藍(lán)舌病病毒NS3蛋白抑制細(xì)胞Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生

朱 沛，肖 雷，吳 梅,李 珂,信愛國(guó) (云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

藍(lán)舌病(bluetongue,BT)是由藍(lán)舌病病毒(BTV)引起的能感染多種家養(yǎng)及野生反芻動(dòng)物的非接觸性蟲媒病毒傳染病，發(fā)病動(dòng)物主要表現(xiàn)為發(fā)熱、口唇充血腫脹及糜爛、鼻腔及胃腸黏膜嚴(yán)重卡他性炎癥[1-3]，伴隨舌頭發(fā)紺，動(dòng)物感染藍(lán)舌病的平均病死率為30%，綿羊高達(dá)80%。由于藍(lán)舌病對(duì)世界經(jīng)濟(jì)的影響，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將藍(lán)舌病列為A類疫病，中國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。

BTV為呼腸孤病毒科(Reovirid)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)成員，基因組由10個(gè)節(jié)段的雙鏈RNA(dsRNA)組成[4-5]，可編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP7)和5種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1～NS3、NS3a、NS-4)[6-8]，其中S10基因編碼BTV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3。

BTV在體內(nèi)和體外試驗(yàn)感染多種宿主(綿羊、黃牛、小鼠和人類)或不同組織后都能誘導(dǎo)強(qiáng)的Ⅰ型IFN(IFN-Ⅰ)反應(yīng)[9]。有研究表明BTV誘導(dǎo)IFN-Ⅰ產(chǎn)生的信號(hào)通路中，病毒入侵宿主細(xì)胞后，分別被RIG-Ⅰ(視黃酸誘導(dǎo)基蛋白Ⅰ)和MDA5(黑色素瘤分化相關(guān)基因5)識(shí)別，隨后MAVS激活下游TRAF3、TBK1和IKK-i對(duì)IRF3/IRF7進(jìn)行磷酸化活化修飾，活化的IRF3/IRF7轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，啟動(dòng)IFN-Ⅰ的產(chǎn)生[10-12]。但目前，BTV復(fù)制與誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生IFN-Ⅰ的關(guān)系尚不清楚，BTV不同毒株和不同血清型對(duì)誘導(dǎo)IFN-Ⅰ反應(yīng)的影響也未明確。

干擾素(interferon,IFN)是在特定的誘生劑刺激下由細(xì)胞產(chǎn)生的一類具有高度生物活性的糖蛋白，是能干擾病毒復(fù)制的細(xì)胞因子。根據(jù)IFN蛋白的氨基酸序列、細(xì)胞來源以及它們所結(jié)合受體的不同，分為IFN-Ⅰ和Ⅱ，IFN-β是IFN-Ⅰ的亞型，主要由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。有研究表明BTV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3對(duì)IFN-β的生成有強(qiáng)烈抑制作用，但BTV NS3蛋白如何影響IFN-β合成、BTV NS3蛋白在IFN-β產(chǎn)生的信號(hào)通路中有何作用、在拮抗宿主先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮何種作用尚未明確。

本研究選用BTV-1和BTV-16感染人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)和犢牛原代腎細(xì)胞(MDBK)探索不同血清型、不同病毒載量、不同作用時(shí)間的BTV對(duì)細(xì)胞IFN-Ⅰ產(chǎn)生的影響，以明確BTV不同毒株和不同血清型對(duì)誘導(dǎo)IFN-Ⅰ產(chǎn)生的影響；通過構(gòu)建BTV NS3真核表達(dá)質(zhì)粒，用qPCR、雙熒光素酶報(bào)告基因和ELISA方法探索在細(xì)胞中過表達(dá)BTV NS3蛋白對(duì)IFN-Ⅰ轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平的調(diào)控和影響，驗(yàn)證NS3對(duì)IFN-β的抑制作用。其結(jié)果有助于了解BTV的致病機(jī)理和對(duì)宿主天然免疫的拮抗機(jī)制，同時(shí)揭示了BTV NS3蛋白在抑制IFN-Ⅰ產(chǎn)生中的作用，對(duì)BTV疫苗研發(fā)及抗病毒治療具有科學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與病毒BTV-1、BTV-16標(biāo)準(zhǔn)病毒株由動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)參考實(shí)驗(yàn)室Onderstepoort Veterinary Institute(South Africa)饋贈(zèng)；BHK-21細(xì)胞、牛腎傳代細(xì)胞(MDBK)和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)由云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.2 主要試劑MagMAXTM-96 Viral Isolation Kit購(gòu)自ABI公司；MEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司；Real Time qRT-PCR試劑盒、One Step TB Green?PrimeScriptTMPLUS RT-PCR Kit、DNA膠回收試劑盒、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、T4DNA連接酶購(gòu)自大連寶生物公司；pEGFP-N2載體購(gòu)自Clotech公司；Peasy-Blunt Cloning Vector載體、T-ransIntroTMEL購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶NheⅠ、BamⅠ購(gòu)自Thermo Fisher公司；Bovine&Human IFN-β ELISA Kit購(gòu)自USA TSZ biological Trade Co.Ltd.；Dual-Luciferase Reporter Assay System購(gòu)自Promega公司。

