急性腦出血患者血清microRNA-140-5p的水平變化及臨床意義

王凱，李洪濤，胡潔濱

急性腦出血屬于神經(jīng)外科急危重癥，是腦卒中病情最嚴(yán)重的類型之一，指非外傷性腦實質(zhì)血管發(fā)生破裂出血，起病急，病程不穩(wěn)定，致殘率和病死率較高[1]。急性腦出血發(fā)生過程中伴隨血腫生成，可進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)，加重腦部損傷，治療后也多遺留神經(jīng)功能缺損，預(yù)后普遍較差[2]。目前數(shù)據(jù)[3]顯示，我國急性腦出血的發(fā)病率約為2 100～4 800/10 000人，近年呈逐年升高趨勢，嚴(yán)重威脅我國居民身體健康。尋找具體標(biāo)志物，評估急性腦出血患者的腦出血嚴(yán)重程度，并在早期明確預(yù)后，以便及時采取針對性治療，對改善患者預(yù)后，提高生活質(zhì)量，減輕其家庭及社會負(fù)擔(dān)具有重要意義。microRNA(miRNA)是一類非編碼小RNA，一般長約20～25個核苷酸，廣泛存在于真核生物體中，并參與機(jī)體的生理、病理活動，與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及功能均密切相關(guān)[4]。有研究[5]發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥，減少細(xì)胞凋亡，從而抑制骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。此外，miR-140可負(fù)調(diào)控神經(jīng)炎癥以減輕慢性收縮損傷大鼠的神經(jīng)性疼痛[6]。近年來有人發(fā)現(xiàn)，腦室內(nèi)注射miR-140-5p模擬物可減輕腦出血后大鼠的神經(jīng)炎癥和腦損傷[7]。但關(guān)于miR-140-5p與急性腦出血患者預(yù)后的關(guān)系尚鮮有報道。本研究分析miR-140-5p與急性腦出血血腫體積、神經(jīng)功能缺損程度及預(yù)后的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2019年7月至2020年10月本院收治的急性腦出血患者96例(觀察組)作為研究對象。男55例，女41例；年齡36～78歲，平均年齡(58.63±9.45)歲；平均體重指數(shù)(BMI)(24.50±3.52)kg/m2。選取同期在本院體檢健康的成年人100名(對照組)作為對照。男54例，女46例；年齡37～80歲，平均年齡(59.04±9.95)歲；平均BMI(24.16±3.77)kg/m2。兩組受試者在性別、年齡、BMI方面，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)急性腦出血診斷符合《中國腦出血診治指南(2014)》[8]，并經(jīng)CT或MRI檢查證實。(2)年齡>18歲，首次發(fā)病，并在發(fā)病后24 h內(nèi)入院。(3)患者或其家屬簽署了知情同意書。(4)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他疾病者，如惡性腫瘤、精神疾病、自身免疫性疾病、嚴(yán)重心肝腎功能不全、嚴(yán)重感染、血液系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、其他腦部疾病。(2)半年內(nèi)有腦出血、腦梗死等腦部病史者。(3)妊娠期及哺乳期婦女。(4)住院不滿72 h離院者。(5)臨床資料不全者。(6)隨訪不足3個月或隨訪期間死亡者。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、人IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒(貨號：R1200-100、RP1105、SEKH-0002、SEKH-0047)購自北京索萊寶科技有限公司；實時熒光定量PCR儀(RT-qPCR)試劑(貨號：abx098890)購自英國Abbexa；ABI 7500 RT-qPCR儀為美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品；FLX800酶標(biāo)儀為美國BioTek公司產(chǎn)品。

1.2.2 血液采集及miR-140-5p、炎癥因子表達(dá)檢測急性腦出血患者入院后抽取靜脈血5 ml，對照組于體檢時抽取，4 ℃離心取血清，-80 ℃保存。

采用RT-qPCR法檢測血清miR-140-5p水平。將血清于冰上融化后，使用總RNA提取試劑盒提取總RNA(OD260/OD280范圍為1.8～2.0)，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。使用RT-qPCR試劑配置反應(yīng)體系，在RT-qPCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。miR-140-5p上游引物：5′-GAG TGT CAG TGG TTT TAC CCT-3′，下游引物：5′-GCA GGG TCC GAG GTA TTC-3′；內(nèi)參U6上游引物：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。用2-ΔΔCt法表述血清miR-140-5p水平。

采用人IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒檢測血清IL-1β、TNF-α水平，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 血腫體積估算 采用多田式計算公式估算血腫體積，血腫體積=π/6×長(cm)×寬(cm)×高(cm)，長、寬、高由CT或MRI測量所得。

