仔豬腸道菌群演替規(guī)律及其影響因素研究進(jìn)展

俞添賀，李 響，宋戰(zhàn)昀，王向輝，劉 博，王 準(zhǔn)，魏 箐，肖 芳，龔 賀，馮 新* (.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 006； .長(zhǎng)春海關(guān) 技術(shù)中心，吉林 長(zhǎng)春 006； .哈爾濱海關(guān) 技術(shù)中心,黑龍江 哈爾濱 500)

仔豬的腸道中存在著能夠與仔豬互利共生、相互影響的微生物菌群。這些微生物在仔豬腸道內(nèi)構(gòu)成一個(gè)微生態(tài)平衡，這種平衡在機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝、生長(zhǎng)發(fā)育和抗病能力等方面都發(fā)揮著十分重要的作用，其相關(guān)研究已經(jīng)得到了越來(lái)越多的關(guān)注[1]。這些菌群常常被認(rèn)為是仔豬的一個(gè)“器官”，在仔豬生長(zhǎng)、繁殖等代謝過(guò)程中，這些微生物具有仔豬本身器官所沒(méi)有的功能，如通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群組成來(lái)減少豬脂肪沉積等[2]。但是，在仔豬的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程當(dāng)中，其腸道菌群不可避免地受到飼養(yǎng)環(huán)境、飲食、應(yīng)激等諸多因素的影響，所以，保證仔豬腸道菌群的健康對(duì)維持機(jī)體正常的生理代謝具有極其重要的意義[3]。隨著培養(yǎng)組學(xué)的不斷發(fā)展，豬腸道中能夠直接引起表型變化和疾病發(fā)生的菌株將會(huì)被逐漸鑒別[4]。仔豬大腸發(fā)達(dá)，其中存在的大量微生物對(duì)所采食的物質(zhì)進(jìn)行消化吸收，如高纖維物質(zhì)、脂肪、不溶性蛋白質(zhì)等，這些難消化的物質(zhì)經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵后能夠產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)給機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)。仔豬腸道菌群相關(guān)影響因素的研究，對(duì)仔豬疾病預(yù)防、促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)發(fā)育意義重大。劉家奇等[5]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)動(dòng)物腸道菌群進(jìn)行調(diào)節(jié)能夠抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)展,并提高宿主抗病能力進(jìn)而改善宿主健康狀況。劉紅南等[6]研究表明，通過(guò)對(duì)功能性飼料的優(yōu)化使用，能夠?yàn)樗拗骱竽c道菌群提供更好地利用氮的環(huán)境，提高氮利用率以降低畜禽氨氣的產(chǎn)生，進(jìn)而可改善大氣質(zhì)量。對(duì)于仔豬腸道菌群定植、發(fā)展、演替規(guī)律、多樣性以及影響因素的研究，能夠?yàn)樽胸i的科學(xué)飼養(yǎng)及管理提供幫助。

1 仔豬腸道菌群的演替規(guī)律及多樣性

仔豬腸道菌群的發(fā)展、定植是動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，對(duì)于仔豬成長(zhǎng)的每個(gè)階段，腸道內(nèi)都會(huì)有相應(yīng)的菌群發(fā)揮作用。仔豬腸道菌群包括腸道內(nèi)的古細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物菌、細(xì)菌、病毒等。在豬的長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，腸道內(nèi)菌群的平衡能夠得以維持正是因?yàn)槟c道內(nèi)微生物發(fā)揮著作用，這種平衡對(duì)于仔豬生長(zhǎng)、發(fā)育有著重要作用。開(kāi)展仔豬腸道菌群的研究，對(duì)于促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義。

1.1 仔豬腸道菌群發(fā)生、發(fā)展演替規(guī)律仔豬腸道菌群并不是與生俱來(lái)的，而是在仔豬出生后，通過(guò)與母豬生殖道、皮膚、糞便等的接觸而獲得的，并且在后天生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中逐步形成(圖1)。健康母豬的消化道菌群，將對(duì)新生仔豬的腸道發(fā)育和屏障功能產(chǎn)生重要影響[7]。在仔豬生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段，其腸道菌群的組成有著非常大的差別。隨著仔豬日齡的不斷增加，其腸道菌群也發(fā)生一定規(guī)律的變化[8]。楊柳等[9]研究表明，仔豬在母體內(nèi)處在一種無(wú)菌的狀態(tài)，在仔豬分娩以后，因?yàn)槭艿侥肛i產(chǎn)道微生物和空氣中微生物的影響，腸道內(nèi)才開(kāi)始定植微生物。但是，李浩等[10]表明，仔豬在胚胎時(shí)期，由于不可避免的吞飲羊水，其腸道內(nèi)已經(jīng)開(kāi)始定植微生物。在整個(gè)仔豬腸道菌群產(chǎn)生的過(guò)程當(dāng)中，歷經(jīng)從無(wú)菌到需氧菌到兼性厭氧菌到專(zhuān)性厭氧菌的4個(gè)階段的過(guò)程。

