卵孢長(zhǎng)根菇不同生長(zhǎng)期覆土層微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

詹穎馨 方亮 付圣麟 蘇廣林 陳晗 劉斌

摘要：【目的】探究卵孢長(zhǎng)根菇不同生長(zhǎng)期覆土層微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性及木霉病害對(duì)微生物群落的影響，為長(zhǎng)根菇的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎肐llumina高通量測(cè)序技術(shù)，研究長(zhǎng)根菇不同生長(zhǎng)階段（覆土?xí)r、現(xiàn)蕾期、采收期、發(fā)病期、轉(zhuǎn)潮期）覆土層微生物群落結(jié)構(gòu)組成及其多樣性，并利用冗余分析技術(shù)分析研究微生物菌群與土壤理化因子的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】從覆土樣品中共獲得操作分類單元（OTUs）4581個(gè)，細(xì)菌和真菌OTUs分別為3650個(gè)和931個(gè)。不同生長(zhǎng)階段土壤的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群存在較大差異，覆土?xí)r和采收期的最優(yōu)勢(shì)屬為廣義伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia），現(xiàn)蕾期、發(fā)病期、轉(zhuǎn)潮期的最優(yōu)勢(shì)屬的分別為羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia）、西地西菌屬（Cedecea）和噬幾丁質(zhì)菌屬（Chitinophaga）。覆工至采收的前3個(gè)生長(zhǎng)期的最優(yōu)勢(shì)真菌屬為鐮刀菌屬（Fusarium），其余生長(zhǎng)期則為木霉屬（Trichoderma）。木霉病害發(fā)病期土壤層微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，微生物數(shù)量和豐度均低于其他期;采收期土壤的細(xì)菌多樣性最高，轉(zhuǎn)潮期真菌多樣性最高。冗余分析結(jié)果表明，覆土層中速效氮和速效鉀與細(xì)菌在屬水平上有顯著正相關(guān)（P<0.05，下同）;有效磷與真菌屬水平菌群顯著正相關(guān)。土壤有機(jī)質(zhì)與覆土?xí)r土壤微生物群落呈正相關(guān);速效氮、有效磷、速效鉀和pH則與轉(zhuǎn)潮期土壤微生物群落呈正相關(guān)?！窘Y(jié)論】不同生長(zhǎng)階段覆土層土壤真菌物種數(shù)量在采收期達(dá)最大值，細(xì)菌物種數(shù)量則隨著長(zhǎng)根菇的生長(zhǎng)而不斷下降。木霉病害的發(fā)生對(duì)土壤微生物種類和豐度均有顯著抑制作用，同時(shí)大量消耗土壤的營(yíng)養(yǎng)元素，降低pH。

關(guān)鍵詞：卵孢長(zhǎng)根菇;土壤微生物多樣性;高通量測(cè)序技術(shù);土壤理化性質(zhì);群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)：S646;S154.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2022）04-1143-09

Diversity analysis of microbial community structure in casing soil in different growth stages of Hymenopellis raphanipes

ZHAN Ying-xin， FANG Liang， FU Sheng-lin， SU Guang-lin， CHEN Han， LIU Bin*

（College of Agriculture， Guangxi University/Institute of Edible Fungi， Guangxi University， Nanning，

