢測(cè)，結(jié)果(圖3)顯示，只有PRRSV檢測(cè)為陽性，其他核酸和陰性對(duì)照均為陰性；表明本研究建立的方法具有較高的特異性。

1.HP-PRRSV；2.CLASSIC-PRRSV；3.NADC30 PRRSV；4～9.PRV、PCV2、PEDV、CSFV、TGEV、RV；10.陰性對(duì)照?qǐng)D3 qPCR的特異性試驗(yàn)

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果將重組質(zhì)粒pMD19T-PRR-SV 10倍倍比稀釋后作為模板，進(jìn)行TaqMan qPCR和普通PCR方法擴(kuò)增檢驗(yàn)其敏感性。結(jié)果顯示，TaqMan qPCR檢測(cè)重組質(zhì)粒pMD19T-PRRSV最低檢測(cè)下限為2.19×101拷貝/μL(圖4A)，普通PCR方法檢測(cè)重組質(zhì)粒pMD19T-PRRSV最低檢測(cè)下限為2.19×103拷貝/μL(圖4B)；表明本研究建立的TaqMan qPCR檢測(cè)方法具有較高的敏感性。

A.qPCR的敏感性試驗(yàn)(1～8.不同稀釋度的pMD19T-PRRSV；9.陰性對(duì)照)；B.普通PCR的敏感性試驗(yàn)(M.DL2000 DNA Marker；a.陰性對(duì)照；b～i.不同稀釋度的pMD19T-PRRSV)圖4 qPCR的敏感性試驗(yàn)和普通PCR的敏感性試驗(yàn)

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果將倍比稀釋好的重組質(zhì)粒pMD19T-PRRSV(2.19×108，2.19×105，2.19×102拷貝/μL)作為模板在最優(yōu)反應(yīng)條件下用本研究建立的TaqMan qPCR進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)，并與本實(shí)驗(yàn)室建立的普通PCR檢測(cè)方法進(jìn)行比較，結(jié)果(表2)顯示：組內(nèi)和組間的變異系數(shù)均小于1%，也均低于本實(shí)驗(yàn)室建立的普通PCR檢測(cè)方法的組內(nèi)和組間的變異系數(shù)，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

表2 TaqMan qPCR的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果用本研究建立的TaqMan qPCR對(duì)來自河北省不同地區(qū)的34份疑似PRRS樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示陽性率為14.3%(5/34)，普通PCR檢測(cè)陽性率為8.9%(3/34)，TaqMan qPCR方法比普通PCR方法多檢測(cè)出2份陽性，經(jīng)膠回收測(cè)序鑒定均為PRRSV毒株，表明TaqMan qPCR檢測(cè)方法優(yōu)于普通PCR檢測(cè)方法，可應(yīng)用于臨床檢測(cè)。

2.7 ORF5全基因擴(kuò)增結(jié)果對(duì)檢出的陽性樣品利用ORF5-F/R進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示5份陽性，得到目的條帶大小為603 bp(圖5)，對(duì)PCR產(chǎn)物純化回收后由生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對(duì)照；2～6.CH/HB/BD01、CH/HB/BD02、CH/HB/BD03、CH/HB/BD04、CH/HB/CZ01圖5 陽性樣品ORF5基因擴(kuò)增結(jié)果

2.8 PRRSV ORF5基因遺傳進(jìn)化分析為了解本研究得到的5株P(guān)RRSV的遺傳特性，利用MEGA 7.0軟件對(duì)測(cè)序獲得的ORF5基因核苷酸序列與國內(nèi)外上傳到NCBI上的參考ORF5基因序列構(gòu)建分子遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果(圖6)顯示：整個(gè)進(jìn)化樹分為2支，1支為以VR-2332為代表的美洲型分支，另1支為以Lelystad為代表的歐洲型分支。美洲型又分為4個(gè)譜系，分別為以CH-1a、JXA1、HUN4為代表的譜系8；以VR-2332、BJ-4為代表的譜系5；以GM2、QYYZ為代表的譜系3；以NADC30為代表的譜系1[13]。本研究獲得的5株ORF5基因序列分布于3個(gè)譜系，其中3株CH/HB/BD01、CH/HB/BD02、CH/HB/BD03屬于譜系8(HP-PRRSV類)；1株CH/HB/BD04屬于譜系5(VR-2332類)；1株CH/HB/CZ01屬于譜系1(NADC30類)。