圖1 仔豬腸道菌群母源傳遞示意圖

仔豬腸道中能夠幫助仔豬利用母乳中營(yíng)養(yǎng)成分的細(xì)菌為乳酸桿菌與鏈球菌。仔豬斷奶后，腸道菌群的組成也會(huì)發(fā)生改變，經(jīng)歷從簡(jiǎn)單到復(fù)雜的變化[11]。大腸桿菌數(shù)量在仔豬出生的12 h呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)；仔豬在出生48 h后，乳酸菌和鏈球菌數(shù)量逐漸呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)[12]。而斷奶仔豬腸道中的菌群又發(fā)生了非常大的變化，擬桿菌屬細(xì)菌逐漸成為主要的厭氧菌群[13]。由此可知，仔豬腸道菌群是按照一定順序建立起來(lái)的，并且有一定規(guī)律的在腸道中變化[14]。仔豬在出生后，極短的時(shí)間內(nèi)就可以在腸道內(nèi)形成比較成熟的腸道菌群，仔豬個(gè)體之間腸道菌群的結(jié)構(gòu)存在差異，但每個(gè)仔豬的菌群均能平衡存在[15]。

1.2 豬腸道菌群的多樣性動(dòng)物腸道中的細(xì)菌類(lèi)微生物多達(dá)100萬(wàn)億，這個(gè)數(shù)量約是機(jī)體細(xì)胞數(shù)量的10倍，其種類(lèi)多達(dá)500種[16-18]。這些微生物主要是細(xì)菌，根據(jù)這些微生物對(duì)于氧氣的需求，能夠?qū)⑵浞譃樾柩蹙?、厭氧菌兩?lèi)[19]。豬的腸道菌群涉及范圍非常廣泛，共涉及到25門(mén)、47綱、79目、121科、207屬和390種[20]。伴隨著細(xì)菌非培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)仔豬腸道菌群的研究更加地精細(xì)化。在仔豬體內(nèi)腸道的不同位置，其菌群的分布也存在著不同[21]，即使是同一種細(xì)菌，在不同腸道位置環(huán)境下，其相對(duì)豐度也存在顯著性差異[22]，這種現(xiàn)象和腸道的不同位置有著不同生理狀態(tài)和生理功能密切相關(guān)。郭曉紅等[23]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，比較研究A(晉汾白豬)、B(馬身豬)2種仔豬在生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段結(jié)腸菌群結(jié)構(gòu)與特征的差異，其腸道菌群分布較為廣泛。厚壁菌門(mén)(Firmicutes)與擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)在結(jié)果中呈現(xiàn)優(yōu)勢(shì)占比，在3個(gè)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段，平均占比分別達(dá)到49%與32%，優(yōu)勢(shì)較為明顯。在2種仔豬結(jié)腸菌群中，厚壁菌門(mén)所占比例均逐步增大，且A仔豬厚壁菌門(mén)占比隨日齡增大程度明顯高于B仔豬。A仔豬3個(gè)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段結(jié)腸菌群中擬桿菌門(mén)占比都在30%左右，但B仔豬3個(gè)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段結(jié)腸菌群中擬桿菌門(mén)占比呈現(xiàn)由35%到23%再到46%的變化。變形菌門(mén)(Proteobacteria)和梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)在2種仔豬從出生到斷奶后，在結(jié)腸菌群中的占比波動(dòng)較大，在仔豬出生時(shí)，變形菌門(mén)在不同品種仔豬結(jié)腸菌群中占比差別較大，A仔豬比例(24%)明顯高于B仔豬(4%)，而梭桿菌門(mén)則表現(xiàn)相反，B仔豬1日齡時(shí)占比(28%)則顯著高于A仔豬(17%)，如圖2所示。對(duì)于仔豬腸道優(yōu)勢(shì)菌群分布規(guī)律的研究所呈現(xiàn)出的結(jié)果不是完全相同[24]，仔豬腸道菌群的產(chǎn)生和發(fā)展會(huì)因?yàn)槠贩N、年齡等的不同而發(fā)生不一樣的變化[25]。

圖2 2個(gè)品種豬結(jié)腸菌群門(mén)水平組成分析結(jié)果[23]

