工業(yè)大麻性別連鎖Indel標記的篩選與鑒定

陶杰，潘根，黃思齊，常麗，陳安國，唐慧娟，張翠萍，李德芳，李建軍，趙立寧

（中國農業(yè)科學院麻類研究所／農業(yè)農村部麻類生物學與加工重點實驗室，湖南 長沙 410205）

大麻（Cannabis sativa L.）又稱漢麻、火麻、線麻，是大麻科（Cannabinaceae）大麻屬（Cannabis）一年生草本植物。大麻是二倍體（2n＝20）雙子葉植物，也是世界上最早和最廣泛種植的作物之一，其根、莖、葉、花和果實都具有重要的經(jīng)濟利用價值，在纖維、油料、藥物和特殊材質等領域都有廣泛應用[1-2]。大麻的花葉中富含大麻二酚（Cannabidiol，CBD），可應用于藥物和化妝品等領域；莖稈纖維具有吸濕透氣、抗靜電和抑菌的特點，常用于紡織業(yè)；桿芯可用于造紙、建筑材料、活性炭及新型材料等；籽粒富含膳食纖維以及人體必需氨基酸和脂肪酸，常用于功能飲料和食品的開發(fā)[3-6]。

大麻多為雌雄異株，少數(shù)為雌雄同株，其雌雄比例接近1∶1，而不同性別大麻植株在生長發(fā)育性狀、成熟期及纖維品質上有各自的特點。雄性植株的纖維質量比雌株好，若作為纖維用，則需擴大雄性群體比例；而雌性植株的大麻素（CBD）含量比雄株高，若以提取大麻素（CBD）和收獲種子為目的，則需擴大雌性群體比例[6]。不同性別的大麻成熟期不一致，不利于機械收割，增加了人工成本。雌雄同株大麻則成熟期一致，利于機械收割，但易受外界環(huán)境因素影響而使性別雌化或雄化。大麻性別在種子和幼苗期尚無準確鑒定的方法，在生產(chǎn)過程中，其性別表達常受到溫度、濕度、激素、重金屬鹽、光周期和栽培條件等影響，只有在生殖器官（花器官）原基形成時才能從形態(tài)上準確判斷植株性別，但雄性植株在開花后自然死亡，造成極大的生產(chǎn)損失[7]。因此，通過分子標記技術進行早期性別鑒定，克服環(huán)境因素對形態(tài)和生理生化指標的影響，調節(jié)田間雌雄比例，將有利于指導生產(chǎn)實踐。

關于大麻性別，現(xiàn)在主要分為性狀鑒定和分子鑒定。早期鑒定主要以性狀鑒定為主，如《齊民要術》記載“凡種麻，用白麻子。止取實者，種斑黑麻子”，既色白、兩頭尖和較輕的是雄麻，而色黑、堅實飽滿的是雌麻，古書《農政全書》和《圖經(jīng)本草》亦是這樣記載[7]。但單從經(jīng)驗性結論來看，不足以科學地支撐其雌雄性別鑒定的準確性。分子標記能直接反映DNA水平遺傳多樣性，與其他形態(tài)學、細胞學等標記相比，更易于檢測、節(jié)省時間，且準確性更高，還能提供更多的性別分化有益信息[8]。隨著現(xiàn)代分子技術的不斷更新與應用，DNA分子標記技術被認為是雌雄異株性別鑒定的準確且可靠的方法，因為其不受植物生長階段的影響，還能打破傳統(tǒng)育種的局限性。據(jù)報道，分子技術的進步為現(xiàn)代遺傳育種提供了更多種類的分子標記技術，已廣泛應用于大麻種質遺傳多樣性和性別相關標記研究中，如特別序列擴增（Sequence characterized amplified regions，SCAR）、隨機擴增多態(tài)性DNA（Random amplified polymorphism of DNA，RAPD）、擴增片段長度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）、簡單序列重復（Simple sequence repeats，SSR）和單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）[8-14]。趙銘森等[9]利用 3個雄性特異條帶開發(fā)了 6個 SCAR標記，其MADC2-8性別檢測鑒定準確率達98.34%；姜穎等[10]利用RAPD與SCAR標記，獲得了一條869 bp的大麻雄性特異條帶；呂淑珍等[14]利用AFLP分子標記獲得了一條348 bp的雄性特異條帶；Mandolino等[15]利用RAPD分子標記，獲得了一條400 bp的雄性相關特異條帶。研究表明，利用分子標記技術對工業(yè)大麻進行性別標記是可行的。

