篩選出芽短梗霉生產(chǎn)低聚果糖探究溶氧的影響

李成林，曹偉鋒，秦林莉，劉郅騫，張靜，劉思伽，竹源，梁欣泉*

(1.廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，南寧 530004；2.中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所，北京 100089)

短梗霉(Aureobasidiumspp.)是一種分布范圍非常廣泛的真菌。短梗霉的形態(tài)比較容易受到環(huán)境的影響，并且其生活史復(fù)雜的多形態(tài)腐生真菌分布在人們的生活中，通常分布在土壤、植物、花草、木材、混凝土等中。出芽短梗霉又稱黑酵母，因?yàn)槌鲅慷坦Ｃ股L(zhǎng)發(fā)育過程中，其細(xì)胞形態(tài)和部分生理特征非常相似，分離鑒定出芽短梗霉時(shí)通常會(huì)采用與酵母菌一樣的研究方法。出芽短梗霉菌的菌落最初黏稠，呈現(xiàn)臟白色，然后轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，發(fā)育到最后菌落呈現(xiàn)黑色[1]。

低聚果糖又稱寡果糖或蔗果低聚糖，是低聚糖中非常重要的一類。它廣泛存在于自然界，是在蔗糖的果糖殘基的C1位上通過β-(2-1)糖苷鍵與1～3個(gè)分子的果糖結(jié)合而成的低糖，主要是由蔗果三糖(1-kestose，簡(jiǎn)稱GF2)、蔗果四糖(nystose，簡(jiǎn)稱GF3)和蔗果五糖(1-F-β-fructofranosyl nystose，簡(jiǎn)稱GP4)組成的混合物[2-3]。除了不含卡路里，低聚果糖還具有卓越的功能特性，例如調(diào)節(jié)腸道微生物菌群，改善胃腸道免疫功能，能夠促進(jìn)脂質(zhì)的代謝和預(yù)防結(jié)腸癌的發(fā)生[4-5]。低聚果糖天然存在于水果、蔬菜和谷物中，自然界中大約有36000多種植物含有低聚果糖，如大麥、小麥、洋蔥、香蕉和麥芽等[6]。

低聚果糖已經(jīng)在兩階段或者一步過程中以生物發(fā)酵法生產(chǎn)[7]。在兩階段過程中，具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的酶首先從真菌中產(chǎn)生，例如出芽短梗霉菌[8]、曲霉屬[9]和青霉菌屬。然后使用蔗糖作為底物，在不同的控制條件下使用酶生產(chǎn)低聚果糖[10-11]。在一步法中，低聚果糖是在生物反應(yīng)器中使用全細(xì)胞作為生物催化劑從真菌中生物合成的[12]，無論是固定的還是游離的[13]，一步法發(fā)酵生產(chǎn)低聚果糖是一種很好的方法，因其省去了從細(xì)胞提取物中純化生產(chǎn)低聚果糖酶的步驟[14]。本文將通過發(fā)酵過程中的通氣速率、氧分壓和攪拌轉(zhuǎn)速[15]，探索溶氧對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

試劑：甘露醇、硝酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、檸檬酸、司班80、硝酸鈉、氯化鉀、七水合硫酸亞鐵、蔗糖、瓊脂、酵母粉；菌種：從土壤與枯葉中篩選的出芽短梗霉、出芽短梗霉IPE-1 No.3337、出芽短梗霉IPE-3 KY618121、出芽短梗霉IPE-5 KY621468，保存于中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀 日本島津公司；蒸汽式滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；全溫?fù)u瓶柜 蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超凈工作臺(tái) 北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；發(fā)酵罐、高速冷凍離心機(jī) 艾本德生命科學(xué)公司。

1.3 培養(yǎng)基的配制

1.3.1 富集培養(yǎng)基

甘露醇10%，NH4NO30.1%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O 0.02%，檸檬酸 0.2%，司班80 0.02%。

