鵝毛玉鳳花總多糖提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究*

楊一山，柴勝豐，唐健民，羅亞進(jìn)，楊秀星，韋 霄**

(1.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西桂林 541004；2.廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所，廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541006；3.廣西雅長(zhǎng)蘭科植物國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理中心，廣西百色 533209)

鵝毛玉鳳花(Habenariadentata)系蘭科玉鳳花屬(Habenaria)的地生草本植物，主要分布于云南、安徽、福建、廣東以及廣西海拔為190-2 300 m的溝邊或山坡林地[1]，多見(jiàn)于土層較厚、光照較充足的山坡林地、山地道路兩側(cè)。鵝毛玉鳳花作為一種藥用植物，其藥用部位為地下塊莖，稱雙腎參、雙腎子、吊陽(yáng)草(浙江)、白參草(四川)、雞卵參(廣西)，在傣藥中又稱“婉康蓋”[2]，其性平、味甘、微苦，具有散氣、解毒[3]、滋補(bǔ)肺腎、止咳化痰[4]、利尿、消炎等功效[5]，常用于治療病后體虛、睪丸炎、腎虛腰痛、陽(yáng)痿、肺癆咳嗽、疝氣、白帶、白濁、尿路感染等疾病[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

鵝毛玉鳳花新鮮塊莖，采自廣西壯族自治區(qū)百色市樂(lè)業(yè)縣，經(jīng)廣西植物研究所黃俞淞副研究員鑒定為鵝毛玉鳳花Habenariadentata(Sw.) Schltr.塊莖。葡萄糖對(duì)照品(批號(hào)：B21882，HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；95%乙醇、濃硫酸，購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司；5%苯酚溶液，購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司，以上均為分析純?cè)噭?/p>

1.1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DL-720E型智能超聲波、AE200S型萬(wàn)分之一電子分析天平，均購(gòu)自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，購(gòu)自金壇雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠；QE-100型高速粉碎機(jī)，購(gòu)自浙江屹立工貿(mào)有限公司；Multifuge X1R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

鵝毛玉鳳花塊莖洗凈，切片，60℃烘干48 h，粉碎，過(guò)60目篩，制成樣品粉末，備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖48 mg，用蒸餾水溶解并定容于100 mL的容量瓶中，搖勻，得到0.48 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL，并分別用蒸餾水補(bǔ)至2 mL。然后先加入1 mL 5%的苯酚溶液，混勻后再加入4 mL的濃硫酸，搖勻，室溫下放置5 min后，于80℃水浴15 min，迅速冷卻至室溫，以相同方法處理下的空白試劑作為參比溶液，于490 nm處測(cè)定吸光值。以葡萄糖濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程，回歸方程為Y=0.0444x-0.0013，R2=0.999 6。

1.2.3 供試品溶液的制備和測(cè)定

稱取0.2 g樣品粉末，按照料液比1∶59 (g/mL)，加入11.8 mL去離子水，在74℃、功率300 W的條件下提取7 h。冷卻至室溫后，離心，取上清液并采用Sevag法除蛋白，將正丁醇、氯仿(V∶V=1∶4)混合，再與提取液混合，萃取，保留水層，再加入3倍體積95%乙醇，低溫醇沉10 h。離心后，棄上清液，用熱水溶解多糖沉淀，并定容于50 mL容量瓶中，即得供試品溶液。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟進(jìn)行加樣，測(cè)定吸光度。取3組平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算總多糖得率，總多糖得率的計(jì)算方法如下：

(1)

式中，C為提取液中總多糖濃度(μg/mL)；V1為提取液總體積(mL)；V2為測(cè)定時(shí)所用樣品的體積(mL)；D為稀釋倍數(shù)；W為樣品質(zhì)量(g)。

1.3 單因素試驗(yàn)

1.3.1 提取時(shí)間對(duì)鵝毛玉鳳花總多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取0.2 g樣品粉末，按照1∶60 (g/mL)料液比，加入12 mL去離子水，在80℃、功率為300 W的條件下，分別超聲提取1 h、3 h、5 h、7 h、9 h。按照1.2.3節(jié)供試品溶液的制備和測(cè)定方法進(jìn)行加樣，于490 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算總多糖得率，每個(gè)處理做3組重復(fù)。選取最佳提取時(shí)間，然后進(jìn)行下一步單因素試驗(yàn)。