1.2.4 神經(jīng)功能缺損程度劃分 根據(jù)患者入院時的NIHSS評分，將患者分為輕度神經(jīng)功能缺損組(NIHSS評分<7分)、中度神經(jīng)功能缺損組(7分≤NIHSS評分≤15分)和重度神經(jīng)功能缺損組(NIHSS評分>15分)。

1.2.5 預(yù)后評估 根據(jù)急性腦出血患者發(fā)病3個月的mRS評分，將觀察組分為預(yù)后良好組(mRS≤2分)和預(yù)后不良組(mRS評分>2分)。

2 結(jié) 果

2.1 對照組、觀察組受試者血清miR-140-5p及炎癥因子水平比較 見表1。 與對照組相比，觀察組血清miR-140-5p水平顯著降低(P<0.05)，血清IL-1β、TNF-α水平顯著升高(均P<0.05)。

表1 對照組、觀察組血清miR-140-5p、IL-1β、TNF-α水平的比較(x±s)組別例數(shù)miR-140-5pIL-1β(pg/ml)TNF-α(pg/ml)對照組1001.32±0.152.24±0.3936.14±5.25觀察組960.55±0.127.46±1.07138.36±15.20t值39.58445.72863.430P值0.0000.0000.000

2.2 急性腦出血患者血清miR-140-5p水平與炎癥因子的相關(guān)性 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，急性腦出血患者血清miR-140-5p水平與血清IL-1β、TNF-α水平均呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.511，r=-0.513；均P<0.05)。

2.3 急性腦出血患者血清miR-140-5p水平與血腫體積的相關(guān)性 急性腦出血患者血腫體積為(28.54±6.93)ml。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，急性腦出血患者血清miR-140-5p水平與血腫體積呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.469，P<0.05)。

2.4 不同神經(jīng)功能缺損程度急性腦出血患者血清miR-140-5p水平的比較 見表2。 與輕度神經(jīng)功能缺損組相比，中度神經(jīng)功能缺損組急性腦出血患者血清miR-140-5p水平顯著降低(P<0.05)；與中度神經(jīng)功能缺損組相比，重度神經(jīng)功能缺損組急性腦出血患者血清miR-140-5p水平顯著降低(P<0.05)。

表2 不同神經(jīng)功能缺損程度急性腦出血患者血清miR-140-5p水平比較(x±s)組別例數(shù)miR-140-5p輕度神經(jīng)功能缺損組340.62±0.09中度神經(jīng)功能缺損組400.55±0.12*重度神經(jīng)功能缺損組220.43±0.07*△F值-24.088P值-0.000 注:與輕度神經(jīng)功能缺損組相比*P<0.05;與中度神經(jīng)功能缺損組相比△P<0.05

2.5 不同預(yù)后急性腦出血患者血清miR-140-5p水平的比較 見表3。 與預(yù)后良好組相比，預(yù)后不良組血清miR-140-5p水平顯著降低(P<0.05)。

表3 不同預(yù)后急性腦出血患者血清miR-140-5p水平比較(x±s)組別例數(shù)miR-140-5p預(yù)后良好組660.59±0.11預(yù)后不良組300.44±0.08t值-6.699P值-0.000

2.6 血清miR-140-5p水平對急性腦出血患者預(yù)后的預(yù)測價值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清miR-140-5p水平預(yù)測急性腦出血患者預(yù)后的ROC曲線下面積為0.881(95%CI：0.814～0.947)，其截斷值為0.52，敏感度為93.3%，特異度為75.8%，約登指數(shù)為0.691(圖1)。

圖1 ROC曲線分析血清miR-140-5p水平對急性腦出血患者預(yù)后的預(yù)測價值

3 討 論

急性腦出血是常見于中老年人群的疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可由高血壓、高血脂、顱內(nèi)血管老化畸形等引起[9]。近年來，隨著人口老齡化的加劇，高血壓等疾病的發(fā)病率逐年升高，導(dǎo)致急性腦出血的發(fā)病率亦逐年升高。急性腦出血會形成血腫，直接損傷正常腦組織，并刺激IL-1β、TNF-ɑ等各種炎癥因子分泌，造成不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)損傷，嚴(yán)重者可損害器官功能，臨床表現(xiàn)為語言障礙、運(yùn)動障礙、意識障礙、頭痛、頭暈等癥狀，嚴(yán)重影響患者健康及生活質(zhì)量，給家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)[10]。因此，早期判斷并預(yù)測急性腦出血病情，并及時采取干預(yù)措施，對患者的早期恢復(fù)及預(yù)后改善具有積極意義。