Guangxi? 530004， China）

Abstract：【Objective】To investigate the composition and diversity of microbial community structure of the casing soil in different growth stages of Hymenopellis raphanipes， and the effect of Trichoderma diseases on microbial communities，so as to provide the theoretical basis for the high and stable yield of the H. raphanipes. 【Method】The microbial community structure and diversity in different growth stages（casing stage， pinning stage， harvesting stage， harvesting stage with green mold disease， flush interval stage） of H. raphanipes were analyzed by Illumina high-throughput sequencing technology， while the relationship between microbial community and soil physical-chemical property was studied by environmental factors analysis. 【Result】Results showed the total number of operational taxonomic unit（OTUs） in casing soil was 4581， including 3650 of bacteria and 931 of fungi. There were significant differences in the dominant bacterial community in different growing stages， the dominant bacterial genus in casing stage and harvesting stage was Burkholderia.? Ralstonia， Cedecea and Chitinophaga were the dominant genus in pinning stage， harvesting stage and flush interval stage， respectively. The most dominant fungal in the first three stages was genus Fusarium， and the remaining stages were genus Trichoderma. In disease stage， the structure of soil microbial community changed greatly， with the number of microorganisms and relative abundance lower than other stage. In harvesting stage， bacteria diversity reached the highest and in the flush interval stage， fungal diversity was the highest. dbRDA analysis showed that the content of available nitrogen（AN） and available phosphorus（AK） in casting soil was significant positive correlated with bacteria at genus level（P<0.05， the same below）. Available phosphorus（AP） had significant positive correlation with bacterial communities at genus level. Soil organic matter（SOM） was significantly positively correlated with soil microbial community in casing stage， while AN， AP， AK and pH were positively correlated with soil microbial community in flush interval stage. 【Conclusion】The number of soil fungal flora in different growth stages reaches the maximum at harvest time; The number of bacterial flora decreased with the growth of long root mushroom. The occurrence of Trichoderma disease can significantly inhibit the species and abundance of soil microbial flora， and consume a lot of soil nutrient elements and reduce pH.

Key words： Hymenopellis raphanipes; soil microbial diversity; high-throughput sequencing technology; soil physicochemical property; community structure

Foundation items： Guangxi Key Research and Development Plan Project （Guike AB18221047）

0 引言

【研究意義】卵孢長(zhǎng)根菇（Hymenopellis raphanipes）又名卵孢小奧德蘑、露水雞樅等，商品名為黑皮雞樅（Hao et al.，2016），其肉質(zhì)細(xì)膩、香味濃郁、營(yíng)養(yǎng)豐富，是近年深受消費(fèi)者喜愛的名貴珍稀食用菌。長(zhǎng)根菇雖然不覆土也能出菇，但產(chǎn)量較低，覆土是長(zhǎng)根菇栽培過程的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，土壤中微生物和組分能直接影響子實(shí)體產(chǎn)量和質(zhì)量。在覆土栽培中最突出的問題是雜菌侵染，尤以木霉（Trichoderma spp.）危害最嚴(yán)重，其在栽培袋和覆土層表面快速生長(zhǎng)，與長(zhǎng)根菇競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)和空間，造成長(zhǎng)根菇嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收，已成為制約長(zhǎng)根菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。因此，開展長(zhǎng)根菇生長(zhǎng)發(fā)育過程中覆土層土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性研究，對(duì)長(zhǎng)根菇的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)栽培具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】我國(guó)進(jìn)行卵孢長(zhǎng)根菇馴化栽培的時(shí)間較晚，20世紀(jì)期間已有學(xué)者對(duì)卵孢長(zhǎng)根菇進(jìn)行栽培研究，但因栽培技術(shù)不成熟等問題，未能實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)根菇的規(guī)?；a(chǎn)（李傳華等，2011）。孫思國(guó)（2010）在山東省濟(jì)寧市金鄉(xiāng)縣首次成功實(shí)現(xiàn)卵孢長(zhǎng)根菇的大規(guī)模人工覆土栽培。覆土是某些食用菌栽培的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，不僅能保溫保濕，還能提供營(yíng)養(yǎng)和有益微生物、促進(jìn)食用菌菌絲扭結(jié)，有利于子實(shí)體的原基早形成早出菇（Kalberer et al.，1990）。雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）具有不覆土不出菇的特性，必須覆土才能誘導(dǎo)形成子實(shí)體（沈新芬等，2019），是覆土層微生物研究較深入的食用菌。Chen等（2013）的試驗(yàn)結(jié)果表明，覆土層中產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶的細(xì)菌可降低雙孢蘑菇原基形成抑制劑乙烯的含量，從而促進(jìn)原基的形成。王琳等（2018）研究確定了惡臭假單胞菌TK3對(duì)雙孢蘑菇具有促生作用，能實(shí)現(xiàn)子實(shí)體的大幅度增產(chǎn)。近年來，其他食用菌與土壤微生物群落的關(guān)系也相繼開展。陳誠(chéng)等（2017）采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)羊肚菌白霉病發(fā)生前后土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果表明羊肚菌栽培后真菌多樣性降低，白霉病發(fā)生后根際真菌種類增多，優(yōu)勢(shì)真菌類群也產(chǎn)生了較大變化;張相鋒等（2019）、楊曉絨等（2020）的研究結(jié)果表明，羊肚菌根際土壤微生物多樣性與土壤深度成反比，上層微生物多樣性最高;趙玉卉等（2021）對(duì)羊肚菌根際細(xì)菌群落與土壤環(huán)境因子相關(guān)性進(jìn)行研究，揭示了羊肚菌根際微生態(tài)系統(tǒng)各要素間的相互關(guān)系。綜上所述，覆土土壤微生物多樣性和土壤理化性質(zhì)在覆土型食用菌菌絲和子實(shí)體的生長(zhǎng)階段起著重要作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今有關(guān)長(zhǎng)根菇覆土層微生物多樣性研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)的第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)長(zhǎng)根菇不同生長(zhǎng)階段覆土層土壤進(jìn)行高通量測(cè)序分析，通過測(cè)定細(xì)菌和真菌群落的結(jié)構(gòu)及其多樣性，分析其與土壤理化性質(zhì)間相關(guān)性，探究不同生長(zhǎng)期覆土層土壤細(xì)菌和真菌群落的差異，以期為長(zhǎng)根菇的工廠化覆土栽培提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 樣品采集

