人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體保護(hù)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞抵抗高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

嵇芳芳 金吉 梁亞

糖尿病作為一種損害機(jī)體多器官及組織的慢性內(nèi)分泌疾病，屬于全球性問題。目前我國(guó)的糖尿病患者數(shù)量位列全球首位，且發(fā)病率逐年提升[1]。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)細(xì)胞是眼球部一種獨(dú)特的上皮細(xì)胞，其能夠直接轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖分子為視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層細(xì)胞提供能量，RPE細(xì)胞作為視網(wǎng)膜的外屏障，因此極易受到血糖水平波動(dòng)的影響，進(jìn)而發(fā)生病理和功能的改變[2]。長(zhǎng)期處于高糖環(huán)境下的糖尿病患者，機(jī)體高濃度糖刺激容易誘導(dǎo)RPE細(xì)胞因產(chǎn)生過多氧自由基而造成氧化應(yīng)激損傷，RPE 細(xì)胞功能會(huì)出現(xiàn)紊亂受損，造成視網(wǎng)膜神經(jīng)感覺層能量供給障礙進(jìn)而導(dǎo)致多種視網(wǎng)膜病變[3]。糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)作為最常見的 I 和II型糖尿病微血管嚴(yán)重的并發(fā)癥，是由血糖增高導(dǎo)致的視網(wǎng)膜血管通透性增加導(dǎo)致患者出現(xiàn)糖尿病黃斑水腫(diabetic macularedema,DME)，是視力喪失的最常見病因。目前糖尿病性視網(wǎng)膜病變已經(jīng)成為全球成年人的主要致盲性眼部疾病，嚴(yán)重影響眼盲患者的日常生活[4]。盡管大量研究探索了DR的病因?qū)W及病理學(xué)，但是對(duì)DR治療方案仍有待進(jìn)步，需要進(jìn)一步研究創(chuàng)新性藥物和治療靶標(biāo)，以期改善DR患者預(yù)后。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical mesenchymal stem cells，hUMSCs)是具有自我更新和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，能夠分泌各種生長(zhǎng)因子在免疫抑制，炎癥調(diào)節(jié)和組織損傷修復(fù)中起重要作用。已有研究嘗試將hUMSCs應(yīng)用于針對(duì)DR的治療中[5]。外泌體是由多種活細(xì)胞分泌到細(xì)胞外直徑約30～100 nm的小囊泡，具有雙層脂質(zhì)膜性結(jié)構(gòu)，可以攜帶蛋白、核酸及脂質(zhì)等生物活性分子作用到靶細(xì)胞調(diào)控各種生理功能。有研究證明來源于hUMSCs的外泌體在生物表型上與來源細(xì)胞一致保持，并且可以作為細(xì)胞間運(yùn)載體將所攜帶的核酸及蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)帶到受體細(xì)胞/靶細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)控作用，影響受體細(xì)胞/靶細(xì)胞的生理生化反應(yīng)，顯示出具有治療多種疾病的潛在能力[6]。值得特別注意的是，在移植hUMSCs入人體內(nèi)后往往會(huì)發(fā)生不良分化，尤其是具有可能導(dǎo)致機(jī)體局部成瘤的風(fēng)險(xiǎn)，而移植時(shí)采用hUMSCs來源的外泌體則可以大大降低這種不良分化以及成瘤的風(fēng)險(xiǎn)。因此，hUMSCs來源外泌體在疾病治療方面比hUMSCs細(xì)胞治療風(fēng)險(xiǎn)更小，應(yīng)用治療范圍更廣[7]。本實(shí)驗(yàn)中，通過觀察hUMSCs來源的外泌體對(duì)高糖作用下的RPE細(xì)胞的抗凋亡功能及分子機(jī)制方面進(jìn)行探討。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)研究。hUMSCs購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司，人RPE細(xì)胞(ARPE-19)購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；干細(xì)胞培養(yǎng)基、Dulbecco Eagle 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自上海培元公司，去外泌體胎牛血清(Exo-FBS )購(gòu)自SBI公司(美國(guó))；相關(guān)一抗均購(gòu)自Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶( HRP ) 標(biāo)記抗兔、抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)CST公司。PVDF硝酸纖維素膜 (美國(guó) Millipore)，DAPI (美國(guó)life)，蛋白酶、磷酸酶抑制劑(Takara)，ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒 (南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司)，CCK8檢測(cè)試劑 (上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，低溫超速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)。