1.3.2 料液比對(duì)鵝毛玉鳳花總多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取0.2 g樣品粉末，分別按照料液比1∶40 (g/mL)、1∶50 (g/mL)、1∶60 (g/mL)、1∶70 (g/mL)、1∶80 (g/mL)，分別加入8 mL、10 mL、12 mL、14 mL、16 mL去離子水，在80℃、功率為300 W、提取時(shí)間為1.3.1節(jié)試驗(yàn)所得的最優(yōu)時(shí)間的條件下進(jìn)行超聲提取。按照1.2.3節(jié)供試品溶液的制備和測(cè)定方法進(jìn)行加樣，于490 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算總多糖得率，每個(gè)處理做3組重復(fù)。選取最佳料液比，然后進(jìn)行下一步單因素試驗(yàn)。

1.3.3 提取溫度對(duì)鵝毛玉鳳花總多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取0.2 g樣品粉末，按照1.3.2節(jié)試驗(yàn)所得的最優(yōu)料液比，加入相應(yīng)體積的去離子水，分別在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，功率為300 W，提取時(shí)間為1.3.1節(jié)試驗(yàn)中所得的最優(yōu)時(shí)間的條件下進(jìn)行提取。按照1.2.3節(jié)供試品溶液的制備和測(cè)定方法進(jìn)行加樣，于490 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算總多糖得率，每個(gè)處理做3組重復(fù)。

1.4 響應(yīng)面分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以提取時(shí)間(A)、料液比(B)和提取溫度(C)為自變量，以總多糖得率為響應(yīng)值，對(duì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行組合試驗(yàn)。每個(gè)自變量分別有低、中、高3個(gè)水平，對(duì)這3個(gè)水平分別按照-1，0，1進(jìn)行編碼，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1.5 抗氧化活性測(cè)定

1.5.1 鵝毛玉鳳花總多糖對(duì)DPPH·清除能力的測(cè)定

參考吳冬凡等[12]的方法對(duì)DPPH·清除能力進(jìn)行測(cè)定。①取10 mL的試管依次編號(hào)，加入4 mL不同濃度的樣液于試管中，加入等體積的0.1 mmol/L的DPPH溶液，充分混勻，在室溫下避光保存30 min后，用無(wú)水乙醇作參比溶液，于517 nm處測(cè)定樣品液的吸光值，記為A1。②用4 mL無(wú)水乙醇代替①中DPPH溶液，測(cè)定吸光值，記為A2。③用4 mL蒸餾水代替①中樣液，與0.1 mmol/L DPPH溶液等體積混合，測(cè)定吸光值，記為A0。以相同濃度的抗壞血酸作陽(yáng)性對(duì)照。

(2)

1.5.2 鵝毛玉鳳花總多糖對(duì)·OH清除能力的測(cè)定

·OH清除能力的測(cè)定參考Fenton反應(yīng)體系[13]，并稍作調(diào)整。①取10 mL的試管依次編號(hào)，加入2.0 mL不同濃度的樣品溶液，然后依次加入1.0 mL 2.5 mmol/L的水楊酸溶液、1.0 mL 5 mmol/L的FeSO4溶液和2.0 mL的蒸餾水，充分混勻，加入1.0 mL 5 mmol/L的H2O2溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，在37℃恒溫水浴30 min后，用蒸餾水作參比溶液，于510 nm處測(cè)定吸光值，記為As。②用1.0 mL蒸餾水代替①中H2O2溶液，測(cè)定的吸光值記為Ab。③用2.0 mL蒸餾水代替①中樣品溶液，測(cè)定的吸光值記為Ap。以相同濃度的抗壞血酸作陽(yáng)性對(duì)照。

(3)

(4)

1.5.4 鵝毛玉鳳花總多糖對(duì)總還原力的測(cè)定

總還原力測(cè)定參考朱成豪等[15]的方法。取2.0 mL不同濃度的樣品溶液，先加入2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖液，再加入2.5 mL 1%的K3Fe(CN)6溶液，混勻，在50℃條件下水浴20 min后，迅速冷卻，最后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液來(lái)終止反應(yīng)。取2.5 mL的上清液，加入2.5 mL的蒸餾水和0.5 mL的FeCl3溶液，混勻，10 min后，用蒸餾水作參比溶液，于700 nm處測(cè)定吸光值。以相同濃度的抗壞血酸做對(duì)照。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，繪圖采用Origin 2019軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)鵝毛玉鳳花總多糖得率的影響