▲表示本研究毒株圖6 PRRSV陽性樣品ORF5基因的進(jìn)化樹分析

利用MegAlign軟件進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列同源性的比較和分析，結(jié)果顯示：5株陽性樣品ORF5基因之間相比核苷酸序列同源性在82.9%～99.8%之間，氨基酸序列同源性在82.1%～99.0%之間；與CH-1a等經(jīng)典毒株相比氨基酸同源性在84.6%～91.0%之間；與JXA1、HuN4、HUB2等高致病性毒株相比氨基酸同源性在84.6%～96.0%之間；與NADC30毒株相比氨基酸同源性在84.1%～94.5%之間；其中，CH/HB/BD01、CH/HB/BD02、CH/HB/BD03與JXA1和HuN4同源性最高，高達(dá)96.0%；CH/HB/BD04與VR-2332同源性最高，高達(dá)96.1%；CH/HB/CZ01與NADC30同源性最高，高達(dá)94.5%[14]。

2.9 PRRSV GP5蛋白氨基酸分析利用MegAli-gn 軟件進(jìn)行氨基酸序列比較和分析，結(jié)果(圖7)顯示：ORF5基因編碼200個(gè)氨基酸，沒有氨基酸的插入與缺失，突變主要集中于信號(hào)肽區(qū)(1～31 aa)和高變區(qū)(HVR)，在60～90、129～150 aa相對(duì)保守。在譜系8中，信號(hào)肽區(qū)(1～31 aa)存在4個(gè)氨基酸突變，高變區(qū)(HVR2)存在2個(gè)氨基酸突變，B細(xì)胞表位(37～45 aa)的第39位突變?yōu)楫惲涟彼?；在譜系5中，信號(hào)肽區(qū)(1～31 aa)存在5個(gè)氨基酸突變，高變區(qū)(HVR1、HVR2)存在2個(gè)氨基酸突變，抗原表位a(27～30 aa)存在1個(gè)氨基酸突變，其他抗原表位出現(xiàn)3個(gè)氨基酸突變；在譜系1中，信號(hào)肽區(qū)(1～31 aa)存在2個(gè)氨基酸突變，高變區(qū)(HVR2)存在3個(gè)氨基酸突變，3個(gè)抗原表位存在5個(gè)氨基酸突變，可見，譜系8中的3株變異程度最高，特別是在信號(hào)肽區(qū)和2個(gè)高變區(qū)，導(dǎo)致病毒免疫逃逸從而發(fā)病[15]。

圖7 ORF5基因推導(dǎo)氨基酸序列分析

3 討論

PRRSV至今仍是全球養(yǎng)豬生產(chǎn)中最重要的病原體之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV的遺傳多樣性和復(fù)雜性進(jìn)一步增加，其在本質(zhì)上是高度動(dòng)態(tài)化的：一方面，由于PRRSV在不斷快速進(jìn)化，產(chǎn)生新的變異，擴(kuò)大其多樣性，導(dǎo)致新發(fā)毒株和多株P(guān)RRSV在田間的流行迅速增加。此外，在全球范圍內(nèi)，除HP-PRRSV外，已有多項(xiàng)研究報(bào)道出現(xiàn)了新的2型PRRSV毒株成為主要毒株，如美國的PRRSV MN184和NADC30毒株、中國的NADC30類毒株，多個(gè)PRRSV毒株在養(yǎng)殖場(chǎng)的循環(huán)增加可能會(huì)降低疫苗的效力；另一方面，現(xiàn)代食品生產(chǎn)系統(tǒng)是超級(jí)傳播者，將病毒分布在全國甚至全世界，導(dǎo)致PRRS在全球范圍內(nèi)的流行，因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)PRRSV各個(gè)流行毒株的預(yù)防和控制[16]。本研究建立了一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、耗時(shí)短的通用型TaqMan qPCR檢測(cè)方法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)豬場(chǎng)不同流行毒株的全面篩查，并對(duì)篩查出的陽性樣品PRRSV ORF5基因進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析，以進(jìn)一步掌握豬場(chǎng)毒株流行情況和當(dāng)前地區(qū)遺傳變異規(guī)律，為PRRSV的科學(xué)防控提供參考。