長(zhǎng)根菇覆土栽培試驗(yàn)于2021年5—6月在廣西梧州市萬(wàn)秀區(qū)夏郢鎮(zhèn)的上品薈食用菌種植基地（東經(jīng)111o30′99″，北緯23o56′30″）進(jìn)行。長(zhǎng)根菇菌種由山東遠(yuǎn)洋農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供，覆土材料為75%紅壤土和25%泥炭土混合組成。選取長(zhǎng)根菇不同生長(zhǎng)階段的覆土層，即覆土?xí)r（5月19日）、首潮菇現(xiàn)蕾期（6月3日）、首潮菇采收期（6月13日）、采收期發(fā)生木霉病害（6月13日，簡(jiǎn)稱發(fā)病期）及首潮采收后的轉(zhuǎn)潮期（6月23日）。采集時(shí)去除表面2～3 cm的土層，使用內(nèi)徑為5 cm的土鉆和100 cm3環(huán)刀，采集菇架上的土壤，每個(gè)生長(zhǎng)期采集3份樣品，每份樣品采集3個(gè)點(diǎn)的土壤進(jìn)行混合。裝入無(wú)菌自封袋中密封，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，除去土壤中的石塊和可見動(dòng)植物殘?bào)w等。土樣分2份保存，其中一份樣品于-80 ℃冰箱保存，用于土壤微生物群落多樣性測(cè)定;另一份樣品于陰涼處風(fēng)干后過80目篩，用于土壤理化性質(zhì)的測(cè)定。

1. 2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

有機(jī)質(zhì)（Soil organic matter ，SOM）含量用重鉻酸鉀容量法測(cè)定，pH值用電位法測(cè)定（Ciavatta et al.，1991）。速效氮（Available nitrogen ，AN）含量用堿解擴(kuò)散法測(cè)定（Xiong et al.，2008）;有效磷（Available phosphorus，AP）含量用鉬銻抗比色紫外分光光度法測(cè)定;速效鉀（Available potassium ，AK）含量經(jīng)乙酸銨提取后用火焰光度法測(cè)定（鮑士旦，2003）。