1.3.2 篩選培養(yǎng)基

NaNO30.3%，MgSO4·7H2O 0.05%，KCl 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，蔗糖 3%，K2HPO40.1%，瓊脂1.2%。

1.3.3 保藏培養(yǎng)基

NaNO30.3%，MgSO4·7H2O 0.05%，KCl 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，蔗糖 3%，K2HPO40.1%，瓊脂1.2%。

1.3.4 搖瓶種子培養(yǎng)基

蔗糖20%，NaNO30.5%，KH2PO40.4%，KCl 0.05%，K2SO40.035%，MgSO4·7H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，酵母粉1%，消泡劑<0.001%。

1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)基

蔗糖 20%，NaNO30.5%，KH2PO40.4%，KCl 0.05%，K2SO40.035%，MgSO4·7H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，酵母粉1%，消泡劑<0.001%，pH為5.5。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 出芽短梗霉的富集

將土壤和枯葉樣本分別置于富集培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，將幾個(gè)錐形瓶置于全溫?fù)u瓶柜中進(jìn)行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：30 ℃，100 r/min，培養(yǎng)2～4 d。

1.4.2 出芽短梗霉的初篩

將富集培養(yǎng)基置于超凈工作臺(tái)上，使用移液槍吸取100 μL富集培養(yǎng)液置入篩選培養(yǎng)基上，使用涂布棒涂抹，涂抹后再用涂布棒涂抹下一個(gè)空白篩選培養(yǎng)基，這樣梯度稀釋3次于篩選培養(yǎng)基上，然后將篩選培養(yǎng)基置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d，選取培養(yǎng)基上類似出芽短梗的單菌落進(jìn)行分離純化。

1.4.3 出芽短梗霉菌的復(fù)篩

將分離純化后的種子置于冰箱中保存，使用時(shí)將種子培養(yǎng)基置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)0.5 d，然后置于超凈工作臺(tái)上進(jìn)行操作，從斜面種子培養(yǎng)基挑取1環(huán)菌體接種于100 mL種子培養(yǎng)基中，搖床設(shè)置條件為25 ℃、120 r/min下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)2 d。

1.4.4 出芽短梗霉菌的搖瓶種子培養(yǎng)

從4 ℃冰箱中取出斜面種子培養(yǎng)基，將斜面種子培養(yǎng)基置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5 d進(jìn)行活化，用接種環(huán)均勻挑選大小接近的種子接種于100 mL種子培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH至5.5，并于121 ℃滅菌20 min，于超凈工作臺(tái)冷卻后操作，每次配制6個(gè)種子培養(yǎng)基平行，置于25 ℃、120 r/min全溫?fù)u瓶柜中培養(yǎng)2 d。

1.4.5 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵

對(duì)復(fù)篩低聚果糖含量前三的菌種進(jìn)行進(jìn)一步的發(fā)酵培養(yǎng)，配制培養(yǎng)基溶液于發(fā)酵罐內(nèi)并于121 ℃高溫滅菌鍋內(nèi)滅菌20 min，由于糖類和酵母粉高溫下會(huì)產(chǎn)生反應(yīng)，將其分開滅菌。將300 mL搖瓶種子液接種于滅菌后的培養(yǎng)基培養(yǎng)液中，發(fā)酵過程中維持pH為5.5，發(fā)酵溫度為25 ℃，轉(zhuǎn)速為400 r/min，初始通氣量為3 L/min，通過發(fā)酵罐所連接的發(fā)酵控制系統(tǒng)對(duì)發(fā)酵過程及發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行監(jiān)控。接入發(fā)酵罐后立即取發(fā)酵初始(0 h)的發(fā)酵樣品，每12 h取1次發(fā)酵樣品，將樣品置于超低溫冰箱中保存，發(fā)酵過程為期3 d，發(fā)酵罐接種時(shí)挑選6個(gè)平行搖瓶中3瓶種子培養(yǎng)基，將3瓶培養(yǎng)基接入發(fā)酵罐，保證每次接種量都為300 mL，接種量為10%，發(fā)酵結(jié)束后對(duì)超低溫冰柜中的樣品進(jìn)行處理，測(cè)定菌體干重和發(fā)酵液中的蔗糖、果糖、葡萄糖、低聚果糖的含量。