由圖1可知，隨著提取時(shí)間的增加，鵝毛玉鳳花總多糖得率呈先增加后減少的趨勢(shì)，在提取時(shí)間為5 h時(shí)，總多糖得率最大，為9.09%。在達(dá)到最高點(diǎn)前，提取時(shí)間越長(zhǎng)，總多糖的浸出效果越好，說(shuō)明提取時(shí)間對(duì)鵝毛玉鳳花總多糖得率存在一定的影響；但在達(dá)到最高點(diǎn)后，總多糖的得率開(kāi)始下降，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致部分多糖的結(jié)構(gòu)被破壞。

圖1 提取時(shí)間對(duì)總多糖得率的影響

2.1.2 料液比對(duì)鵝毛玉鳳花總多糖得率的影響

由圖2可知，隨著料液比的增加，鵝毛玉鳳花總多糖得率先緩慢增加，并在料液比為1∶60 (g/mL)時(shí)達(dá)到最大值，為7.7%。隨著料液比繼續(xù)增加，總多糖得率有所下降，但幅度較小。在得率達(dá)到最高點(diǎn)前，總多糖的浸出效果隨著溶質(zhì)的增加而增加；在達(dá)到最高點(diǎn)后，總多糖已經(jīng)較為完全地浸出，即使料液比再繼續(xù)增加，總多糖的得率也無(wú)明顯變化。

圖2 料液比對(duì)總多糖得率的影響

2.1.3 提取溫度對(duì)鵝毛玉鳳花總多糖得率的影響

由圖3可知，隨著提取溫度的增加，鵝毛玉鳳花總多糖得率明顯升高，當(dāng)溫度為70℃時(shí)，得率達(dá)到最高點(diǎn)，為9.34%。達(dá)到最高點(diǎn)后，總多糖得率有下降的趨勢(shì)，可能是由于溫度過(guò)高導(dǎo)致總多糖水解。

圖3 提取溫度對(duì)總多糖得率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，并根據(jù)因素水平設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，得到17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的試驗(yàn)結(jié)果，如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3的數(shù)據(jù)可知，模型的顯著性檢測(cè)P值為0.005 7 (P<0.01，極顯著)，且失擬誤差顯著性檢測(cè)P值為0.495 2 (P>0.05，不顯著)，模型的相關(guān)系數(shù)為0.912 9，矯正系數(shù)為0.800 9，綜合上述數(shù)據(jù)可知，模型的擬合效果較好，誤差小，選用的模型可以較為真實(shí)地反映出各因素與鵝毛玉鳳花總多糖得率的關(guān)系。

表3 回歸模型的方差分析

對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行二項(xiàng)多元回歸擬合，得到提取時(shí)間(A)、料液比(B)和提取溫度(C) 3因素的回歸模型為Y=9.09+0.68A+7.74E-003B+0.46C-0.16AB+0.52AC-0.19BC-0.71A2-0.85B2-1.44C2，其中Y值表示鵝毛玉鳳花中總多糖的得率。一次項(xiàng)中，提取時(shí)間(A)對(duì)總多糖得率的線性效應(yīng)為極顯著水平(P=0.009 7<0.01)，料液比(B)對(duì)總多糖得率的線性效應(yīng)不顯著(P=0.969 3>0.05)，提取溫度(C)為顯著水平(P=0.049 3<0.05)；二次項(xiàng)中，AB、BC、AC的影響效果不顯著，A2和B2的影響效果為顯著水平(P<0.05)，C2的影響效果為極顯著水平(P=0.001<0.01)。各因素對(duì)總多糖得率的影響順序?yàn)樘崛囟榷雾?xiàng)(C2)>提取時(shí)間一次項(xiàng)(A)>提取溫度一次項(xiàng)(C)>料液比二次項(xiàng)(B2)>提取時(shí)間二次項(xiàng)(A2)>提取時(shí)間-提取溫度交互項(xiàng)(AC)>料液比-提取溫度交互項(xiàng)(BC)>提取時(shí)間-料液比交互項(xiàng)(AB)>料液比一次項(xiàng)(B)。由F值可知，單因素對(duì)總多糖得率的影響大小依次為提取時(shí)間(A)>提取溫度(C)>料液比(B)。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