當(dāng)前，用于PRRSV的檢測(cè)方法主要有普通PCR(RT-PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(LAMP)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、核酸探針雜交法(NHA)等，但常規(guī)PCR耗時(shí)長、特異性相對(duì)較低、早期診斷容易漏檢[17]；LAMP因其對(duì)環(huán)境要求嚴(yán)格，假陽性率較高[18]；ELISA相較于TaqMan qPCR則具有靈敏度較低、耗時(shí)長、成本高等缺點(diǎn)[19]；而NHA要求更高的技術(shù)含量，僅局限于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)無法用于大面積臨床診斷和現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用[20]。TaqMan qPCR的檢測(cè)結(jié)果更佳。TaqMan qPCR具有耗時(shí)短、操作簡易、靈敏性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)樣品檢測(cè)的同時(shí)還可以對(duì)其定量分析，因此可廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外的臨床檢測(cè)。

GP5是最易變異的糖基化結(jié)構(gòu)蛋白，其功能域包括N端信號(hào)肽、外膜區(qū)、跨膜區(qū)和內(nèi)域[21]。在本研究中，GP5蛋白的共同遺傳特征是核苷酸相似度較低，核苷酸取代度較高，中和表位A覆蓋第27～30位氨基酸，部分序列第27位由V突變?yōu)锳，這可能導(dǎo)致了中和表位A的改變，有研究表明，該區(qū)域的突變有助于機(jī)體對(duì)病毒誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗性[22]；中和表位B在誘導(dǎo)病毒中和抗體中起關(guān)鍵作用，該序列在不同基團(tuán)間具有較少的氨基酸取代，其中CH/HB/BD01、CH/HB/BD02、CH/HB/BD03在第38位由L突變?yōu)镮[2]。在這些病毒的GP5蛋白中，2個(gè)表位內(nèi)的氨基酸，特別是中和表位A，已經(jīng)偏移，可能導(dǎo)致引起的免疫應(yīng)答不能完全保護(hù)豬[23]。此外，高變區(qū)發(fā)生了大量的突變，可能導(dǎo)致GP5蛋白免疫原性喪失或改變，致使疫苗免疫效果減低或無效；2個(gè)T細(xì)胞表位存在不同數(shù)量的氨基酸的替換和取代，可能與疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫耐受有關(guān)，導(dǎo)致PRRSV控制無效[24]。本研究得到的5株P(guān)RRSV毒株分屬于3個(gè)不同的譜系，其中3株CH/HB/BD01、CH/HB/BD02、CH/HB/BD03與CH-1a、JXA1、HUN4同支，屬于譜系8；CH/HB/BD04與VR-2332同源性最高，同屬于譜系5；CH/HB/CZ01為NADC30類毒株，同屬于譜系1。由此可見，河北部分地區(qū)毒株流行的復(fù)雜性，不僅有高致病性毒株，還有NADC30類毒株以及變異毒株的出現(xiàn)，可能是復(fù)雜的飼養(yǎng)環(huán)境，頻繁的生豬運(yùn)輸和不當(dāng)?shù)囊N等原因造成的，使毒株變異頻發(fā)，給PRRS的防控帶來了極大的挑戰(zhàn)[25]，提示持續(xù)監(jiān)測(cè)PRRSV流行毒株的變異動(dòng)態(tài)的必要性。

PRRS作為危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一，毒株多樣化導(dǎo)致患病豬臨床表現(xiàn)多變和疫苗保護(hù)效力不佳，都給豬場(chǎng)的防控造成極大的困難[26]，本研究建立的通用型TaqMan qPCR檢測(cè)方法可以快速、高效、準(zhǔn)確地對(duì)豬場(chǎng)進(jìn)行PRRSV的臨床診斷和監(jiān)測(cè)，也可為引種等提供支持；同時(shí)結(jié)合全面篩查后的陽性樣品ORF5基因遺傳進(jìn)化分析對(duì)河北部分地區(qū)當(dāng)前的流行現(xiàn)狀情況和遺傳變異規(guī)律提供了補(bǔ)充，也為一種安全、高效、對(duì)不同PRRSV譜系具有廣譜保護(hù)的疫苗的開發(fā)提供新的幫助和支持?？梢姡ㄓ眯蚑aqMan qPCR檢測(cè)方法和遺傳進(jìn)化分析的結(jié)合，為豬場(chǎng)PRRS的全面防控和引種、免疫等計(jì)劃的實(shí)施提供了借鑒。