1. 3 高通量測(cè)序分析

采用CTAB法對(duì)土壤樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，使用無(wú)菌水稀釋樣本DNA至1 ng/μL。以DNA基因組作為模板，對(duì)細(xì)菌16S rDNA序列V3～V4可變區(qū)和真菌ITS1區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物分別為314F（5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'）和806R（5'-GGACTA CNNGGGTATCTAAT-3'），ITS5-1737F（5'-GGAAGT AAAAGTCGTAACAAGG-3'）和ITS2-2043R（5'-GCT GCGTTCTTCATCGATGC-3'）。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)后，采用qiagen公司的膠回收試劑盒回收目的條帶。文庫(kù)構(gòu)建按TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit試劑盒的說明進(jìn)行，構(gòu)建好的文庫(kù)合格使用NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，高通量測(cè)序委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1. 4 測(cè)序數(shù)據(jù)處理與分析

測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)采用FLASH v1.2.7， （http：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/）進(jìn)行拼接，拼接獲得的原始Tags數(shù)據(jù)經(jīng)Qiime v1.9.1（http：//qiime.org/scripts/split libraries fastq.html）質(zhì)控得到高質(zhì)量的Clean Tags數(shù)據(jù)，再與物種數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)（Effective tags）（Wang et al.，2007;Quast et al.，2013）。利用Uparse算法（Uparse v7.0.1001）對(duì)Effective Tags進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為OTUs（Operational taxonomic units）。使用Qiime v1.9.1進(jìn)行微生物群落Alpha多樣性和Beta多樣性的比較分析（Li and Xu，2007）。用Spearman相關(guān)分析（Algina and Keselman，1999）和環(huán)境因子分析（Distance-based redundancy analysis，db-RDA）（李曉謙等，2015）研究微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)間的關(guān)系。以上分析均在北京諾禾致源科技股份有限公司售后平臺(tái)NovoMagic（https：//magic.novogene.com/customer/main#/login）完成。

1. 5 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excle 2016進(jìn)行柱狀圖制作，使用SPSS 23.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同生長(zhǎng)期覆土層土壤理化性質(zhì)

由表1可知，不同生長(zhǎng)期覆土層土壤AN、AP和AK含量及pH存在明顯差異，SOM含量差異不顯著（P>0.05）。土壤AN和AP含量和pH表現(xiàn)為采收期最高，土壤AK含量表現(xiàn)為轉(zhuǎn)潮期含量最高。所有土壤樣品的pH均為酸性，現(xiàn)蕾期覆土層土壤pH最低，且與其他時(shí)期差異顯著（P<0.05，下同）。采收期覆土層的AN、AP和AK含量顯著高于同期發(fā)生病害的覆土層。

2. 2 不同生長(zhǎng)期覆土層土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性

由圖1-A可知，長(zhǎng)根菇覆土?xí)r土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)屬為伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia），相對(duì)豐度為4.78%，次優(yōu)勢(shì)屬為羅爾斯通氏菌屬（Ralstonia）;現(xiàn)蕾期羅爾斯通氏菌屬為最優(yōu)勢(shì)屬，其次是伯克霍爾德氏菌屬，豐度分別為4.78%和4.15%;采收期土壤中伯克霍爾德氏菌屬是最優(yōu)勢(shì)屬，相對(duì)豐度為9.23%，但發(fā)病期的土樣則西地西菌屬（Cedecea）為最優(yōu)勢(shì)屬，相對(duì)豐度為13.98%，鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）是第二優(yōu)勢(shì)屬，相對(duì)豐度為12.83%;轉(zhuǎn)潮期土壤中噬幾丁質(zhì)菌屬（Chitinophaga）是最優(yōu)勢(shì)屬，相對(duì)豐度為16.98%。不同生長(zhǎng)期土壤的細(xì)菌組成屬與門分類水平的結(jié)果不同，優(yōu)勢(shì)菌屬在不同的樣品中存在明顯差異，最優(yōu)勢(shì)屬在不同生長(zhǎng)期均不一致。如圖1-B所示，不同生長(zhǎng)期土壤樣品中真菌屬水平組成上存在明顯差異。對(duì)真菌而言，覆土?xí)r和現(xiàn)蕾期以鐮刀菌屬（Fusarium）為最優(yōu)勢(shì)屬，其相對(duì)豐度分別為92.19%和89.06%，采收期仍以鐮刀菌屬為最優(yōu)勢(shì)屬，但相對(duì)豐度則下降至42.89%;發(fā)病期和轉(zhuǎn)潮期的最優(yōu)勢(shì)屬是木霉屬（Trichoderma），相對(duì)豐度分別為72.47%和46.73%。在長(zhǎng)根菇的生長(zhǎng)發(fā)育中，覆土層鐮刀菌屬的相對(duì)豐度從92.19%逐漸下降至4.35%，而節(jié)叢孢屬（Arthrobotrys）和長(zhǎng)根菇屬（Hymenopellis）的相對(duì)豐度則隨著生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)而不斷增加。

