黃麻組培再生體系的研究

方平平，王建勇，祁建民，陶愛芬，徐建堂，張立武

（1.福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物遺傳育種與綜合利用教育部重點實驗室／福建省作物設(shè)計育種重點實驗室，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東南黃紅麻實驗觀測站／福建省麻類種質(zhì)資源共享平臺／福建省南方經(jīng)濟作物遺傳育種與多用途開發(fā)國際科技合作基地，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院基因組與生物技術(shù)中心，福建 福州 350002）

黃麻是世界上種植規(guī)模僅次于棉花的重要纖維作物，其生產(chǎn)主要分布在亞洲的印度、孟加拉國等，是這些國家重要的經(jīng)濟作物。其主要的栽培品種有：“圓果種”（Corchorus capsularis L.）和“長果種”（Corchorus olitorius L.）。黃麻具有纖維產(chǎn)量高、質(zhì)地柔軟、吸濕性能好等諸多優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于商業(yè)、工業(yè)和建筑業(yè)領(lǐng)域。

植物組織培養(yǎng)經(jīng)過百余年的發(fā)展，已經(jīng)成為生物科學(xué)中一項不可或缺的技術(shù)，其對作物育種與遺傳轉(zhuǎn)化有重要的意義[1]。而構(gòu)建植物組織的再生體系，尤其是植物愈傷組織的獲得，更是原生質(zhì)體融合、遺傳轉(zhuǎn)化、植株再生等的研究基礎(chǔ)[2-3]。目前，國內(nèi)外有關(guān)黃麻再生體系的研究報道較少，且多采用子葉和下胚軸作為離體培養(yǎng)的材料，同時存在愈傷組織易褐化，不定芽再生困難等問題[4-5]。目前已建立的黃麻再生體系的通用性仍然較差，建立穩(wěn)定的黃麻再生體系十分必要。

本研究以不同基因型的黃麻幼莖為外植體，研究不同濃度的激素配比對黃麻愈傷組織的誘導(dǎo)，以及愈傷組織分化不定芽、不定根的差異，建立不同品種黃麻品種的再生體系，以期為進一步利用原生質(zhì)體融合和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)對黃麻種質(zhì)資源進行改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗種子為2份圓果種黃麻“梅峰4號”（以下稱M4）、“179”，以及2份長果種黃麻“尤溪長果”（以下稱YC）、“廣巴矮”（以下稱GBA），均由福建農(nóng)林大學(xué)麻類作物遺傳育種與綜合利用實驗室提供。

1.2 儀器與試劑

儀器與設(shè)備：超凈工作臺、冰箱、光照培養(yǎng)箱、微波爐、高壓蒸汽滅菌鍋、烘干箱、pH計；

藥品與試劑：無水乙醇、工業(yè)酒精、蒸餾水、次氯酸鈉、氫氧化鈉、蔗糖、瓊脂粉等；

植物激素：噻苯?。═DZ）、2.4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、α-萘乙酸（NAA）、抗壞血酸（Vc）、吲哚丁酸（IBA）。

MS培養(yǎng)基見表1。

表1 MS培養(yǎng)基配方Table 1 MS formula

1.3 試驗方法

1.3.1 黃麻無菌苗的獲得

4個黃麻品種均選取籽粒飽滿、大小一致的種子，用純凈水清洗半小時后晾干，備用。

（1）滅菌處理篩選

按照文獻[6]的方法，在超凈工作臺上將準(zhǔn)備好的黃麻種子進行滅菌處理，而后接種于3種MS培養(yǎng)基。3種培養(yǎng)基的配制方法參考文獻[8-9]。

（2）培養(yǎng)條件

接種后，培養(yǎng)基置于光照培養(yǎng)箱，處理條件：光／暗交替16 h／8 h，溫度25℃／20℃（白天／黑夜），光照強度為 2000 YC[6]。

1.3.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

培養(yǎng)15 d后，取無菌苗莖段，接種于MS培養(yǎng)基（不同激素配方）。15 d轉(zhuǎn)接一次，40 d進行愈傷組織的誘導(dǎo)情況統(tǒng)計。每個激素組合處理20個莖段，4次重復(fù)。采用均勻設(shè)計法培養(yǎng)[7]（表2）。

表2 愈傷組織誘導(dǎo)試驗均勻設(shè)計表Table 2 The uniform design table on callus induction

1.3.3 不定芽誘導(dǎo)

按表3的方案設(shè)計不定芽誘導(dǎo)MS培養(yǎng)基，愈傷組織切成小塊，置于不同的培養(yǎng)基中，每個激素組合處理20個莖段，4次重復(fù)[6]。30 d后統(tǒng)計分化率，40 d后統(tǒng)計不定芽誘導(dǎo)率。