二、蛋白提取及蛋白質(zhì)免疫印記(Western blot)

收集細(xì)胞，冷PBS 洗兩遍后離心細(xì)胞沉淀，去上清加入適量的RIPA裂解液 (使用前加入蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑)，放置于冰上反應(yīng)10～20 min，期間斡旋震蕩10～15 s以完成細(xì)胞裂解。12000 g，4 ℃離心10 min，取適量上清移至新的離心管；用 BCA 蛋白濃度測(cè)定法檢測(cè)上清蛋白濃度，將6X上樣緩沖液和上清適量混合均勻，95 ℃加熱5 min后進(jìn)行SDS電泳分離；當(dāng)溴酚藍(lán)泳至膠板底部附近時(shí)停止，取下凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(電壓100 V 50 min)，結(jié)束后輕輕取出 PVDF 膜用2%BSA封閉1 h后進(jìn)行一抗孵育過夜(4 ℃)。PVDF 膜用PBST清洗3次后孵育HRP連接二抗稀釋液1 h，最后用ECL檢測(cè)液顯影。

三、外泌體提取分離

收集hUMSCs的培養(yǎng)上清液，進(jìn)行一系列梯度離心去除細(xì)胞碎片(300 g，5 min；2000 g，20 min)；去除大囊泡(12000 g離心40 min)。把上清液通過0.22 μm的過濾器(Millipore)，100000 g 4 ℃超速離心3 h(L-80XP超速離心機(jī))。用PBS重懸沉淀，再次在100000 g超速離心3 h(4 ℃)，將沉淀顆粒重新懸浮在PBS中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

四、透射電鏡(TEM)

將外泌體用2.5%的戊二醛在0.1M的緩沖液中重新懸浮，并在室溫下固定在碳涂層的銅網(wǎng)格上30 min，然后用2%的鈾酰鹽負(fù)染1～2 min，用清水洗一次室溫晾干。使用透射電子顯微鏡(JEM-2100)獲取圖像。

五、納米顆粒追蹤分析檢測(cè)(NTA)

使用納米顆粒跟蹤分析儀器(ZetaView，德國(guó))對(duì)外泌體的數(shù)量和尺寸大小進(jìn)行檢測(cè)。簡(jiǎn)言之：將溶液中的外泌體用PBS稀釋后上機(jī)檢測(cè)，根據(jù)稀釋系數(shù)確定其相對(duì)濃度。用NTA 2.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每個(gè)樣品進(jìn)行至少4個(gè)單獨(dú)的計(jì)數(shù)，并對(duì)計(jì)數(shù)進(jìn)行平均。

六、細(xì)胞增殖檢測(cè)(CCK-8)

將ARPE-19細(xì)胞接種在96孔板貼壁24 h后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置分別進(jìn)行5.6 mmol/L、30 mmol/L、30 mmol/L+外泌體處理后，分別孵育24 h、48 h和72 h后按照操作說明在每孔中加入10 μl的CCK-8試劑，將96孔板放回37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm處進(jìn)行測(cè)定，后根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞的活力。

七、EdU試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖

取狀態(tài)良好的ARPE-19細(xì)胞，以不同濃度葡萄糖培養(yǎng)，分組分別為：5.6 mmol/L處理組，30 mmol/L處理組，30 mmol/L+外泌體處理組；每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，24 h后收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析細(xì)胞周期變化；參考銳博EdU試劑盒說明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行孵育、固定、通透等處理，染色完成后加PBS緩沖液避光保存，在熒光顯微鏡下觀察。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

結(jié) 果

一、 hUMSCs外泌體的分離及鑒定

培養(yǎng)hUMSCs并收集其上清進(jìn)行差速離心去除hUMSCs的碎片及細(xì)胞外大囊泡后，利用超速離心分離得到細(xì)胞外泌體。透射電鏡下可見hUMSCs來源外泌體為直徑在30～100 nm之間圓形或橢圓形具有明顯膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，囊泡腔內(nèi)可見低電子密度成分(圖1A)，納米顆粒追蹤分析(NTA)也證實(shí)了提取的hUMSCs外泌體形態(tài)和粒徑大小符合外泌體特征(圖.1B)。另外，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印記( Westernblot )檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體表達(dá)外泌體特異蛋白Alix、CD63及CD9，提示超速離心法能夠獲得純度較高的hUMSCs外泌體。