1.5 分析方法

1.5.1 液相色譜測(cè)定分析糖

色譜柱為Shodex Asahipak NH2P-50 4E聚合物氨基色譜柱，流動(dòng)相為70%乙腈和30%超純水，柱溫30 ℃，流速1 mL/min,進(jìn)樣量為20 μL。在上述條件下測(cè)量蔗糖、果糖、葡萄糖和低聚果糖色譜柱，由蔗糖、果糖、葡萄糖和低聚果糖標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算得出。

1.5.2 干重法測(cè)定菌體濃度

發(fā)酵液的菌體濃度采用干重法測(cè)定，在發(fā)酵開始前，提前準(zhǔn)備好離心管并編號(hào),放置于90 ℃烘箱中烘制12 h至恒重，取出烘干后的離心管，置入干燥器內(nèi)放置1 h至冷卻，冷卻后用電子天平稱量離心管的重量。發(fā)酵過程中每隔12 h取1次發(fā)酵樣品，使用移液槍取3 mL發(fā)酵樣品于烘干后的離心管內(nèi)，在5000 g下離心10 min，倒掉上清液，沉淀物用3 mL的生理鹽水洗滌2次，每次洗滌都在5000 g下離心10 min，倒掉洗滌離心后的上清液，將洗滌完成后的離心管置于90 ℃烘箱中烘至恒重，然后用電子天平稱量。處理時(shí)，每個(gè)發(fā)酵樣品的菌體濃度都采取干重法平行測(cè)定，取平均值。

1.5.3 酶活的測(cè)定

1.5.3.1 酶活的測(cè)定條件

pH 5.5、反應(yīng)溫度55 ℃、反應(yīng)時(shí)間1 h、反應(yīng)混合物包含以下組分：800 g/L蔗糖 7.5 mL，0.1 mol/L檸檬酸緩沖液(pH 5.5)2.3 mL，酶樣品0.2 mL。

1.5.3.2 酶活的定義

在1.5.3.1條件下，每1 min產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需的酶活性的量定義為1 U。

1.5.3.3 酶活的處理

分別測(cè)定發(fā)酵液的細(xì)胞外酶活和細(xì)胞內(nèi)酶活，發(fā)酵過程中每隔12 h取1次發(fā)酵樣品，使用移液槍取3 mL發(fā)酵樣品于離心管內(nèi)，在5000 g下離心10 min，上清液用作細(xì)胞外酶活的測(cè)定。沉淀物用3 mL生理鹽水洗滌2次，每次洗滌都在5000 g下離心10 min，倒掉洗滌離心后的上清液，最后用生理鹽水重懸至3 mL用作細(xì)胞內(nèi)酶活的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶發(fā)酵結(jié)果

出芽短梗霉菌菌落共9株，經(jīng)檢測(cè)產(chǎn)低聚果糖的菌落為7株，復(fù)篩結(jié)果見表1。

表1 菌株篩選結(jié)果Table 1 The selection results of strains

由表1可知，在12 h的搖瓶發(fā)酵周期內(nèi)，菌體濃度最高的為IPE-34，但I(xiàn)PE-34的低聚果糖濃度反而最低，為55.05 g/L。菌體濃度最低的為IPE-3，而IPE-3的低聚果糖產(chǎn)量最高，為137.63 g/L。復(fù)篩結(jié)果中，低聚果糖含量前三的菌株為IPE-3、IPE-1和IPE-5，對(duì)復(fù)篩含量前三的菌株進(jìn)行5 L發(fā)酵罐發(fā)酵，進(jìn)一步了解菌株的發(fā)酵性能。