2. 3 不同生長(zhǎng)期覆土層土壤微生物群落多樣性

長(zhǎng)根菇不同生長(zhǎng)期覆土樣品中細(xì)菌的OTUs數(shù)量及多樣性指數(shù)如表2所示，在97%相似水平上劃分的OTUs數(shù)量，覆土?xí)r最高，為1323個(gè)，轉(zhuǎn)潮期最低，為1012個(gè)。本研究中5個(gè)樣品覆蓋率為99.63%～99.74%，Chao1指數(shù)為1162.54～1421.06，ACE指數(shù)為1102.14～1434.96，Shannon指數(shù)為5.09～7.37，Simpson指數(shù)為0.91～0.97。覆土?xí)r的Chao1和ACE指數(shù)最高，覆蓋率最低。采收期的Shannon和Simpson多樣性指數(shù)最高，發(fā)病期Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)最低。采收期的覆土層細(xì)菌4個(gè)物種多樣性指數(shù)均高于發(fā)病期，且Shannon指數(shù)差異顯著。

真菌多樣性分析見表3，OTUs數(shù)量介于114.33～194.67，采收期數(shù)量最多，但發(fā)生病害的采收期OTUs數(shù)量最少。各樣品的Shannon指數(shù)為0.86～2.99，Simpson指數(shù)為0.16～0.71。轉(zhuǎn)潮期的Shannon和Simpson多樣性指數(shù)最高;覆土?xí)rShannon和Simpson指數(shù)最低，Chao1指數(shù)為124.20～204.92，ACE指數(shù)為129.20～209.75;采收期的Chao1和ACE指數(shù)最高，發(fā)生病害時(shí)則最低。發(fā)病期覆土層的微生物多樣性較低，其他指數(shù)均低于采收期，說明木霉病害的發(fā)生嚴(yán)重改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，同時(shí)降低了物種數(shù)量及豐度。

2. 4 不同生長(zhǎng)期覆土層土壤微生物群落β多樣性

以加權(quán)Unifrac距離矩陣對(duì)相對(duì)豐度排序前10的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門進(jìn)行UPGMA聚類分析，結(jié)果如圖2-A所示，在加權(quán)Unifrac距離為0.08的水平上，5組樣本聚成兩大類。第一類由覆土?xí)r、現(xiàn)蕾期和采收期組成，包括變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidota）和酸桿菌門（Acidobacteria）;第二類由發(fā)病期和轉(zhuǎn)潮期組成，主要以變形菌門（Proteobacteria）擬桿菌門（Bacteroidota）等細(xì)菌為主。圖2-B顯示不同樣品的真菌聚類結(jié)果，在加權(quán)Unifrac距離為0.09的水平上，5組樣本被聚為三大類，其中，覆土?xí)r和現(xiàn)蕾期聚為一類，采收期和轉(zhuǎn)潮期聚為一類，發(fā)病期單獨(dú)分為一類，說明木霉病害的發(fā)生使得細(xì)菌和真菌群落發(fā)生了較大改變。除去其他（others）外，5組樣本均以子囊菌門（Ascomycota）為最優(yōu)勢(shì)門，擔(dān)子菌門（Basidiomycota）次之，子囊菌門和擔(dān)子菌門的相對(duì)豐度之和大于96.50%。