1.3 引物根據(jù)GenBank中登錄的人和牛IFN-β序列設(shè)計(jì)特異性引物，以β-actin作為內(nèi)參，根據(jù)GenBank中公布的BTV毒株序列設(shè)計(jì)BTV NS3(Seg-10)引物序列，引物設(shè)計(jì)使用Oligo 7.0和Primer 5.0軟件進(jìn)行，引物由上海捷瑞生物公司合成，純度為HPLC級(jí)，用DEPC水稀釋至終濃度為10 μmol/L。引物序列見表1。

1.4 BTV-1和BTV-16的培養(yǎng)與TCID50測(cè)定取500 μL BTV-1和BTV-16毒株病毒液接種于長(zhǎng)成70%～80%單層的BHK-21細(xì)胞瓶(25 cm2)中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h，取出倒掉細(xì)胞瓶中液體，加入10 mL MEM維持液，每日觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)達(dá)到“+++”(75%)時(shí)收獲病毒，3 500 r/min離心15 min，取上清液，細(xì)胞沉淀凍存于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩ｋx心后的病毒上清液用1×MEM培養(yǎng)液將病毒按10倍倍比稀釋，取長(zhǎng)滿單層BHK-21細(xì)胞的96孔板，棄去培養(yǎng)液，將稀釋好的病毒液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，從第1列開始加入，每個(gè)稀釋度重復(fù)8個(gè)孔，每孔加入100 μL稀釋好的病毒稀釋液，空白對(duì)照加100 μL 1×MEM培養(yǎng)液，37℃吸附1 h后，每孔加入100 μL細(xì)胞維持液，37℃、5%CO2培養(yǎng)，逐日觀察，7 d后終判，用Karber方法計(jì)算病毒效價(jià)(TC-ID50)。

1.5 BTV-1和BTV-16誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生IFN-β為探索BTV不同血清型、不同病毒載量及不同感染時(shí)間對(duì)上皮細(xì)胞產(chǎn)生IFN-β的影響。本研究選用BTV-1和BTV-16作用于A549和MDBK，設(shè)置不同的病毒感染組(MOI分別為1.00,0.10和0.01組)。將上述細(xì)胞鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)計(jì)數(shù)，接種病毒后，37℃、5%CO2培養(yǎng)。試驗(yàn)設(shè)置 BTV-1感染組、BTV-16感染組以及正常細(xì)胞對(duì)照組，每組設(shè)0,12,24,36,48,72,96 h共7個(gè)感染時(shí)間點(diǎn)，每組重復(fù)4個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)上清用BTV Seg-10群特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增以檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)BTV RNA，驗(yàn)證不同MOI的BTV-1及BTV-16在A549和MDBK細(xì)胞上的增殖規(guī)律；同時(shí)用Human IFN-β ELISA Kit 和Bovine IFN-β ELISA Kit檢測(cè)試劑盒測(cè)定當(dāng)MOI=0.10時(shí)，BTV-1和BTV-16感染后不同時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生IFN-β的量。方法如下：分別在BTV-1和BTV-16感染細(xì)胞后的0,12,24,36,48,72,96 h 收集病毒培養(yǎng)液，3 500 r/min離心20 min收集上清液，在酶標(biāo)包被板的孔中加入40 μL樣品稀釋液，然后加入待檢樣品10 μL，按照ELISA Kit試劑盒使用說明操作，在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定各孔的D值。