2.2 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果

對(duì)復(fù)篩結(jié)果中低聚果糖產(chǎn)量最高的3株菌種進(jìn)行發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步對(duì)發(fā)酵性能進(jìn)行比較，所得發(fā)酵性能曲線見圖1。

圖1 IPE-1(a)、IPE-3(b)、IPE-5(c)發(fā)酵性能及細(xì)胞干重Fig.1 Fermentation performance and cell dry weight of IPE-1 (a), IPE-3 (b), IPE-5 (c)

由圖1中a可知，在3 d的發(fā)酵周期內(nèi)，菌體濃度在24～60 h內(nèi)是一個(gè)比較明顯的平穩(wěn)期，IPE-1的細(xì)胞內(nèi)酶活和細(xì)胞外酶活相差不大，比較接近。當(dāng)3 d發(fā)酵周期結(jié)束時(shí)，IPE-1的菌體濃度為15.98 g/L，細(xì)胞外酶活為1771 U，細(xì)胞內(nèi)酶活為1124 U，總酶活為2895 U。

由圖1中b可知，在3 d的發(fā)酵周期內(nèi)，IPE-3的菌體濃度在36 h后基本沒有明顯上漲，保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)酶活在24 h明顯超過細(xì)胞外酶活，并在36～60 h時(shí)維持在較高狀態(tài)，細(xì)胞外酶活一直維持在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。當(dāng)3 d發(fā)酵周期結(jié)束時(shí)，IPE-3的菌體濃度為11.91 g/L，細(xì)胞外酶活為1473 U，細(xì)胞內(nèi)酶活為1833 U，總酶活為3306 U。

由圖1中c可知，在3 d的發(fā)酵期內(nèi)，IPE-5的菌體濃度在24 h前快速上漲，在36 h之后緩速上漲，36 h前細(xì)胞內(nèi)酶活比較低，36 h后細(xì)胞內(nèi)酶活超過細(xì)胞外酶活，但總體來說，細(xì)胞內(nèi)酶活和細(xì)胞外酶活相差不大。當(dāng)3 d發(fā)酵周期結(jié)束時(shí)，IPE-5的菌體濃度為17.51 g/L，細(xì)胞外酶活為758 U，細(xì)胞內(nèi)酶活為1253 U，總酶活為2011 U。

進(jìn)一步分析發(fā)酵數(shù)據(jù)，對(duì)比3株菌株，對(duì)發(fā)酵過程中糖的利用進(jìn)行分析，得發(fā)酵性能曲線，見圖2。

圖2 IPE-1(a)、IPE-3(b)、IPE-5(c)發(fā)酵性能Fig.2 Fermentation performance of IPE-1 (a), IPE-3 (b), IPE-5 (c)

由圖2中a可知IPE-1在整個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)果糖、葡萄糖的利用狀況和低聚果糖產(chǎn)量。在整個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)，果糖一直維持在一個(gè)低水平的狀態(tài)，葡萄糖在12 h左右達(dá)到峰值，12 h至發(fā)酵結(jié)束緩慢下降，維持在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，低聚果糖在12 h達(dá)到峰值，并在12 h至發(fā)酵結(jié)束持續(xù)下降。整個(gè)發(fā)酵過程中，低聚果糖的峰值為103.57 g/L，葡萄糖的峰值為64.30 g/L，果糖的峰值為14.6 g/L。

由圖2中b可知IPE-3在整個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)果糖、葡萄糖的利用狀況和低聚果糖產(chǎn)量。在整個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)，果糖維持在較低水平，并在緩慢提高，72 h時(shí)達(dá)到峰值，葡萄糖在12 h時(shí)達(dá)到峰值，并在之后維持在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，低聚果糖在12 h時(shí)達(dá)到峰值，并在之后持續(xù)下降到發(fā)酵結(jié)束。在整個(gè)發(fā)酵過程中，低聚果糖的峰值為116.62 g/L，葡萄糖的峰值為73.42 g/L，果糖的峰值為27.68 g/L。