2. 5 土壤理化性質(zhì)與微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性

利用dbRDA分析探究土壤理化性質(zhì)對(duì)不同覆土樣品微生物群落組成的影響，如圖3所示，細(xì)菌第一和第二排序軸共解釋了66.05%的群落變化，其中對(duì)土壤細(xì)菌群落影響較大的有土壤AP、AK和AN，土壤pH對(duì)土壤細(xì)菌群落影響較小;對(duì)于土壤真菌群落，第一和第二排序軸共解釋了91.95%的群落變化，根據(jù)對(duì)真菌群落影響的排序?yàn)橥寥纏H、AK、AP和SOM，AN對(duì)土壤真菌群落的影響較小。SOM與覆土?xí)r、現(xiàn)蕾期和采收期土壤的真菌群落呈正相關(guān)。pH、AP和AK與采收期和轉(zhuǎn)潮期土壤的細(xì)菌和真菌群落均呈正相關(guān)性，AN與該階段土壤微生物群落相關(guān)性不明顯，而SOM則與該階段土壤微生物有顯著負(fù)相關(guān)。SOM與生長(zhǎng)前期土壤微生物群落呈正相關(guān)，AN、AP、AK和pH則與轉(zhuǎn)潮期土壤呈正相關(guān)，是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。

對(duì)覆土層土壤微生物細(xì)菌屬與環(huán)境因子進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果如圖4所示。AN與慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、蒲氏桿菌屬（Puia）和TM7a呈極顯著正相關(guān)（P<0.01，下同），與中華單胞菌屬（Sinomonas）呈顯著正相關(guān);SOM與克雷伯氏菌屬（Klebsiella）呈顯著負(fù)相關(guān);pH與細(xì)菌4個(gè)屬呈顯著或極顯著的負(fù)相關(guān)，而AP對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)未產(chǎn)生顯著影響。而就真菌而言，AP與土壤真菌群落中的4個(gè)屬即枝頂孢屬（Acremonium）、頭束霉屬（Cephalotrichum）、長(zhǎng)根菇屬（Hymenopellis）和帚枝霉屬（Sarocladium）呈極顯著正相關(guān)，與節(jié)叢孢屬（Athrobotrys）、角擔(dān)菌屬（Ceratobasidium）和Heterogastridium屬呈顯著正相關(guān);SOM與土壤真菌群落中的鏈格孢屬（Alternaria）呈顯著正相關(guān)，與土壤細(xì)菌群落中的克雷伯氏菌屬（klebsiella）呈顯著負(fù)相關(guān); pH則與4個(gè)屬的真菌OUTs呈顯著負(fù)相關(guān);AN和AK對(duì)真菌群落沒有表現(xiàn)出相關(guān)性。

2. 6 不同覆土階段長(zhǎng)根菇高豐度細(xì)菌潛在功能分析

使用Tax4Fun對(duì)樣品進(jìn)行功能注釋并結(jié)合豐度信息，從功能差異層面進(jìn)行聚類，結(jié)果如圖5所示，人類疾?。℉uman diseases）和環(huán)境信息處理（Environmental information processing）相關(guān)的細(xì)菌菌群與發(fā)病期土壤樣品呈正相關(guān)，而與其他樣品的相關(guān)性不大。另外，還有一類與人類疾病功能接近的菌群被劃分為unclassified，說明木霉的大量繁殖使土壤中與人類疾病和環(huán)境信息相關(guān)的細(xì)菌大量擴(kuò)繁，土壤潛在致病風(fēng)險(xiǎn)增加。

3 討論

高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展為高效分析微生物群落結(jié)構(gòu)組成提供了一個(gè)強(qiáng)大的平臺(tái)（Benucci et al.，2019），因此高通量的測(cè)序方法是研究土壤微生物群落以及功能的一個(gè)非常有效手段（Claesson et al.，2009;張彩霞，2012;Li et al.，2016）。Gong等（2018）、Ke等（2019）均選擇利用高通量的測(cè)序方法進(jìn)行食用菌栽培期間微生物多樣性的相關(guān)研究。本研究獲得了3650個(gè)細(xì)菌OTUs和931個(gè)真菌OTUs，同時(shí)存在一定比例的微生物為unidentified，未定義到具體的分類單元，表明長(zhǎng)根菇覆土土壤中存在大量未知的微生物，同時(shí)證明了土壤微生物群落功能的復(fù)雜性。