插入／缺失（Insertion-deletion，InDel）是指在近緣種或同一種物種不同個體之間基因組同一位點的序列發(fā)生了不同大小核苷酸片段的插入或缺失，及一個序列上某一位點相比同源的另一個序列插入或缺失一個或多個堿基[16-17]。InDel標記技術是基于PCR擴增技術發(fā)展起來的，其本質上屬于長度多態(tài)性標記，但相較于其他分子標記技術而言，InDel標記在基因組中的分布更廣、密度更大、數(shù)目也更多，具有穩(wěn)定性更好、多態(tài)性高、分型系統(tǒng)簡單、設備要求限制低和通用性強等特點[17]。目前InDel標記已應用于動植物群體遺傳分析、分子輔助育種、純度鑒定等領域[18-23]，而InDel標記技術在大麻染色體中的標記報道較少。本文以大麻全基因組序列為基礎，通過對InDel識別區(qū)域性染色體序列信息的篩選，構建InDel分子標記技術，探究工業(yè)大麻性別連鎖標記，為大麻早期性別標記鑒定及性別表達研究奠定理論基礎，研究結果將有助于工業(yè)大麻早期性別快速鑒定，且為今后大麻性別連鎖標記的遺傳結構信息和實際應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選擇慶大麻1號（Q1）作為InDel標記的篩選材料，以H8、籽用2、E-7、云麻7號（Y7）、C8×籽用2的F2群體和雌雄同株USO14作為InDel標記的驗證材料，7份工業(yè)大麻性別表型的鑒定材料如表1所示。試驗所用工業(yè)大麻種質均由中國農業(yè)科學院麻類研究所一年生麻類育種研究室提供。

表1 7份大麻種質資源表Table 1 7 germplasm resources of hemp

1.2 試驗方法

1.2.1 大麻基因組總DNA的提取純化及檢測

利用植物基因組DNA提?。x心柱型）試劑盒（北京天根生物科技有限公司），對大麻葉片進行基因組總DNA提取，具體方法參見試劑盒說明書。用1%瓊脂糖凝膠電泳進行DNA純度檢測，并使用NanoDrop 2000對提取DNA進行質量和濃度檢測，暫存于-20℃冰箱。

1.2.2 Indel標記引物設計

根據(jù)Prentout D等[24]公布的大麻性染色體位于1號染色體的報道，本研究通過NCBI下載大麻全基因組序列（https：／／www.ncbi，nlm.nih.gov／bioproject／PRJNA73819），選擇位于 1號性染色體的序列信息，以每5 Mb的間隔選擇沿染色體分布的10個InDel識別區(qū)域序列信息，利用Primer 5.0進行引物設計，依次命名為Is-01～Is-10，引物序列見表2。引物均由北京擎科生物科技有限公司（Tsingke Biotechnology Co.，Ltd.）合成。

表2 InDel引物及核苷酸序列（5′-3′）Table 2 InDel primers and nucleotide sequences（5′-3′）

1.2.3 PCR擴增

使用2×Es Taq MasterMix（Dye）（康為世紀），PCR擴增反應總體積10μL。其中6μL的2×Es Taq MasterMixDye，1.5μL的Template DNA（800 ng／μL），上下游引物（10μmol／L）為1.0μL，1.5μL的ddH2O。PCR反應循環(huán)程序為：預變性94℃、3 min，變性 94℃、30 s，退火55℃、30 s，延伸72℃、1 min，35個循環(huán)；延伸72℃、5 min，反應結束后4℃冰箱保存。