表3 不定芽誘導(dǎo)試驗正交設(shè)計表Table 3 The orthogonal experimental design table on induction of adventitious buds

1.3.4 不定根誘導(dǎo)

取4～5 cm不定芽，置于不同激素組合的不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（表4），每個激素組合處理20個不定芽，4次重復(fù)[6]，30 d統(tǒng)計生根率。

表4 不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基試驗正交設(shè)計表Table 4 The orthogonal experimental design table on induction of adventitious roots

1.3.5 再生苗移栽

黃麻再生根3～4 cm時，煉苗處理。3 d后，移栽花盆煉苗。一個月后，移栽大田觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)通過excel進行方差分析和多重比較；采用SPSS軟件對不同激素組合對黃麻愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果進行回歸分析，以得出最優(yōu)激素組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理結(jié)果分析

2.1.1 次氯酸鈉處理

設(shè)置6種不同時間的次氯酸鈉處理，考察其對黃麻種子發(fā)芽率和污染率的影響，結(jié)果表明（表5），次氯酸鈉處理對不同黃麻品種的萌發(fā)率和污染率有極顯著影響。所有品種的黃麻種子發(fā)芽率整體上均隨處理時間增加而上升，處理20～30 min時，發(fā)芽率達到最大，而后隨著處理時間增加，發(fā)芽率開始下降；種子污染率則隨處理時間增加而下降。

表5 次氯酸鈉處理對黃麻發(fā)芽率與污染率的影響Table 5 Effect of sodium hypochlorite treatments on jute seeds germination

綜合考慮污染率與發(fā)芽率，次氯酸鈉處理的最佳時間為：黃麻179和梅峰4號20 min，廣巴矮和尤溪長果為30 min。

2.1.2 不同培養(yǎng)基處理

設(shè)計3種不同培養(yǎng)基，考察其對黃麻種子發(fā)芽率和污染率的影響，結(jié)果表明（表6），不同培養(yǎng)基對黃麻品種的影響差異較大。在3種培養(yǎng)基上，梅峰4號和179的發(fā)芽率均在89%以上，污染率10%左右，差異不明顯。而長果種黃麻種子的發(fā)芽率和污染率卻差異顯著，2個長果種黃麻品種在MS（s-）培養(yǎng)基中的發(fā)芽率明顯高于其他兩種培養(yǎng)基，而污染率明顯低于其他兩種培養(yǎng)基。

表6 不同培養(yǎng)基對黃麻發(fā)芽的影響Table 6 The effect of different media on jute germination

綜上，圓果種黃麻可采用普通的MS培養(yǎng)基，而長果種黃麻則以MS（s-）培養(yǎng)基為佳。

2.2 愈傷組織誘導(dǎo)

采用均勻設(shè)計法進行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素組合試驗，該方法通過少量組合，即可篩選出最優(yōu)解，并確定出回歸方程。結(jié)果表明，4種黃麻愈傷組織的誘導(dǎo)率差異明顯（表7）。其中，在設(shè)定的激素組合中誘導(dǎo)，179的最高誘導(dǎo)率為90%，M4為70%，而長果種黃麻YC和GBA最高誘導(dǎo)率分別為45%和42%，其誘導(dǎo)效果為：179＞M4＞YC＞GBA。

表7 不同激素組合對黃麻愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果Table 7 The effect of different hormone combinations on callus induction of jute

（1）179：采用SPSS軟件對黃麻179的數(shù)據(jù)進行回歸分析，以Y代表誘導(dǎo)率，X1代表TDZ，X2代表2，4-D，X3代表6-BA，X4代表 NA，X5代表 VC，得到回歸方程：Y＝0.71＋0.39X12-0.77X1X2-0.17 X1X3-0.02X1X4＋0.28X22＋0.2X2X3＋α。說明4種激素對黃麻179愈傷組織的誘導(dǎo)率具有顯著影響，而VC則無顯著影響。

上述回歸方程中的α為隨機誤差項，對回歸方程求解最大值，得到X1＝0，X2＝0.53，X3＝2，X4＝0。為驗證該方程，將黃麻179莖段接種到 MS＋0.53 mg／L 2，4-D＋2.0 mg／L 6-BA培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)，接種15 d后，愈傷組織誘導(dǎo)率為100%，由此得出該培養(yǎng)基激素組合即為黃麻179的最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

（2）梅峰 4號：方法同黃麻179。獲得最優(yōu)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 MS＋2.0mg／L TDZ＋0.5mg／L 2，4-D，最大誘導(dǎo)率為100%。

（3）尤溪長果：方法同黃麻179。獲得最優(yōu)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS＋2.0 mg／L TDZ＋2.0 mg／L 6-BA，最大誘導(dǎo)率為63%。