1.6 BTV NS3真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定提取BTV-1的總mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄程序如下：30℃ 10 min，42℃ 60 min，70℃ 10 min。以合成的cDNA為模板、以BTV NS3 NheⅠ-BamⅠ為引物，擴(kuò)增BTV-1的NS3片段。擴(kuò)增程序：98℃ 2 min；98℃ 10 s，56℃ 10 s，72℃ 10 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，目的片段進(jìn)行膠回收純化后連接于Peasy-Blunt Cloning Vector載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)正確克隆的NS3基因和熒光質(zhì)粒PEGFP-N2分別用限制性內(nèi)切酶NheⅠ、BamⅠ進(jìn)行雙酶切，37℃反應(yīng)15 min，酶切產(chǎn)物通過1%凝膠電泳檢測(cè)。將符合預(yù)期大小的NS3基因與熒光質(zhì)粒PEGFP-N2用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，在涂有Kan+的LB平板上過夜培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。將陽性的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.7 qPCR方法檢測(cè)過表達(dá)NS3后NS3和IFN-β mRNA的表達(dá)情況按照TransIntroTMEL轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染800 ng NS3重組質(zhì)粒，分別在轉(zhuǎn)染后0,24,48,72 h這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集A549和MDBK細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)液在-20℃與4℃下反復(fù)凍融3次，使細(xì)胞完全裂解后，3 500 r/min離心15 min，離心后的上清液用qPCR方法檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染時(shí)間A549和MDBK中NS3和IFN-β的mRNA，其中NS3 mRNA的檢測(cè)用BTV Seg-10群特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：42℃ 5 min；95℃ 10 s；(94℃ 10 s，60℃ 30 s)×45個(gè)循環(huán)。A549和MDBK中IFN-β mRNA分別用人和牛的IFN-β特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，以β-actin 作為內(nèi)參，反應(yīng)條件：42℃ 5 min；95℃ 10 s；(94℃ 5 s，60℃ 34 s)×45個(gè)循環(huán)。Add Dissociation Protocol：95℃ 15 s；60℃ 1 min；95℃ 15 s。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)IFN-β啟動(dòng)子表達(dá)分別構(gòu)建含待檢測(cè)基因IFN-β啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒，其中含有人源IFN-β啟動(dòng)子的報(bào)告質(zhì)粒命名為H-IFN-β-Luc，含有牛源IFN-β啟動(dòng)子的報(bào)告質(zhì)粒命名為C-IFN-β-Luc；分別用不同劑量的PEGFP-N2-NS3重組質(zhì)粒和H-IFN-β-Luc報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染 24 h后感染BTV-1，16 h后收取樣品進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，分別用不同劑量的PEGFP-N2空質(zhì)粒和H-IFN-β-Luc報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染 24 h后感染BTV-1，16 h后收取樣品測(cè)定熒光素酶活性。具體方法如下：將A549細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞密度為60%～70%時(shí)，將不同劑量的 PEGFP-N2-NS3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染100 ng H-IFN-β-Luc，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行孔。轉(zhuǎn)染24 h后，加入BTV-1，16 h后去除培養(yǎng)基，用1×PBS清洗培養(yǎng)細(xì)胞后，每孔加入100 μL 1×PLB，在室溫下輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板15 min以裂解細(xì)胞。向1支干凈的EP管中加入100 μL LARⅡ，加入20 μL上一步中經(jīng)PLB裂解的細(xì)胞液，用槍頭吹打2～3次(切勿渦旋混勻)，檢測(cè)螢火蟲熒光素酶的活性；在10 s內(nèi)讀取完螢火蟲熒光素酶發(fā)光數(shù)值后，加入100 μL Stop&Glo試劑，檢測(cè)海腎熒光素酶的活性；讀取完海腎熒光素酶發(fā)光數(shù)值后，計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性(以誘導(dǎo)倍數(shù)表示)=[每個(gè)樣品的螢火蟲熒光素酶熒光強(qiáng)度(FL-Luc)/海腎熒光素酶熒光強(qiáng)度(RL-Luc)]/(對(duì)照FL-Luc/RL-Luc)，同理分別用不同劑量的PEGFP-N2-NS3重組質(zhì)粒和C-IFN-β-Luc共轉(zhuǎn)染MDBK細(xì)胞，操作方法及結(jié)果判定同上。