1.2.4 擴增產(chǎn)物的檢測

使用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，其中30%丙烯酰胺20 mL，5×TBE溶液10 mL，超純水48mL，10%AP溶液1200μL，TEMED溶液66μL。DYY-10c型電泳儀設置程序：電壓180 V，電流300 mA，定時70 min。將凝膠放入0.4 g AgNO3與400 mL超純水混合液中，銀染6～8 min，超純水洗1次；將凝膠放入6 g NaHO、400 mL超純水和4 mL甲醛混合溶液中（可提前-20℃預冷5～10 min），顯影10～30 min，超純水洗7～9次。WD-9406型膠片觀察燈下觀察和拍照，保鮮膜封膠、貼標簽留存。

使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增引物，其中瓊脂糖1 g，1×TAE溶液100 mL，核酸染料5～7μL，DYY-10c型電泳儀設置程序同上，定時25 min，且標記所用Marker分子量標準均為GL DNA Marker 2000。將凝膠放入BIO-RAD凝膠成像儀中進行觀察，并拍照留存。

1.2.5 工業(yè)大麻植株表型鑒定

2020年將InDel標記篩選材料Q1播種于人工氣候室（光照強度8000 lux，長日照18 h和65～70 d后進行短日照8 h處理，室溫（25±5）℃，濕度60%～70%），待4對真葉完全展開后，采集大麻植株葉片，液氮速凍，并對采集植株掛牌標識。將樣品利用植物組織研磨器（JXFSTPRP-24）粉碎，提取基因組總DNA，-20℃冰箱進行保存。待鑒定的6份資源材料同樣種植于人工氣候室，花期觀察記錄雌株與雄株性別，吊牌標識，并對每個品種雌雄株進行取樣（3個重復），研磨后提取基因組DNA，暫存于4℃冰箱，用于性別表型驗證。

2 結果與分析

2.1 大麻基因組總DNA的提取

本試驗利用植物基因組DNA提取（離心柱型）試劑盒（北京天根）提取大麻基因組DNA，由于大麻含酚類物質較多，在提取過程中相對延長了試驗時間，步驟詳見說明書。紫外分光光度法檢測結果表明，基因組DNA的OD260／OD280值均在1.8～2.0，OD260／OD230值均在 1.9～2.3，說明提取的DNA純度較高，酚類物質污染較少，能夠滿足后續(xù)試驗要求。1%瓊脂糖凝膠電泳結果表明，大麻基因組DNA完整，帶型整齊無彌散，完整性好（圖1）。

圖1 大麻基因組總DNA提取Fig.1 Total DNA extraction of cannabis genome

2.2 大麻性別連鎖標記引物的篩選

以Q1的雌雄單株DNA池為模板，分別對上述10對引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯凝膠電泳后進行引物篩選，經(jīng)篩選后發(fā)現(xiàn) Is-02（5′-CGATTTCTTCTTTCTGCAAT-3′）和 Is-08（5′-GTGCGATTTCTTCTTTCTGC-3′）能夠對工業(yè)大麻雌（Female）、雄（Male）性別進行準確鑒定。Is-02在工業(yè)大麻雌株中擴增出一條約370 bp的單一帶型，在雄株中擴增出一條約370 bp和199 bp的雄性雙帶型（圖2 a）；Is-08在工業(yè)大麻雌株中擴增出一條約272 bp單一帶型，在雄株中擴增出一條約272 bp和100 bp的雄性雙帶型（圖2 b），且出現(xiàn)的雌雄帶型清晰，分區(qū)明顯，雌雄單株重復的穩(wěn)定性高。