（4）廣巴矮：方法同黃麻179。獲得最優(yōu)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS＋2.0 mg／L TDZ＋2.0 mg／L 2，4-D＋2.0 mg／L 6-BA，最大誘導(dǎo)率為52%。

從愈傷組織誘導(dǎo)率的結(jié)果分析，圓果種黃麻的誘導(dǎo)率顯著高于長果種黃麻。

圖1 不同黃麻品種的愈傷組織Fig.1 The induction callus of 4 varieties of jute

2.3 不同溫度處理

試驗表明，培養(yǎng)溫度為27℃時，4個黃麻品種愈傷組織的初代和二代培養(yǎng)均可快速增殖，且褐化程度低，但從第三代培養(yǎng)開始，褐化率明顯提高。為此，設(shè)置不同溫度處理進行第三代愈傷組織培養(yǎng)，統(tǒng)計其愈傷組織的增長量和未褐化比率。結(jié)果表明（圖2），4種黃麻愈傷組織的增殖速度均隨溫度的升高而升高，但褐化率也隨之升高。不同溫度處理對愈傷組織褐化率具有顯著影響（表8）。溫度為21℃時，4種黃麻愈傷組織的增殖量都在0.1～0.5 g，但褐化率小于等于30%。而溫度為27℃時，增殖量都在0.9 g以上，但褐化率高達62%～70%。綜合愈傷組織的增殖量和褐化情況，確定黃麻的第三代愈傷組織在23℃培養(yǎng)。

圖2 不同溫度對黃麻愈傷組織的影響Fig.2 Effects of different temperatures on jute callus

表8 不同溫度對黃麻愈傷組織褐化率的影響Table 8 Effects of different temperatures on browning rate of jute callus

2.4 不定芽誘導(dǎo)

按照正交設(shè)計，配制了12組不定芽誘導(dǎo)MS培養(yǎng)基，方差分析表明，基因型間、激素組合間均存在極顯著差異（表9）。從基因型差異分析，圓果種黃麻愈傷組織的不定芽誘導(dǎo)率明顯優(yōu)于長果種黃麻。其誘導(dǎo)效果排序為：179＞M4＞YC＞GBA。從激素組合差異分析，4個品種愈傷組織不定芽誘導(dǎo)率均呈現(xiàn)先升后降的趨勢（圖3）。在9號培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化，每個品種均表現(xiàn)為最高的不定芽誘導(dǎo)率，黃麻179為35.0%，梅峰4號30%，尤溪長果22.6%，廣巴矮15%。

表9 黃麻愈傷組織不定芽誘導(dǎo)率的方差分析Table 9 Varianceanalysis on jute callus induction rate of adventitious buds

圖3 不同激素組合對黃麻不定芽的誘導(dǎo)結(jié)果Fig.3 The effect of induction of adventitious roots on different hormone combinations

從分化的表型分析，愈傷組織前期形成顆粒狀的生長點，中期繼續(xù)生長的同時，褐化嚴重，后期僅少數(shù)生長點能長出健康的不定芽（圖4）。而長果種黃麻廣巴矮誘導(dǎo)出的不定芽隨著愈傷組織褐化的加劇而全部死亡。

圖4 誘導(dǎo)的黃麻不定芽Fig.4 The adventitious buds of jute

2.5 不定根誘導(dǎo)

按照正交設(shè)計，配制了16組不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基，由于GBA的不定芽全部衰亡，因此，僅將分化出健康不定芽的3個黃麻品種接種到生根培養(yǎng)基上。方差分析表明，基因型間、激素組合間均存在顯著差異（表10）。從基因型差異分析，圓果種黃麻愈傷組織的不定根誘導(dǎo)率也明顯優(yōu)于長果種黃麻，其誘導(dǎo)效果排序為：179＞M4＞YC（圖5）。

表10 黃麻愈傷組織不定根誘導(dǎo)率的方差分析Table 10 Variance analysison jute callus induction rate of adventitious roots

圖5 不同激素組合對黃麻不定根的誘導(dǎo)結(jié)果Fig.5 The effect of induction of adventitious roots on different hormone combinations

從激素組合差異分析，黃麻179在13號培養(yǎng)基上的不定根誘導(dǎo)率最高，為50.2%，梅峰4號和尤溪長果在14號培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)率達到最大，分別為45.8%和25.4%（圖5）。

對不定根影響因子的分析表明，基因型和激素組合對黃麻不定芽的影響顯著（表10）。試驗中表現(xiàn)為（圖6）：圓果種黃麻的不定根誘導(dǎo)容易，不定根數(shù)量多且長勢良好。而尤溪長果的不定根數(shù)量少，且多為主根，沒有須根，不定根的長勢較差，幼苗葉片逐漸脫落，死亡。