由圖2中c可知IPE-5在整個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)果糖、葡萄糖的利用狀況和低聚果糖產(chǎn)量。在0～48 h，果糖含量在逐步上升，并在48 h達(dá)到峰值，葡萄糖在12 h達(dá)到峰值，并在之后持續(xù)下降，低聚果糖在12 h時(shí)達(dá)到峰值，然后持續(xù)快速下降到發(fā)酵結(jié)束。在整個(gè)發(fā)酵過程中，低聚果糖的峰值為110.91 g/L，葡萄糖的峰值為49.28 g/L，果糖的峰值為65.90 g/L。

由圖1可知，IPE-1和IPE-5發(fā)酵液中的菌體濃度在發(fā)酵過程中均上升較快，IPE-3發(fā)酵液中的菌體濃度與IPE-1和IPE-5相比上升較慢，在60～72 h，IPE-1和IPE-3發(fā)酵液中的菌體濃度又開始快速上升，發(fā)酵結(jié)束時(shí)IPE-3的菌體濃度最低，但細(xì)胞總酶活最高。

由圖2可知，IPE-1、IPE-3和IPE-5發(fā)酵液中的低聚果糖主要在最初的12 h內(nèi)產(chǎn)生，并在12 h之后呈持續(xù)下降趨勢(shì)，IPE-1、IPE-3和IPE-5蔗糖原料在12 h時(shí)還有少量，在24 h前，發(fā)酵液中的原料蔗糖已消耗完，推測(cè)低聚果糖濃度的降低是因?yàn)檎崽窃喜蛔阋约捌咸烟菨舛鹊纳?，葡萄糖濃度的升高?huì)對(duì)低聚果糖的合成起抑制作用，在12 h之后，由于原料耗盡以及葡萄糖的反饋抑制作用，β-D-呋喃果糖苷酶的水解活性大于果糖基化活性，低聚果糖開始持續(xù)分解，充當(dāng)碳源被菌體利用，以維持菌體自身代謝和菌體生長(zhǎng)。綜合得出，IPE-3為生產(chǎn)低聚果糖的最優(yōu)菌株。

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)IPE-3發(fā)酵的影響

在不同的通氣量下分批培養(yǎng)的時(shí)間曲線，在2.7 L生物反應(yīng)器中于pH為5.5，25 ℃下以不同的通氣量培養(yǎng)出芽短梗霉菌IPE-3，在400，600，800，1000 r/min條件下，低聚果糖產(chǎn)量、細(xì)胞酶活、菌體濃度和發(fā)酵耗氧情況見圖3。

圖3 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)IPE-3發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of stirring speed on the fermentation of IPE-3

出芽短梗霉在發(fā)酵過程中，DO值隨攪拌速度的變化而變化。同時(shí)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，出芽短梗霉可以暴露于高剪切速率下，所以制定了從低轉(zhuǎn)速到高轉(zhuǎn)速不同的攪拌速度(400，600，800，1000 r/min)進(jìn)行分批培養(yǎng)，以研究攪拌速度對(duì)低聚果糖生物合成的影響。由圖3可知，低聚果糖在12 h時(shí)獲得了最大濃度，在攪拌轉(zhuǎn)速為400，600，800，1000 r/min下低聚果糖的最大濃度分別為(116.6±5.8)，(123.2±6.2)，(97.2±4.9)，(106.8±5.3) g/L。在600 r/min下獲得最大產(chǎn)率為61.6%±3.0%(g FOS/g蔗糖)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，酶的活性在400，600，800，1000 r/min下12 h時(shí)分別為(636.5±31.8)，(1666.3±84)，(1691.6±84.6)，(1927.2±96.4) U。