圖2 Q1聚丙烯凝膠電泳Fig.2 Polyacrylamide gel electrophoresis of Q1

此外，分別將Is-02和Is-08 PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳后，發(fā)現(xiàn)Is-02和Is-08也分別能在工業(yè)大麻雌株中擴增出單一帶型（370 bp、272 bp），在雄株中擴增出雙帶型（370 bp和199 bp，272 bp和100 bp）（圖3 c、d）。結果表明，兩份標記物在瓊脂糖凝膠電泳中同樣適用于工業(yè)大麻雌雄株的性別鑒定。

圖3 InDel標記物對HM30苗期性別檢測結果Fig.3 Sex detection results of InDel markers in HM30 seedling stage

2.3 與工業(yè)大麻雄性連鎖的InDel標記引物的品種驗證

2.3.1 InDel分子標記檢測工業(yè)大麻苗期性別

為驗證Is-02和Is-08適用于工業(yè)大麻早期未知性別的鑒定，隨機選取HM05（C8×籽用2）F2群體24株幼苗葉片進行DNA提取，以便于進行InDel標記。結果發(fā)現(xiàn)（圖3 a、b），PCR擴增產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳后，HM30中 2、5、8、10、11、15、16、17、19、21、23為雄株，其余均為雌株。利用該部分雌雄株DNA設置3個重復進行聚丙烯凝膠電泳（圖3 c、d），試驗結果與瓊脂電泳一致，經(jīng)核對相應編號HM30群體F2花期性別表型，發(fā)現(xiàn)性別表型與InDel標記結果一致。

2.3.2 InDel分子標記檢測工業(yè)大麻花期雌雄異株性別

為驗證Is-02和Is-08對工業(yè)大麻雌雄性別的鑒定，對H8、Y7、籽用 2雌雄異株、E-7全雌品種等開花期葉片進行基因組DNA提取，設置不同樣本重復（5雌×5雄、6雌×6雄、12雌×12雄）進行InDel標記鑒定，結果如圖4所示。Is-02中籽用-2、H8、Y7中擴增出片段大小相差171 bp的雙帶型，為雄株，其余未出現(xiàn)雙帶型，但僅在370 bp處有單一帶型的均為雌株；同理，在Is-08中擴增出片段大小相差172 bp的雙帶型，為雄株，僅在272 bp處出現(xiàn)單一帶型的均為雌株。

圖4 工業(yè)大麻雌雄異株InDel標記聚丙烯酰胺凝膠鑒定結果Fig.4 Identification results of InDel labeled polyacrylamide gel for dioecious industrial hemp

此外，為驗證兩份標記物的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性，將4份擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，結果表明（圖5），兩份標記物在電泳檢測中都可對其進行性別快速鑒定，而鑒定結果均與花期表型一致。由此說明，兩份標記物可以有效鑒定工業(yè)大麻幼苗期雌雄性別，且準確率可達100%。

圖5 工業(yè)大麻雌雄異株品種分析鑒定結果Fig.5 Analysis and identification results of dioecious strains of industrial hemp

2.3.3 InDel分子標記在工業(yè)大麻雌雄同株中的利用

為驗證在工業(yè)大麻雌雄異株中獲得的兩份標記物同樣適用于雌雄同株工業(yè)大麻，隨機選取12株雌雄同株USO14材料進行DNA提取，經(jīng)PCR擴增后，結果表明（圖6），兩份標記物僅出現(xiàn)單一帶型（370 bp，270 bp），表明兩份標記物同樣適用于雌雄同株材料的苗期雄化鑒定。