利用Design Expert 8.0.6軟件和回歸模型，繪出相應(yīng)的等高線和響應(yīng)面三維曲線圖。等高線越密集，表明該因素對(duì)總多糖得率的影響效果越顯著。兩個(gè)因素交互作用的強(qiáng)弱還可以通過(guò)等高線的形狀來(lái)判斷，等高線若呈橢圓形則說(shuō)明兩因素的交互作用顯著。此外，三維立體圖的曲面傾斜程度也可以判斷各因素之間的交互作用。由圖4可知，提取時(shí)間(A)的等高線相比于料液比(B)較為密集[圖4(a)]，說(shuō)明提取時(shí)間(A)對(duì)總多糖得率的影響較料液比(B)的影響顯著。等高線為圓形且三維曲線圖傾斜度較小，說(shuō)明提取時(shí)間(A)和料液比(B)的交互作用不顯著[圖4(b)]；同理，提取時(shí)間(A)對(duì)總多糖得率的影響較提取溫度(C)的影響顯著[圖4(c)]。提取時(shí)間(A)和提取溫度(C)的交互作用比提取時(shí)間(A)和料液比(B)的交互作用顯著[圖4(d)]；提取溫度(C)對(duì)總多糖得率的影響較料液比(B)的影響顯著[圖4(e)]，且提取溫度(C)和料液比(B)的交互作用不如提取時(shí)間(A)和提取溫度(C)的交互作用顯著[圖4(f)]。綜上可知，各因素交互作用的大小順序?yàn)樘崛r(shí)間-提取溫度(AC)>料液比-提取溫度(BC)>提取時(shí)間-料液比(AB)。

圖4 交互因素對(duì)鵝毛玉鳳花總多糖得率影響的響應(yīng)曲面圖

2.2.3 優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)響應(yīng)面得出的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，得出鵝毛玉鳳花總多糖的最佳提取條件為提取時(shí)間7 h，料液比為1∶58.7 (g/mL)，提取溫度為73.49℃，在此條件下，鵝毛玉鳳花總多糖的理論得率為9.61%。為方便試驗(yàn)，將最佳提取條件設(shè)置為提取時(shí)間7 h，料液比為1∶59 (g/mL)，提取溫度為74℃，在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到總多糖的實(shí)際得率為9.59%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.13%，與模型預(yù)測(cè)值相差0.02%，表示該模型可以較好地對(duì)總多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，且重現(xiàn)性較好。

2.3 鵝毛玉鳳花總多糖的體外抗氧化活性

圖5 鵝毛玉鳳花總多糖對(duì)的清除能力及總還原力

3 討論

鵝毛玉鳳花作為一種天然藥物，其發(fā)揮藥效功能的物質(zhì)基礎(chǔ)并不是單一的，而是由各種成分綜合作用的結(jié)果，但本研究?jī)H對(duì)鵝毛玉鳳花中總多糖含量和抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定，還未對(duì)多糖類(lèi)成分或其他類(lèi)型的活性物質(zhì)進(jìn)行深入研究，未來(lái)仍需進(jìn)一步探究其抗氧化能力，以確定發(fā)揮此類(lèi)功效的主要活性物質(zhì)，為其后續(xù)的研究和實(shí)際應(yīng)用提供理論和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)鵝毛玉鳳花總多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出3個(gè)因素對(duì)鵝毛玉鳳花總多糖得率的影響大小依次為提取時(shí)間(A)>提取溫度(C)>料液比(B)。鵝毛玉鳳花總多糖的最佳提取工藝參數(shù)為提取時(shí)間7 h，料液比1∶58.7 (g/mL)，提取溫度73.49℃，優(yōu)化驗(yàn)證后的總多糖得率為9.59%?？寡趸芯拷Y(jié)果顯示，鵝毛玉鳳花總多糖對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的IC50值分別為1.385 mg/mL、0.006 mg/mL、0.020 mg/mL，總還原能力是L-抗壞血酸的2.24%。綜上可知，鵝毛玉鳳花總多糖有較好的抗氧化活性，具有廣闊的發(fā)展利用空間。