miRNA可作用于靶基因mRNA的3’UTR，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄后水平，廣泛參與機(jī)體的病理生理過程。近年來，研究[11-12]顯示，miRNA在腦血管病患者血液、腦組織中差異表達(dá)，參與腦血管病的發(fā)病及病情進(jìn)展，與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及功能密切相關(guān)，可用于疾病預(yù)后評估。Wang等[7]研究顯示，miR-140-5p可減輕腦出血后大鼠腦損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組急性腦出血患者血清miR-140-5p水平較對照組健康體檢者顯著降低，提示miR-140-5p在急性腦出血患者血清中表達(dá)異常，且其異常降低可能與患者發(fā)病有關(guān)。急性腦出血發(fā)生后，血液進(jìn)入腦室可直接壓迫腦室神經(jīng)或腦干，造成腦組織損傷，影響患者神經(jīng)功能，增加患者不良預(yù)后的概率[13]。本研究顯示，急性腦出血患者血清miR-140-5p水平與血腫體積呈顯著負(fù)相關(guān)，且隨著神經(jīng)功能缺損程度的升高，急性腦出血患者血清miR-140-5p水平逐漸降低，提示血清miR-140-5p水平與急性腦出血患者的血腫體積、神經(jīng)功能缺損程度均密切相關(guān)，進(jìn)而可能影響患者預(yù)后。

急性腦出血發(fā)病后常經(jīng)歷血腫期及腦水腫期兩個階段，其中血腫生成可引發(fā)炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)介入腦水腫的進(jìn)展并加重腦組織的繼發(fā)性損傷，影響患者神經(jīng)功能[14]。研究[15]顯示，血液破入腦室或腦實質(zhì)觸發(fā)炎癥信號，導(dǎo)致炎性細(xì)胞黏附聚集能力增強(qiáng)，TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)異常，并進(jìn)一步發(fā)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)，損傷神經(jīng)系統(tǒng)，加重腦水腫，采取針刺等治療方式抑制炎癥因子表達(dá)可減輕腦損傷。本研究顯示，急性腦出血患者血清IL-1β、TNF-α水平較健康體檢者顯著升高，提示急性腦出血患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)已加重。而相關(guān)性分析結(jié)果顯示，急性腦出血患者血清miR-140-5p水平與血清IL-1β、TNF-α水平均呈顯著負(fù)相關(guān)，提示miR-140-5p與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，患者炎癥反應(yīng)加重可能與miR-140-5p表達(dá)異常降低有關(guān)。黃伊娜等[16]研究亦表明，miR-140-5p可通過調(diào)控NF-κB信號通路降低脂多糖誘導(dǎo)的人牙髓細(xì)胞中IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子的分泌。彭侃等[17]研究也發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-140-5p可降低骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨組織中NLRP3等炎癥因子表達(dá)，發(fā)揮軟骨治療作用。Wang等[7]研究顯示，miR-140-5p減輕腦出血后大鼠腦損傷與抑制Toll樣受體4介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥有關(guān)。因此，可以推測急性腦出血患者血清miR-140-5p水平的異常降低可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)異常升高，加重腦損傷，影響神經(jīng)功能。

此外，本研究結(jié)果顯示，預(yù)后不良組急性腦出血患者血清miR-140-5p水平較預(yù)后良好組顯著降低，提示miR-140-5p水平的異常降低不僅與血腫體積、神經(jīng)功能缺損有關(guān)，還可能影響患者預(yù)后。為發(fā)掘miR-140-5p在急性腦出血中的預(yù)后價值，本研究通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-140-5p水平預(yù)測急性腦出血患者預(yù)后的ROC曲線下面積為0.881(0.814～0.947)，敏感度為93.3%，特異度為75.8%，表明血清miR-140-5p水平對急性腦出血患者預(yù)后具有較好的評估價值，監(jiān)測其水平有助于及時采取措施，降低預(yù)后不良風(fēng)險。

綜上所述，miR-140-5p在急性腦出血患者血清中顯著降低，其水平與血腫體積、神經(jīng)缺損程度及炎癥水平相關(guān)，對預(yù)后具有一定的預(yù)測價值，可用于臨床預(yù)后評估參考。但本研究尚未對miR-140-5p影響患者血腫體積、神經(jīng)缺損程度及炎癥水平的機(jī)制作深入探討，下一步將進(jìn)行大鼠實驗以明確其相關(guān)機(jī)制。