圖6 雌雄同株USO14分子鑒定結果Fig.6 Molecular identification results of monoecious USO14

3 討論與結論

工業(yè)大麻是一種雌雄異株植物，少數(shù)為雌雄同株，其全株具有重要的藥用價值和經(jīng)濟價值，在生產(chǎn)過程中通常根據(jù)植株性別進行產(chǎn)業(yè)加工利用，但其性別在早期很難通過表型準確鑒別。隨著分子標記種類和應用領域的不斷擴大，SSR、RAPD、EST-SSR、ARFP等分子標記已廣泛運用于蘆筍[25]、番木瓜[26]、黃瓜[22]、野生大豆[27]、大麻[9-15]，[18，28]和紅麻[29]等性別鑒定、基因定位、分子育種與遺傳多樣性分析等領域中。目前，已有學者通過分子標記技術對大麻性別鑒定進行了相關報道，呂淑珍等[14]利用64對引物對10個大麻品種進行AFLP標記后，獲得一條348 bp的雄性特異性條帶；姜穎等[10]利用42條RAPD引物在火麻一號中獲得了一條869 bp雄性特異條帶，并命名為OPV-08，其合成的2條SCAR引物能夠有效鑒定大麻早期性別；陳其軍等[30]利用RAPD標記從30份引物中獲得了一條約2.5 kb雄性特異條帶，命名為S401，并將其轉化成重復性和特異性更好的SCAR標記。但它們在大麻性別連鎖中的形成過程與作用機理未得到進一步驗證，其中部分標記手段存在重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、特異性和分型等較差，缺乏功能性標記的開發(fā)，在一定程度上限制了分子標記在大麻遺傳育種中的應用。與其他分子標記相比，基于功能性插入和缺失（InDel）位點開發(fā)的基因特異性標記，其準確性高、通用性強、穩(wěn)定性好、帶型清晰簡單、產(chǎn)物分離效果好，且不受遺傳背景影響，是分析標記輔助育種中理想的分子標記[8，17]。隨著現(xiàn)代測序技術的發(fā)展與大麻基因組數(shù)據(jù)信息的公布，為InDel標記開發(fā)提供了很好的識別目標基因組區(qū)域，從而有助于加快基于圖位克隆和性別標記的大麻分子輔助育種的選擇。

工業(yè)大麻雌株藥用成分好，雄株纖維質量高，種子可榨油、入藥等。生產(chǎn)上，保持合適的雌雄比例，可提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益。在本研究中，利用Is-02和Is-08在自然群體中進行驗證，結果表明，在雌雄異株中擴增出2條長度相差171 bp或172 bp的帶型，則為雄株，而僅擴增出單一帶型且片段大小與雄株中擴增帶型較長的一條一致的為雌株，即雄株中可擴增出2條帶型，雌株僅擴增出單一帶型；在F2群體、全雌化和雌雄同株中再次驗證其準確性和重現(xiàn)性，與預期結果一致。這與Pan等[18]通過InDel標記篩選出的Cs-I1-10和Cs-I1-15的雌雄帶型相似，這表明可以通過InDel分子標記的方法鑒定出大麻性別，但在雌雄同株USO14的鑒定中，僅發(fā)現(xiàn)了單一帶型（272 bp，370 bp）雌性標記，表明所選植株性染色體均為XX型，這與姜穎等[10]在雌雄同株材料研究中的結果一致，均未找到雄性特異性帶型（即XY型），后續(xù)還需對雌雄同株品種進行更多的種質資源鑒定。

在本研究中，篩選出的Is-02和Is-08可在工業(yè)大麻早期未知性別、雌雄同株和雌化植株中標記出單一帶型（272 bp，370 bp）雌性標記，以及片段大小相差171 bp或172 bp的雙帶型雄性標記。結果表明，Is-02和Is-08作為一個與工業(yè)大麻雄性連鎖緊密相連的標記物，在植株幼苗生長期就可對其進行早期性別鑒定，且鑒定準確率可達100%。篩選出的標記物被證明在廣泛的擴增條件下，仍有極強的重現(xiàn)性，在退火溫度為48～62℃時，都可清楚看到雌雄帶型，不會因為熱循環(huán)變化影響最終結果，這也證明篩選出的兩對標記物穩(wěn)定性較好，進一步表明本研究獲得的兩對標記物可為工業(yè)大麻遺傳育種和生產(chǎn)提供準確的性別鑒定手段。