圖6 黃麻的不定根Fig.6 The adventitious roots of jute

2.6 再生苗的生長情況

選取具有健康不定根和不定芽的愈傷組織，經(jīng)煉苗處理，轉(zhuǎn)入外界培養(yǎng)，圓果種黃麻179和梅峰4號黃麻長勢較好（圖7）。而長果種黃麻尤溪長果雖然誘導(dǎo)出不定根，但不定根數(shù)量較少，不定芽長勢極差，培養(yǎng)幾天后，不定芽葉片脫落死亡，無法再生植株。

圖7 再生的黃麻幼苗Fig.7 Regeneration seedlings of jute

3 討論與結(jié)論

3.1 基本培養(yǎng)基對黃麻種子發(fā)芽的影響

基本培養(yǎng)基對植物離體培養(yǎng)植株再生有顯著的影響，大多數(shù)文獻報道的愈傷組織的誘導(dǎo)和芽的分化一般都是采用MS培養(yǎng)基[10]。Saha等[8]研究發(fā)現(xiàn)，對圓果種黃麻而言，液體培養(yǎng)基更適合于其種子發(fā)芽，且黃麻幼苗長勢好、污染率低。本研究選用3種不同的基本培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)圓果種黃麻種子的萌發(fā)基本不受培養(yǎng)基差異的影響，但3種培養(yǎng)基對長果種黃麻的發(fā)芽率有顯著影響，其中不添加有機物質(zhì)的MS培養(yǎng)基效果最好。這可能與長果種黃麻種子表面多“褶皺”，可能潛藏有較多的細菌和真菌有關(guān)。MS（s-）培養(yǎng)基由于不添加有機元素，不利于菌類的生長，可抑制其生長發(fā)育。

3.2 激素對黃麻愈傷組織誘導(dǎo)和再生的影響

黃麻再生體系的研究多集中在外源激素對植株再生過程的調(diào)控作用。張高陽[6]研究表明，黃麻愈傷組織誘導(dǎo)需要植物激素TDZ、6-BA和IAA。Bharadwaj等[11]利用黃麻子葉在MS＋0.5 mg／L NAA＋0.5 mg／L BAP＋36 g／L蔗糖上成功誘導(dǎo)出不定芽。T.saha等[12]利用圓果種黃麻的子葉在MS＋2.7 mmol／L NAA＋4.4mmol／L 6-BA上不僅誘導(dǎo)出不定芽，還成功誘導(dǎo)出不定根。本試驗通過均勻設(shè)計選用不同的TDZ、6-BA、2，4-D和NAA激素組合，發(fā)現(xiàn)不同的激素組合對黃麻愈傷組織的誘導(dǎo)差異顯著。長果種黃麻的不定芽和不定根誘導(dǎo)效率較差，說明植物組織再生的不同階段對外源激素的敏感程度不同。這可能與不同激素的種類和濃度會引起植物細胞在不同發(fā)育階段做出不同的反應(yīng)有關(guān)。

3.3 基因型的影響

基因型對作物組培效率的影響已經(jīng)得到廣泛證明。秦先超等[13]研究表明，福紅992的不定芽誘導(dǎo)率最高，福紅952最差。Saha等[8，12]在研究不同基因型的黃麻組織再生過程中，也發(fā)現(xiàn)了基因型差異導(dǎo)致的再生效率不同。苧麻研究中，基因型是苧麻外植體誘導(dǎo)愈傷組織和再生植株的決定因素，相同條件下綠芽誘導(dǎo)率湘苧6號＞湘苧2號＞蘆竹青＞湘苧3號＞C5[14]。相同培養(yǎng)條件下，黃殼早、湘苧2號、巴西麻6號基因型適應(yīng)性強，華苧1號適應(yīng)性差[15]。Raoul等[16]對兩種基因型玫瑰茄的愈傷組織誘導(dǎo)試驗表明，兩種基因型的差異明顯。本研究的結(jié)果也表明，圓果種黃麻的誘導(dǎo)、分化及植株再生能力均高于長果種黃麻，尤其是在不定芽和不定根的分化及再生植株方面，長果種黃麻的高效再生體系還有待進一步的探索和完善。王曉玲等[15]認為基因型能控制外植體的狀態(tài)，決定苧麻是否脫分化和愈傷組織增殖的狀態(tài)，而基因型差異造成的黃麻誘導(dǎo)和分化能力差異的原因尚未明確。

3.4 后續(xù)研究建議

本研究以4個黃麻品種為研究材料，研究了以黃麻幼莖為外植體構(gòu)建的組培再生體系。構(gòu)建的黃麻再生體系為今后的黃麻遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定了基礎(chǔ)。但是，由于研究中的長果種黃麻再生體系還不完善，只選用了尤溪長果和廣巴矮兩個品種，沒有嘗試更多的基因型和激素組合，需在此基礎(chǔ)上做進一步研究。