2 結(jié)果

2.1 BTV-1和BTV-16的培養(yǎng)與TCID50測(cè)定將BTV-1和BTV-16毒株病毒液分別接種于單層的BHK-21，盲傳到第3代時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE，主要表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮、崩解、脫落，根據(jù)1.4中方法測(cè)定病毒效價(jià)，用Karber方法計(jì)算TCID50，其中BTV-1毒株的TCID50為10-5.25/0.1 mL，BTV-16毒株的TCID50為10-6.17/0.1 mL。

2.2 BTV-1和BTV-16能誘導(dǎo)A549和MDBK產(chǎn)生IFN-β按照1.5中的方法，分別檢測(cè)MOI為1.00,0.10和0.01的BTV-1和BTV-16感染A549和MDBK細(xì)胞后0,12,24,36,48,72,96 h培養(yǎng)液中BTV RNA的含量，同時(shí)用ELISA方法檢測(cè)MOI=0.10時(shí)，BTV-1和BTV-16誘導(dǎo)A549和MDBK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-β的情況。結(jié)果表明：BTV-1和BTV-16都能感染A549和MDBK細(xì)胞并在其中增殖；且BTV RNA的量與MOI呈正相關(guān)，接種后的0～72 h BTV RNA不斷增長(zhǎng)，到72 h抵達(dá)峰值，72～96 h又不斷下降；研究還發(fā)現(xiàn)相同血清型的BTV在MDBK中的增長(zhǎng)量要高于A549，說明MDBK可能比A549更適合BTV-1和BTV-16增殖；ELISA結(jié)果顯示MOI=0.10的BTV-1和BTV-16都能誘導(dǎo)A549和MDBK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-β，感染A549時(shí)，IFN-β從感染后24 h開始被檢測(cè)到，96 h抵達(dá)峰值，同等條件下感染MDBK，IFN-β從感染后12 h開始被檢測(cè)到，72 h抵達(dá)峰值，72～96 h IFN-β逐漸降低，且相同血清型的BTV感染MDBK誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-β高于A549(圖1～3)。

圖1 不同MOI的BTV-1(A)和BTV-16(B)在A549和MDBK細(xì)胞中的增殖情況

圖2 MOI=0.10時(shí)BTV-1(A)和BTV-16(B)誘導(dǎo)A549產(chǎn)生IFN-β的量

圖3 MOI=0.10時(shí)BTV-1(A)和BTV-16(B)誘導(dǎo)MDBK產(chǎn)生IFN-β的量

2.3 BTV NS3真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定按照1.6中的方法克隆BTV NS3基因，然后與熒光質(zhì)粒PEGFP-N2分別酶切后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，在Kan+的LB平板上過夜，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為PEGFP-N2-NS3(圖4)。

A.BTV-1 NS3片段RT-PCR(M.DL2000 DNA Marker；1.BTV-1 NS3；2.PC)；B.PEGFP-N2-NS3菌落PCR (M.DL2000 DNA Marker;1.NC；2～4.PEGFP-N2-NS3菌落PCR 結(jié)果)圖4 NS3基因克隆及NS3真核表達(dá)質(zhì)粒鑒定

2.4 qPCR方法檢測(cè)過表達(dá)NS3后NS3和IFN-β mRNA的表達(dá)情況按照TransIntroTMEL轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒PEGFP-N2-NS3，分別在轉(zhuǎn)染后0,24,48,72 h這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞培養(yǎng)液，qPCR方法檢測(cè)上清液中NS3和IFN-β mRNA情況，結(jié)果表明：在A549和MDBK細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)染NS3，并且NS3 mRNA在0～72 h不斷增加，同時(shí)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生IFN-β mRNA有一定的誘導(dǎo)作用，但作用甚微，特別是A549中的IFN-β mRNA幾乎沒有增長(zhǎng)(圖5)。

A.A549過表達(dá)NS3后NS3 mRNA和IFN-β mRNA的量;B.MDBK過表達(dá)NS3后NS3 mRNA和IFN-β mRNA的量圖5 過表達(dá)NS3后細(xì)胞中的NS3 mRNA和IFN-β mRNA表達(dá)水平