2 影響仔豬腸道菌群演替變化的內(nèi)在因素

仔豬從出生到斷奶后2周是生長(zhǎng)關(guān)鍵期，在這個(gè)時(shí)間段內(nèi)腸道菌群定植并初步成熟。仔豬腸道菌群會(huì)發(fā)生比較劇烈的變化，菌群會(huì)隨著內(nèi)外因素的共同影響而發(fā)生改變，如飼養(yǎng)環(huán)境、食物類(lèi)型、斷奶應(yīng)激等。不僅如此，腸道菌群建立也是與宿主相互作用和長(zhǎng)期自然選擇的結(jié)果，宿主的遺傳因素在菌群的組成和結(jié)構(gòu)上起到了決定性的作用。

2.1 品種動(dòng)物腸道菌群的基因與人類(lèi)腸道菌群的基因在遺傳性上存在相似性，不同動(dòng)物品種的腸道菌群基因會(huì)存在明顯差別。通過(guò)對(duì)美國(guó)人與歐洲人腸道菌群基因的對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群基因有上千萬(wàn)個(gè)單堿基發(fā)生變異，樣本中的每個(gè)人都可以通過(guò)腸道菌群的遺傳基因進(jìn)行鑒別。通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)在相同環(huán)境下的4個(gè)品種淡水魚(yú)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，4種魚(yú)的腸道菌群多樣性存在明顯差異。在山羊品種與腸道菌群之間關(guān)系的研究中同樣發(fā)現(xiàn)了這點(diǎn)，對(duì)于品種相同的山羊而言，其腸道菌群相似度極高，不同品種山羊的腸道菌群差異較大。

仔豬腸道內(nèi)菌群因豬品種的不同而存在差異。CHEN等[22]通過(guò)對(duì)不同年齡、性別、地理區(qū)域的野豬和杜洛克豬的樣本進(jìn)行深度宏基因組測(cè)序，通過(guò)對(duì)野豬和高度商業(yè)化杜洛克豬2種不同飼養(yǎng)條件下豬的腸道菌群的比較研究，發(fā)現(xiàn)2個(gè)品種豬腸道菌群在菌種組成上存在差異。雙胞胎的腸道菌群相似性比無(wú)基因關(guān)聯(lián)的個(gè)體間表現(xiàn)得更加明顯，而同卵雙生比異卵雙生腸道菌群相似程度更高，這表明仔豬品種的遺傳因素對(duì)腸道菌群影響很大。對(duì)藏豬與瘦肉型豬腸道菌群組成探究試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[26]，藏豬與榮昌豬和大白豬相比，腸道內(nèi)的厚壁菌和螺旋菌比例更高且擬桿菌的比例更低，藏豬螺旋菌的比例比榮昌豬高出許多；而大白豬、榮昌豬和藏豬相比，腸道內(nèi)無(wú)壁菌的比例更高及纖維桿菌和迷蹤菌的比例更低，在藏豬糞便中，乳酸菌的比例顯著高于其余2種豬。對(duì)民豬和大白豬腸道菌群的比較研究發(fā)現(xiàn)，大白豬的厭氧弧菌屬比民豬高4.5倍，梭菌屬比民豬高3.5倍，民豬的纖維桿菌屬比大白豬高出3.6倍，螺旋菌屬比大白豬高出1.7倍，密螺旋體屬比大白豬高出1.8倍。高鵬飛等[27]對(duì)梅山豬與長(zhǎng)白豬腸道優(yōu)勢(shì)菌門(mén)進(jìn)行比較研究發(fā)現(xiàn)，梅山豬腸道優(yōu)勢(shì)菌門(mén)數(shù)量大幅度低于長(zhǎng)白豬，但其優(yōu)勢(shì)菌門(mén)所占比例大幅度高于長(zhǎng)白豬。YANG等[28]對(duì)國(guó)內(nèi)外8種不同品種的豬腸道菌群進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)體脂含量較高品種豬的腸道菌群類(lèi)型相近，國(guó)外體脂含量較低品種豬的腸道菌群類(lèi)型相近，且國(guó)內(nèi)體脂含量較高品種豬的腸道菌群類(lèi)型更多。在豬的腸道菌群中，厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)數(shù)量最多，占比在90%以上，其他菌門(mén)加在一起平均不到總?cè)郝涞?%，厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)在不同品種豬的腸道菌群中占比不同(表1)。