在長(zhǎng)根菇的生長(zhǎng)發(fā)育過程中，覆土層土壤中細(xì)菌和真菌在組成和優(yōu)勢(shì)菌屬上存在明顯差異，對(duì)土壤微生態(tài)起到一定的調(diào)節(jié)作用。伯克霍爾德氏菌屬是長(zhǎng)根菇覆土?xí)r和采收期土壤的最優(yōu)勢(shì)屬，伯克霍爾德氏菌屬的相對(duì)豐度在長(zhǎng)根菇生長(zhǎng)期中呈先下降、后上升、再迅速下降的趨勢(shì)，其數(shù)量在正常采收期時(shí)最高而在轉(zhuǎn)潮期最低?？赡苁且?yàn)椴嘶魻柕率暇鷮偈且环N強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)力的根圍定殖細(xì)菌（梁曉潔，2020），隨著長(zhǎng)根菇子實(shí)體的大量生長(zhǎng)，其在子實(shí)體菌根周圍大量繁殖。由于長(zhǎng)根菇的不斷采收，數(shù)量不斷減少，再加上采收時(shí)菌根不斷帶走周圍土壤，導(dǎo)致伯克霍爾德氏菌屬的數(shù)量不斷下降，在轉(zhuǎn)潮期數(shù)量達(dá)最低值。羅爾斯通氏菌屬是現(xiàn)蕾期土壤中最優(yōu)勢(shì)屬，其相對(duì)豐度在長(zhǎng)根菇生長(zhǎng)期中呈先上升、后逐漸下降的趨勢(shì)，與土壤中有機(jī)質(zhì)含量的變化趨勢(shì)相一致，應(yīng)該與羅爾斯通氏菌屬具有較強(qiáng)的化能自養(yǎng)能力，能直接利用有機(jī)碳源異養(yǎng)生長(zhǎng)有關(guān)（馬哲等，2021）。噬幾丁質(zhì)菌屬在各生長(zhǎng)階段的土壤中均有分布，并于轉(zhuǎn)潮期豐富度達(dá)最大。鐮刀菌屬是前3個(gè)階段土壤的真菌最優(yōu)勢(shì)屬，并在覆土?xí)r和現(xiàn)蕾期具有92.19%和89.06%的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而后大幅度下降，究其原因可能是長(zhǎng)根菇子實(shí)體在生長(zhǎng)過程中釋放的某些物質(zhì)對(duì)其有明顯的抑制作用，也為鐮刀菌屬病原菌的防治提供一定的研究思路。節(jié)叢孢屬豐富度從現(xiàn)蕾期起逐漸增加，該屬真菌具有捕捉和殺死線蟲的能力，在食用菌栽培中被用于控制線蟲數(shù)量（Goltapeh et al.，2008）。