圖1 A：提取分離hUMSCs外泌體，固定負(fù)染后進(jìn)行電鏡成像 (比例尺：100 nm) B：NTA檢測(cè)hUMSCs外泌體數(shù)量和尺寸大小分布 C：hUMSCs外泌體進(jìn)行western bolt鑒定外泌體標(biāo)志蛋白Alix, CD63,CD9 圖2 A：對(duì)貼壁ARPE-19細(xì)胞進(jìn)行5.6 mmol/L，30 mmol/L，30 mmol/L+外泌體分別處理0 h、24 h、48 h和72 h后，用CCK 8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞在450 nm處吸光值，每個(gè)處理至少進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)取平均值 B：貼壁ARPE-19細(xì)胞進(jìn)行5.6 mmol/L，30 mmol/L，30 mmol/L+外泌體處理48 h后加入稀釋好的EdU試劑，PBS清洗3次后固定，DAPI染細(xì)胞核，熒光顯微鏡下獲取細(xì)胞圖片(比例尺：200 μm) C：對(duì)5.6 mmol/L，30 mmol/L，30 mmol/L+外泌體處理的ARPE-19細(xì)胞提取蛋白，用western bolt檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白E和D1

二、hUMSCs外泌體對(duì)高糖培養(yǎng)下ARPE-19細(xì)胞的增殖影響。

首先，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同糖濃度(5.6 mmol/L，30 mmol/L，30 mmol/L+外泌體)處理相應(yīng)時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)顯著抑制RPE細(xì)胞的增殖，而高糖+外泌體處理組細(xì)胞增殖能力恢復(fù)到正常水平，外泌體的添加緩解了高糖培養(yǎng)誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞損傷(圖2A)。同時(shí)，EdU實(shí)驗(yàn)表明高糖造成的增殖抑制同樣能被間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體逆轉(zhuǎn)(圖2B)。另外，如圖2C所示，當(dāng)細(xì)胞增殖被高糖環(huán)境抑制時(shí)，周期蛋白E、D1顯著減少；間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體恢復(fù)高糖降低的ARPE-19細(xì)胞周期蛋白E、D1到正常水平?？偨Y(jié)來說，hUMSCs外泌體能夠促進(jìn)ARPE-19細(xì)胞的增殖從而降低高糖培養(yǎng)造成的細(xì)胞損傷。

三、hUMSCs外泌體對(duì)高糖培養(yǎng)下ARPE-19細(xì)胞的抗凋亡作用

在高糖培養(yǎng)條件下，我們發(fā)現(xiàn)，ARPE-19細(xì)胞內(nèi)的caspase3發(fā)生切割，Bcl-2受高糖影響減少，而hUMSCs外泌體能抑制caspase3切割體的產(chǎn)生，阻止Bcl-2的減少，降低了高糖培養(yǎng)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(圖3A)。同樣，流式細(xì)胞儀檢測(cè)證明hUMSCs外泌體顯著降低高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率(20～30%)(圖3B)。表明hUMSCs外泌體能夠保護(hù)人RPE細(xì)胞抵抗高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖3 A：提取分別用5.6 mmol/L，30 mmol/L，30 mmol/L+外泌體處理的ARPE-19細(xì)胞蛋白，通過蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)caspase3/cleaved-caspase3/Bax/Bcl-2蛋白的變化 B：收集5.6 mmol/L，30 mmol/L，30 mmol/L+外泌體處理48 h的ARPE-19細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

討 論

處于視網(wǎng)膜最外單層的RPE細(xì)胞，它不僅可以吸收陽光，提供給視網(wǎng)膜外層營(yíng)養(yǎng)，還可以維持光感受器的新陳代謝功能，除此之外，還參與視覺循環(huán)和細(xì)胞因子的分泌。因此,RPE對(duì)視網(wǎng)膜光感受器的維持至關(guān)重要。一些糖尿病患者由于長(zhǎng)期處于高糖環(huán)境下，會(huì)誘發(fā)RPE出現(xiàn)缺血、炎癥激活及氧化應(yīng)激等病理改變,最終導(dǎo)致DR[1，8]。