當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速高于400 r/min時(shí)，酶活性增長(zhǎng)迅速，而當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速高于600 r/min后，酶活性幾乎沒有增加。對(duì)于菌體濃度，在發(fā)酵時(shí)逐漸增加，在400，600，800，1000 r/min下發(fā)酵12 h時(shí)分別為(6.3±0.30)，(6.2±0.31)，(10.2±0.51)，(10.4±0.50) g/L。當(dāng)攪拌速度高于600 r/min時(shí)，菌體濃度急劇增加，而在400 r/min和600 r/min或800 r/min和1000 r/min之間沒有太大差異。因此，攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)低聚果糖的產(chǎn)生、酶產(chǎn)生和細(xì)胞生長(zhǎng)顯示出不同的影響。同時(shí)，根據(jù)以上數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析可以發(fā)現(xiàn)，低聚果糖的產(chǎn)生和酶活性不一致。同樣，盡管細(xì)胞的生長(zhǎng)和酶的產(chǎn)生隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，但當(dāng)時(shí)它們并沒有耦合。此外，在所有使用的攪拌速度下，培養(yǎng)12 h后，DO值均降至0以下，并且培養(yǎng)12 h后低聚果糖開始下降。可以得出以下結(jié)論：高溶氧會(huì)促進(jìn)低聚果糖的增加和產(chǎn)生，而低溶氧會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和酶的產(chǎn)生。另外，攪拌轉(zhuǎn)速可以增強(qiáng)氧氣的溶解，但是不能產(chǎn)生氧氣。因此，接下來研究通氣量對(duì)低聚果糖的影響，因?yàn)檫@是氧氣的來源。

2.3.2 發(fā)酵罐通氣量對(duì)IPE-3發(fā)酵的影響

在不同的通氣量下分批培養(yǎng)的時(shí)間曲線，在2.7 L生物反應(yīng)器中于pH為5.5，25 ℃下以不同的通氣量培養(yǎng)出芽短梗霉IPE-3，在0.9，1.8，2.7 L/min通氣量下，低聚果糖產(chǎn)量、細(xì)胞酶活、菌體濃度和發(fā)酵耗氧情況見圖4。

圖4 通氣量對(duì)IPE-3發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of ventilation volume on the fermentation of IPE-3

由圖4可知，低聚果糖在12 h時(shí)獲得了最大濃度，F(xiàn)OS的最大濃度在0.9，1.8，2.7 L/min的條件下分別為(118.7±5.9)，(123.2±6.2)，(81.2±4.1) g/L。低聚果糖含量在0.9 L/min和1.8 L/min之間沒有太大差異，而在2.7 L/min時(shí)則比0.9 L/min和1.8 L/min時(shí)低得多。對(duì)于菌體的酶的產(chǎn)生和細(xì)胞的生長(zhǎng)，它們的濃度一直在增加，持續(xù)到發(fā)酵結(jié)束。對(duì)于酶活性，在0.9，1.8，2.7 L/min下，在12 h時(shí)分別為(1449.6±68.3)，(1666.3±83.3)，(1440.4±72.0) U。

當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)12 h后，酶活性在2.7 L/min下增長(zhǎng)緩慢。對(duì)于菌體濃度，在0.9，1.8，2.7 L/min下，在12 h時(shí)分別為(6.8±0.34)，(6.18±0.31)，(12.9±0.51) g/L。培養(yǎng)12 h后，在0.9 L/min條件下的細(xì)胞比在1.8 L/min條件下的細(xì)胞生長(zhǎng)快，這導(dǎo)致在發(fā)酵時(shí)，在0.9 L/min條件下的酶活性比在1.8 L/min條件下的酶活性低。同時(shí)，在2.7 L/min條件下，短梗霉菌細(xì)胞在整個(gè)發(fā)酵過程中生長(zhǎng)迅速，遠(yuǎn)高于在0.9 L/min和1.8 L/min條件下的菌體濃度。因此，推測(cè)在2.7 L/min下低聚果糖濃度和酶活性低得多的原因是較高的菌體濃度。對(duì)于DO值，在所有通氣量條件下，DO值均下降至0以下，這意味著在發(fā)酵培養(yǎng)12 h后，通氣量的增加無法顯著提高DO值，而在第一時(shí)間就影響了低聚果糖的產(chǎn)生。推測(cè)12 h的原因可能是發(fā)酵液中的氧分子無法在水中有效溶解，因此，下一部分將研究發(fā)酵過程中罐壓的影響。