表1 不同品種豬腸道優(yōu)勢(shì)菌門(mén)占比[28] %

在對(duì)不同脂肪型豬腸道菌群多樣性進(jìn)行比較研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，金華豬的厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度高于長(zhǎng)白豬，而長(zhǎng)白豬擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度高于金華豬；榮昌豬和藏豬的厚壁菌門(mén)都比大白豬高，而大白豬的擬桿菌門(mén)比榮昌豬和藏豬高，具體數(shù)據(jù)如表2所示。以上研究足以表明豬的不同品種能夠?qū)ζ淠c道菌群多樣性產(chǎn)生重要影響。

表2 不同脂肪型豬腸道優(yōu)勢(shì)菌門(mén)占比[28] %

2.2 日齡動(dòng)物體內(nèi)腸道菌群的結(jié)構(gòu)是隨著年齡不斷變化的。STEFANO等[29]通過(guò)對(duì)3個(gè)不同年齡段人群的糞便樣品進(jìn)行分析研究發(fā)現(xiàn)，少年及中年樣品中的雙歧桿菌、乳酸桿菌含量明顯比老年人高。對(duì)我國(guó)部分地區(qū)相同民族不同年齡志愿者的糞便樣品進(jìn)行分析研究發(fā)現(xiàn)，不同年齡樣品中的優(yōu)勢(shì)菌群占比差異較大，哺乳期志愿者樣品中雙歧桿菌占比明顯比青年志愿者樣品和中年志愿者樣品高，且3組志愿者樣品中乳桿菌屬占比差異明顯[30]。在相同養(yǎng)殖水體和飼糧條件下對(duì)不同日齡大黃魚(yú)腸道菌群結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，不同日齡的大黃魚(yú)分別產(chǎn)生了具有明顯差異的腸道菌群[31]。研究年齡與牦牛腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，年齡差異較大的牦牛腸道菌群有較大差別，對(duì)于年齡相近的牦牛而言，其腸道菌群差異較小，成年牦牛比犢牦牛腸道菌群類(lèi)型更加多樣。

隨著仔豬日齡的增長(zhǎng)，腸道菌群的多樣性也隨著發(fā)生變化，仔豬腸道菌群變得越來(lái)越復(fù)雜，其數(shù)量趨于穩(wěn)定[32]。NIU等[33]研究發(fā)現(xiàn)，仔豬腸道菌群的多樣性與仔豬日齡存在緊密的關(guān)聯(lián)。不同品種仔豬之間腸道微生物差異不是十分明顯，而仔豬的不同生長(zhǎng)時(shí)期其腸道菌群類(lèi)型較為不同[34]。對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段仔豬腸道菌群差異性研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門(mén)豐度呈先升后降的變化，從60日齡到120日齡逐漸上升(76.22%～91.84%)，從120日齡到180日齡逐漸下降(91.84%～72.05%)；擬桿菌門(mén)豐度呈先降后升的變化，從60日齡到120日齡逐漸下降(19.47%～5.34%)，從120日齡到180日齡又逐漸上升(5.34%～8.46%)；螺旋體門(mén)(Spirochaetae)所占比例越來(lái)越大，從60日齡到180日齡明顯增加(0.21%～17.82%)[35]，具體數(shù)據(jù)如表3所示。

表3 不同日齡豬腸道優(yōu)勢(shì)菌門(mén)占比[35] %

3 小結(jié)與展望

豬的腸道菌群受品種、日齡等多種因素的影響。對(duì)仔豬整個(gè)生命周期中腸道菌群的縱向變化過(guò)程和仔豬成長(zhǎng)每個(gè)階段腸道菌群主要影響因素的深入研究十分必要。較多研究確定仔豬腸道菌群影響宿主的健康，但是對(duì)于腸道菌群的深入研究仍然停留在菌群組成與表型相關(guān)聯(lián)的研究，對(duì)于腸道菌群在仔豬整個(gè)生命周期中不斷變化的演替過(guò)程和對(duì)仔豬生長(zhǎng)發(fā)育的直接影響機(jī)制的研究還不是很多，此研究方向依然有很多不確定性和局限性。對(duì)于豬腸道菌群相關(guān)性的研究較多，但是很多研究的機(jī)理尚不明確，在這樣的情況下，很難將相關(guān)性研究的原因和結(jié)果加以區(qū)分，并對(duì)機(jī)理加以借鑒和應(yīng)用。

我國(guó)是全世界公認(rèn)的生豬生產(chǎn)和豬肉消費(fèi)大國(guó)，但我國(guó)的生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)還存在著諸多問(wèn)題，如相關(guān)疾病的防制、飼料利用率不高，對(duì)自然環(huán)境影響較大等。隨著禁抗時(shí)代的到來(lái)，找到能夠替代抗生素的行之有效的疫病防制方法至關(guān)重要，腸道菌群方面的研究提供了一個(gè)新的思路。傳統(tǒng)的食品安全研究主要集中在屠宰之后，包括屠宰、分裝、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸和后期的批發(fā)零售，并且集中在一種或幾種食源性致病菌上，豬腸道菌群的研究，可以為食品安全研究拓展到屠宰之前，同時(shí)，也能夠?yàn)槭称钒踩芯刻峁┮粋€(gè)比較完整的致病菌圖譜。