由于DR的發(fā)病率和流行率在全球范圍內(nèi)不斷上升，有效的治療藥物研發(fā)及其調(diào)控機(jī)制研究迫在眉睫。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)一類具有多方向分化潛能的干細(xì)胞，多存在于骨髓和脂肪等多種組織中的。其中，源于人臍帶的華通氏膠組織的hUMSCs，制備產(chǎn)量高，其具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、免疫反應(yīng)低、容易體外分離和細(xì)胞可連續(xù)傳代培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是有希望用于治療各種疾病的一類活細(xì)胞工具[7]。但有些研究結(jié)果表明，hUMSCs移植后會(huì)分化為癌相關(guān)成纖維細(xì)胞，易增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲力，甚至能夠促進(jìn)癌細(xì)胞增殖成瘤和遷移，另外還可促血管生成，誘導(dǎo)細(xì)胞抗凋亡和耐藥性的產(chǎn)生[7][9]。來源于hUMSCs的外泌體不具有其母源細(xì)胞特點(diǎn)，還可以降低由于MSCs移植帶來的不良分化致瘤等風(fēng)險(xiǎn)，具有開發(fā)為治療疾病的潛力。另外，在體外進(jìn)行培養(yǎng)MSCs過程中，其外泌體分泌與其他相比量多，易于提取和儲(chǔ)存[10，11]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇了優(yōu)點(diǎn)較多的hUMSCs來提取外泌體。在此研究中，我們首先成功的從hUMSCs細(xì)胞培養(yǎng)上清液中提取了外泌體，并經(jīng)過NTA和電鏡檢測(cè)提取的外泌體形態(tài)和體積符合其定義[12]，并通過western blot對(duì)外泌體標(biāo)記物CD63、CD9和Alix進(jìn)行鑒定，證實(shí)外泌體提取成功，其成分可靠。目前認(rèn)為差異超速離心法是在提取外泌體實(shí)驗(yàn)中最常用的方法，具有提取樣品容量大，提取成本低等優(yōu)點(diǎn)。

源于hUMSCs的外泌體包含有蛋白質(zhì)、脂類、mRNA、microRNA等成分，可將遺傳信息傳遞給受體細(xì)胞，從而改變受體細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程,調(diào)整細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的修飾和定位，調(diào)控信號(hào)通路等方式來影響細(xì)胞的生理生化功能。Xiao Li等[13]將來源于人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體應(yīng)用于治療體內(nèi)及體外嚴(yán)重?zé)齻T導(dǎo)的過度炎癥實(shí)驗(yàn)研究，揭示了hUMSCs外泌體通過抑制TLR4和NF-κB信號(hào)通路從而抑制了炎癥應(yīng)答，緩解了嚴(yán)重?zé)齻麑?dǎo)致的過度炎癥。Ruenn等[14]研究結(jié)果表明，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體通過利用補(bǔ)充蛋白質(zhì)來緩解心臟再灌注損傷，緩解缺血性心臟病癥。在本實(shí)驗(yàn)的功能和機(jī)制研究中,我們發(fā)現(xiàn)，與正常葡萄糖濃度組(5.6 mmol/L)以及高糖組(30 mmol/L)相比，在高糖損傷環(huán)境下，hUMSCs來源的外泌體可顯著提高細(xì)胞ARPE-19的活性，且能夠促進(jìn)cyclin E和cyclin D1在高糖作用下的表達(dá)；同時(shí)，這種外泌體可顯著降低高糖損傷環(huán)境下ARPE-19細(xì)胞凋亡率，抑制高糖所誘導(dǎo)的凋亡蛋白如cleaved-caspase3及Bax的產(chǎn)生。我們的結(jié)果表明,hUMSCs來源的外泌體在治療DR方面具備一定的潛在價(jià)值,具備成為未來治療DR的一種新的手段。接下來的工作需要對(duì)hUMSCs來源的外泌體所包含的發(fā)揮特定效應(yīng)的分子進(jìn)行鑒定和研究。