2.3.3 發(fā)酵罐罐壓對(duì)IPE-3發(fā)酵的影響

圖5 罐壓對(duì)IPE-3發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of tank pressure on the fermentation of IPE-3

在生物反應(yīng)器的不同罐壓下分批培養(yǎng)的時(shí)間曲線，在2.7 L生物反應(yīng)器中于pH為5.5、1.8 L/min、25 ℃和不同壓力的發(fā)酵罐中培養(yǎng)出芽短梗霉菌IPE-3，IPE-3在0，0.4，0.8 bar罐壓下，低聚果糖產(chǎn)量、細(xì)胞酶活、菌體濃度和發(fā)酵耗氧情況見圖5。

由圖5可知，隨著發(fā)酵罐罐壓的提高，對(duì)于低聚果糖的產(chǎn)量而言，在較高的發(fā)酵罐罐壓下，低聚果糖的產(chǎn)量反而會(huì)下降，在12 h,0，0.4，0.8 bar條件下，低聚果糖的濃度分別為(123.2±6.2)，(114.2±5.7)，(110.4±5.5) g/L。對(duì)于菌體濃度而言，在0.4 bar時(shí)顯著增加，0.4 bar和0.8 bar相比，幾乎保持恒定，在0，0.4，0.8 bar下分別為(6.2±0.31)，(11.9±0.57)，(11.4±0.61) g/L。對(duì)于酶活性，在0.4 bar之前在較高的發(fā)酵罐罐壓下升高，然后下降，在0，0.4，0.8 bar下分別為(1666.3±84)，(1954.2±77.7)，(863.5±48.2) U。

由圖5可知，當(dāng)生物反應(yīng)器的罐壓提高到0.8 bar時(shí)，幾乎達(dá)到了所用發(fā)酵罐的最大值，初始發(fā)酵時(shí)發(fā)酵反應(yīng)器的溶氧高達(dá)161.2%，與0 bar條件下相比，培養(yǎng)12 h并沒有得到有效改善。這意味著僅通過一個(gè)因素(即攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量或發(fā)酵罐罐壓)不能提高DO值。此外，酶產(chǎn)生的趨勢(shì)也不完全符合細(xì)胞生長(zhǎng)。例如，菌體濃度在0.8 bar下最高，而酶活性在此壓力下最低。因此，碳源進(jìn)入細(xì)胞生長(zhǎng)，低聚果糖的產(chǎn)生和酶產(chǎn)生的代謝途徑被生物反應(yīng)器的不同壓力所改變，在相同的發(fā)酵液成分下，菌體濃度、低聚果糖濃度和酶的濃度在生物反應(yīng)器的不同壓力下也會(huì)發(fā)生改變。

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)從土壤中篩選和實(shí)驗(yàn)室已有的出芽短梗霉菌進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)IPE-3是一種生產(chǎn)低聚果糖的優(yōu)秀菌株，在發(fā)酵中，IPE-3細(xì)胞濃度不高，但是細(xì)胞酶活和低聚果糖的產(chǎn)量高，適合作為低聚果糖的生產(chǎn)菌株。對(duì)IPE-3進(jìn)行溶氧控制的研究，通過控制發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速、通氣量和罐壓發(fā)現(xiàn)，IPE-3在攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min下低聚果糖產(chǎn)量最高，在通氣量1.8 L/min下低聚果糖產(chǎn)量最高，在加壓條件下低聚果糖的產(chǎn)量會(huì)下降。