通過(guò)對(duì)仔豬腸道菌群的不斷探索，發(fā)現(xiàn)腸道菌群在調(diào)節(jié)仔豬健康和控制疾病等方面發(fā)揮著非常重要的作用，人工干預(yù)腸道菌群以增強(qiáng)仔豬的健康狀況的方法，其應(yīng)用前景十分廣闊。如通過(guò)人工移植的方式，把健康動(dòng)物的糞便菌液經(jīng)過(guò)加工后，利用消化道途徑給予受體動(dòng)物，通過(guò)干預(yù)受體動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)以達(dá)到預(yù)期效果，這樣的方法是目前該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，此方法對(duì)受體動(dòng)物具有先天性?xún)?yōu)勢(shì)，與其他的干預(yù)方法相比較，更加的安全、環(huán)保。糞便菌群對(duì)于大腸腸腔內(nèi)的菌群有較強(qiáng)的代表性，對(duì)于其他腸段(如小腸)的菌群代表性極弱，因此目前較為常見(jiàn)的糞菌移植可能僅對(duì)大腸菌群有明顯的干預(yù)作用，而對(duì)于具有重要生理功能的小腸菌群影響不大。LI等[36]的研究首次證明了不同腸段的菌群定植具有區(qū)域特異性，即源于大腸的菌群易定植于大腸，而小腸的菌群易定植于小腸。該研究通過(guò)進(jìn)一步對(duì)比分析常規(guī)糞菌移植(FMT)和全腸菌群移植(WIMT)在塑造無(wú)菌動(dòng)物不同腸道段菌群方面的差異，表明WIMT更有助于小腸菌群的植入。因此，WIMT或能作為FMT的替代方法，對(duì)不同腸道區(qū)域的菌群進(jìn)行更加精確和目的性的干預(yù)。

在豬腸道菌群的研究上，一些基礎(chǔ)的生態(tài)學(xué)、生理學(xué)方面的問(wèn)題亟待解決，如：調(diào)控豬腸道菌群的主要因子是什么?調(diào)控豬腸道菌群的最佳時(shí)間是什么？豬腸道內(nèi)哪些是常駐菌、哪些是過(guò)路菌？豬腸道內(nèi)是否存在一個(gè)核心菌群？豬腸道菌群的定植是否存在優(yōu)先效應(yīng)？加大對(duì)基礎(chǔ)學(xué)中的生態(tài)學(xué)、生理學(xué)相關(guān)方面的研究，不僅能對(duì)以上問(wèn)題加以闡釋、解答。同時(shí)能夠總結(jié)出一套以大數(shù)據(jù)相關(guān)性分析、細(xì)菌培養(yǎng)組學(xué)、益生菌培養(yǎng)、動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證為主要程序的技術(shù)體系，以此來(lái)進(jìn)一步闡釋豬、腸道菌群、飼料及環(huán)境之間的相互作用關(guān)系。

目前，對(duì)于豬腸道菌群組的深入研究仍然較少，其主要原因是由于缺少豬腸道菌群組較為全面的基因組目錄，因此宏基因組測(cè)序結(jié)果不能做到有效的檢測(cè)和分析。黃路生院士團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)不同來(lái)源的豬腸道菌群組深度宏基因組測(cè)序并對(duì)現(xiàn)有豬腸道菌群基因組進(jìn)行整合，重新構(gòu)建了一個(gè)目前較為完整的豬腸道菌群基因目錄(PIGC)和基于宏基因組組裝的基因組(MAG)。該研究中構(gòu)建的基因組為深入了解豬腸道微生物組和未來(lái)基于宏基因組測(cè)序的研究提供了重要而有力的資源。隨著培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)的持續(xù)發(fā)展，在研究腸道菌群組成、結(jié)構(gòu)的同時(shí)，深入了解其對(duì)宿主動(dòng)態(tài)影響的機(jī)制，并加以良性利用，可保證仔豬腸道健康，促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)發(fā)育。綜上所述，利用干預(yù)腸道菌群技術(shù)來(lái)增強(qiáng)豬的生產(chǎn)性能和提高豬的健康水平具有較大操作難度，但其應(yīng)用前景十分廣闊。