木霉是土壤中一類普遍存在的真菌，生長(zhǎng)速度快且產(chǎn)孢能力強(qiáng)，具有強(qiáng)腐生競(jìng)爭(zhēng)力;其主要來源于覆土土壤，加之木霉與食用菌的生長(zhǎng)條件高度重合，在不通風(fēng)的環(huán)境下極易發(fā)生木霉的大量繁殖（Hassan et al.，2019）。發(fā)病期土壤中SOM、AN、AP和AK的含量均低于采收期，其中AP含量下降最多，僅為正常采收期的10.61%。除木霉寄生于食用菌菌絲上，包裹菌包生長(zhǎng)，并產(chǎn)生有毒物質(zhì)，抑制和消解菌絲體外（吳小平，2008），木霉繁殖大量消耗土壤中營(yíng)養(yǎng)元素同樣阻礙了長(zhǎng)根菇菌絲的生長(zhǎng)，嚴(yán)重影響長(zhǎng)根菇的產(chǎn)量。木霉病害的暴發(fā)使得木霉屬在發(fā)病采收期相對(duì)豐度高達(dá)72.74%，整體上減少了土壤微生物多樣性和豐度，其中細(xì)菌多樣性指數(shù)略微下降而真菌各多樣性指數(shù)均有大幅度的下降。該結(jié)果與木霉作為生防菌株治理植物病害時(shí)，對(duì)土壤中微生物群落多樣性所造成的影響相一致（馬建華，2010;王寧等，2018）。從土壤細(xì)菌的潛在功能分析結(jié)果可知，木霉病害發(fā)生后，土壤中與人類疾病和環(huán)境信息相關(guān)的細(xì)菌菌群有了顯著的增長(zhǎng)，說明木霉的大量繁殖破壞了土壤中微生物的平衡，改變了細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，使得土壤中致病菌數(shù)量增多、潛在致病風(fēng)險(xiǎn)上升，另外土壤中還會(huì)有蟲害暴發(fā)或者蟲卵富集的情況，給覆土層土壤的再利用增加了難度。

本研究還對(duì)長(zhǎng)根菇覆土生長(zhǎng)階段土壤理化因子的變化進(jìn)行了研究，通過dbRDA分析可知，土壤理化因子是長(zhǎng)根菇覆土土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性的主要因素，顯著影響土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)，這與李敏和閆偉（2019）的研究結(jié)果有相同之處。AN、AK含量和pH在不同生長(zhǎng)期有著顯著的差異，說明這3個(gè)理化因子對(duì)長(zhǎng)根菇的生長(zhǎng)有較大的影響，而SOM和AP對(duì)長(zhǎng)根菇的覆土生長(zhǎng)影響不明顯;在工廠化栽培長(zhǎng)根菇后期可通過對(duì)AN和AK含量的添加來調(diào)節(jié)長(zhǎng)根菇的生長(zhǎng)。長(zhǎng)根菇喜生于偏酸性土壤中（羅影等，2021），且pH對(duì)發(fā)病期土壤細(xì)菌和真菌均為顯著正相關(guān)，木霉大量發(fā)生會(huì)降低土壤pH;木霉病害暴發(fā)初期可通過在發(fā)生部位施撒生石灰等方式調(diào)節(jié)pH，以控制木霉（秦文韜等，2020）。

長(zhǎng)根菇不同生長(zhǎng)階段覆土層土壤細(xì)菌和真菌的微生物群落均發(fā)生較顯著變化，長(zhǎng)根菇生長(zhǎng)過程能引起土壤生物和非生物組分特征的一系列變化，特別是木霉病害的發(fā)生使得細(xì)菌和真菌的物種數(shù)量和豐富度均有大幅度的降低，但其變化的具體機(jī)制尚不清楚，需展開進(jìn)一步的試驗(yàn)進(jìn)行探究。

4 結(jié)論

卵孢長(zhǎng)根菇的生長(zhǎng)能改變覆土層土壤微生物群落多樣性，不同生長(zhǎng)階段覆土層土壤真菌物種數(shù)量在采收期達(dá)最大值，細(xì)菌物種數(shù)量則隨著長(zhǎng)根菇的生長(zhǎng)而不斷下降。木霉病害的發(fā)生對(duì)土壤微生物種類和豐度均有顯著抑制作用，同時(shí)大量消耗土壤的營(yíng)養(yǎng)元素，降低pH。

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收稿日期：2022-01-16

基金項(xiàng)目：廣西重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（桂科AB18221047）

通訊作者：劉斌（1966-），http：//orcid.org/0000-0001-9345-4674，教授，主要從事真菌學(xué)研究工作，E-mail：liubin@gxu.edu

第一作者：詹穎馨（1997-），https：//orcid.org/0000-0002-0764-1607，研究方向?yàn)槭秤镁耘?，E-mail：1270025343@qq.com