2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)PEGFP-N2-NS3轉(zhuǎn)染細(xì)胞后IFN-β啟動(dòng)子表達(dá)按照1.8中的方法，分別用H-IFN-β-Luc和C-IFN-β-Luc與用不同劑量的PEGFP-N2-NS3共轉(zhuǎn)染A549及MDBK細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，用不同劑量的PEGFP-N2空質(zhì)粒和H-IFN-β-Luc和C-IFN-β-Luc共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后感染BTV-1，16 h后收取樣品進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè)，根據(jù)Dual-Luciferase Reporter Assay System操作說明測(cè)定熒光素酶活性。結(jié)果表明：BTV 非結(jié)構(gòu)蛋白NS3能夠抑制BTV誘導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子活性，且表達(dá)量越高，抑制作用越強(qiáng)，而PEGFP-N2本身對(duì)BTV誘導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子活性沒有抑制作用(圖6)。

A.A549 IFN-β啟動(dòng)子相對(duì)熒光素酶活性;B.MDBK IFN-β啟動(dòng)子相對(duì)熒光素酶活性圖6 細(xì)胞IFN-β啟動(dòng)子相對(duì)熒光素酶活性測(cè)定結(jié)果

3 討論

BTV目前全球發(fā)現(xiàn)的血清型共27個(gè)(BTV-1～27)，我國(guó)于1979年首次在云南發(fā)現(xiàn)綿羊藍(lán)舌病[13]，隨后在29個(gè)省檢出BTV血清陽性的家畜，全國(guó)范圍已鑒定出7個(gè)血清型的BTV(BTV-1、-2、-3、-4、-12、-15、-16)，其中BTV-1和BTV-16為我國(guó)的優(yōu)勢(shì)血清型[14-15]，因此本研究選用BTV-1和BTV-16感染犢牛原代腎細(xì)胞(MDBK)和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)，它們分別代表了BTV宿主上皮細(xì)胞和哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞。本研究通過qPCR方法檢測(cè)BTV感染細(xì)胞后0～96 h病毒RNA的變化，驗(yàn)證了BTV-1和BTV-16均能在MDBK和A549上增殖，且BTV RNA的量與病毒MOI呈正相關(guān)，接種72 h后BTV RNA抵達(dá)峰值；而CHAUVEAU等[16]研究中發(fā)現(xiàn)用不同MOI(MOI分別為0.01，0.05，0.10組)的BTV-8接種A549，48 h后病毒RNA就抵達(dá)峰值，可能是由于BTV血清型以及細(xì)胞來源的不同導(dǎo)致的。研究還發(fā)現(xiàn)相同血清型的BTV在MDBK中的增長(zhǎng)量要高于A549，說明MDBK比A549更適合BTV-1和BTV-16的增殖。

本研究選用MOI=0.10的BTV-1和BTV-16感染細(xì)胞，用ELISA方法檢測(cè)感染后0～96 h細(xì)胞產(chǎn)生IFN-β的量，驗(yàn)證了BTV-1和BTV-16均能誘導(dǎo)MDBK和A549產(chǎn)生IFN-Ⅰ；選擇病毒復(fù)數(shù)MOI=0.10是因?yàn)榈筒《玖空T導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-β量過低，而高病毒量則影響細(xì)胞狀態(tài)導(dǎo)致試驗(yàn)組間不平行。研究結(jié)果顯示當(dāng)BTV-1和BTV-16感染A549時(shí)，IFN-β從感染后24 h開始被檢測(cè)到，96 h抵達(dá)峰值；當(dāng)感染MDBK時(shí)，IFN-β從感染后12 h開始被檢測(cè)到，72 h抵達(dá)峰值，72～96 h IFN-β逐漸降低，而且相同血清型的BTV感染MDBK誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-β高于A549?？赡艿脑蚴荕DBK來源于BTV的宿主牛，當(dāng)感染相同血清型相同病毒量的BTV時(shí)，MDBK產(chǎn)生的IFN-Ⅰ效應(yīng)要強(qiáng)于其他來源的上皮細(xì)胞，且RIG-I 基因是Ⅰ型 IFN誘導(dǎo)型基因，有研究表明RIG-I基因的啟動(dòng)子在正常細(xì)胞中較在惡變細(xì)胞中更活躍，且RIG-I mRNA表達(dá)水平在正常細(xì)胞中較在癌細(xì)胞中更高[17]。A549細(xì)胞是人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，所以BTV誘導(dǎo)A549產(chǎn)生的IFN-Ⅰ效應(yīng)要晚于MDBK，IFN-β分泌量也要低于MDBK。

RIG-I樣受體識(shí)別病毒復(fù)制產(chǎn)生的雙鏈RNA和5′三磷酸基團(tuán)的單鏈RNA后，通過激活I(lǐng)FN-Ⅰ來引發(fā)抗病毒免疫反應(yīng)，在機(jī)體抵抗病毒感染的過程中發(fā)揮重要作用。有研究表明BTV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS3對(duì)IFN-β的生成有強(qiáng)烈抑制作用，它通過抑制RLR信號(hào)通路干擾機(jī)體免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致干擾素表達(dá)量下降。CHAUVEAU等[16]研究發(fā)現(xiàn)在BTV-8型感染293T細(xì)胞的試驗(yàn)中，BTV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3能夠抑制IFN-β啟動(dòng)子活性，這種抑制作用是通過NS3蛋白降低與RIG-I結(jié)合而下調(diào)IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平，在基因水平上影響IFN-β轉(zhuǎn)錄，從而達(dá)到干擾IFN-β合成的效果[16,18]。本研究成功構(gòu)建BTV NS3的真核表達(dá)質(zhì)粒PEGFP-N2-NS3，在轉(zhuǎn)染A549和MDBK細(xì)胞后的24 h，用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定IFN-β啟動(dòng)子的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在細(xì)胞中過表達(dá)NS3蛋白對(duì)IFN-β啟動(dòng)子有明顯下調(diào)作用，但qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示在A549中過表達(dá)NS3后，IFN-β mRNA從24 h開始被檢測(cè)到，24～48 h逐漸升高，48～72 h逐漸降低，在MDBK中也同樣，這與雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定結(jié)果相悖；這說明了BTV NS3蛋白對(duì)IFN-β的抑制作用必須在BTV刺激時(shí)才能協(xié)同發(fā)揮，過表達(dá)BTV NS3蛋白能夠抑制BTV誘導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子活性，而且表達(dá)量越高，抑制作用越強(qiáng)，而僅過表達(dá)NS3蛋白反而能刺激細(xì)胞合成IFN-β mRNA，說明NS3蛋白只對(duì)BTV誘導(dǎo)的IFN-β有抑制作用，而NS3蛋白本身作為外源蛋白能刺激細(xì)胞產(chǎn)生IFN-β。

CHAUVEAU等[16]研究表明BTV NS3 蛋白作用于維甲酸誘導(dǎo)基因-線粒體抗病毒信號(hào)傳送蛋白通路(RIG-I-MAVS pathway)，進(jìn)而抑制IFN-Ⅰ的合成[16]，達(dá)到拮抗IFN-Ⅰ的抗病毒功能[19]。但本研究發(fā)現(xiàn)僅過表達(dá)NS3蛋白反而能刺激細(xì)胞合成IFN-β mRNA；有研究發(fā)現(xiàn)BTV-8通過降解JAK1和Tyk2以及降低 STAT1磷酸化和核轉(zhuǎn)移水平來實(shí)現(xiàn)對(duì)IFN-Ⅰ抗病毒作用的抑制，但單一的BTV-8并不能獨(dú)立完成此過程[20]，說明BTV拮抗干擾素的抗病毒過程是復(fù)雜的，相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路還有待進(jìn)一步的研究。

綜上，BTV-1和BTV-16能感染A549和MDBK并誘發(fā)強(qiáng)烈的IFN-β效應(yīng)，BTV NS3能誘導(dǎo)細(xì)胞合成IFN-β mRNA，同時(shí)對(duì)BTV誘導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子活性具有抑制作用，且表達(dá)量與抑制作用呈正相關(guān)。本研究揭示了BTV增殖與細(xì)胞產(chǎn)生IFN-Ⅰ的關(guān)系，闡明了BTV NS3蛋白對(duì)IFN-β轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平的影響，其結(jié)果有助于了解BTV的致病機(jī)理及其干擾宿主的天然免疫應(yīng)答機(jī)制，對(duì)BTV疫苗研發(fā)及抗病毒治療具有科學(xué)意義。