廣西三江縣侗族與漢族新生兒UGT1A1基因多態(tài)性分析*

姚 璇，鐘丹妮Δ，彭運(yùn)聰

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，南寧 530021；2.三江侗族自治縣人民醫(yī)院兒科，柳州 545500）

已有研究證實(shí)，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶-A1（uridine diphosphate-glucuronosyltransferase 1A1，UGT1A1）是膽紅素在肝臟進(jìn)行葡萄糖醛酸化代謝的唯一關(guān)鍵酶[1]。若UGT1A1基因發(fā)生突變，導(dǎo)致相應(yīng)酶活性降低，則膽紅素代謝過(guò)程受阻，膽紅素積聚從而發(fā)生黃疸。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，UGT1A1基因多態(tài)性在不同種族人群中分布不同[2-5]。廣西三江縣是多民族聚居地，本文主要探討三江縣侗族和漢族新生兒UGT1A1基因多態(tài)性常見(jiàn)類型及其等位基因頻率的民族差異性及不同突變類型對(duì)新生兒血清膽紅素水平的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2021年1～12月在廣西壯族自治區(qū)三江侗族自治縣人民醫(yī)院出生的侗族新生兒152例，漢族新生兒42例（經(jīng)兒科醫(yī)生詢問(wèn)確認(rèn)為三代純系侗族/漢族）。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：父母、祖父母及外祖父母均為侗族或漢族的新生兒；排除標(biāo)準(zhǔn):（1）G-6-PD缺乏；（2）地中海貧血；（3）遺傳性紅細(xì)胞增多癥；（4）母嬰血型不合導(dǎo)致的溶血性疾??；（5）先天性膽道閉鎖等已明確可影響膽紅素水平的因素。本研究已取得廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2021KY-E-286）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取新生兒外周血2 mL，以EDTA抗凝，用血液基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，產(chǎn)物置于－20℃冰箱中保存。

1.2.2 PCR反應(yīng)及電泳鑒定 根據(jù)課題組前期設(shè)計(jì)的UGT1A1基因啟動(dòng)子TATA盒及第1外顯子2對(duì)引物：TATA盒+exon1-N1（上游引物5’-AAT GGA TCC TGA GGT TCT GG-3’，下游引物5’-CTG GGTAGC CTCAAA TTC CA-3’），產(chǎn)物長(zhǎng)度834 bp；exon1-N2（上游引物5’-TTG TCT GGC TGT TCC CAC TT-3，下游引物5’-TGC CAA AGA CAGACT CAA ACC-3’）產(chǎn)物長(zhǎng)度657 bp[6]。PCR體系（總體積50μL）：2×Es Tap Master Mix 25μL，上、下游引物各2μL，DNA模板500 ng，無(wú)酶水補(bǔ)充至50μL。PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

表1 PCR反應(yīng)體系

2%瓊脂糖凝膠用Ⅰ型核酸染料染色，以DNA Marker為分子量參照物，每例PCR產(chǎn)物取5μL，電泳條件為120 V電壓，70 mA電流，運(yùn)行30 min。

1.2.3 基因測(cè)序 經(jīng)電泳檢測(cè)過(guò)的所有合格的PCR產(chǎn)物，送上海生工進(jìn)行正向測(cè)序。應(yīng)用chromas軟件分析測(cè)序結(jié)果，測(cè)序結(jié)果比對(duì)基因文庫(kù)的UGT1A1基因序列，觀察波形，發(fā)現(xiàn)有堿基突變點(diǎn)的產(chǎn)物重新進(jìn)行反向測(cè)序，以確保結(jié)果真實(shí)可靠。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，基因頻率和等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；采用SHEsis在線分析平臺(tái)進(jìn)行等位基因頻率比較、Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)、連鎖不平衡檢驗(yàn)、單倍型分析[7]，其中HWEP＞0.05表示符合遺傳平衡。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UGT1A1基因測(cè)序結(jié)果

本研究主要檢測(cè)已報(bào)道的3種突變類型情況：?jiǎn)?dòng)子區(qū)域的（TA）6＞7插入突變、c.211G＞A點(diǎn)突變、c.686C＞A點(diǎn)突變。結(jié)果顯示：本研究人群中（TA）6＞7插入突變有28例，c.211G＞A點(diǎn)突變60例，（TA）6＞7插入突變+c.686C＞A復(fù)合突變2例?；驕y(cè)序色譜圖見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 UGT1A1啟動(dòng)子（TA）6＞7位點(diǎn)測(cè)序圖

圖2 UGT1A1 c.211G＞A位點(diǎn)測(cè)序圖

圖3 UGT1A1 c.686C＞A位點(diǎn)測(cè)序圖

2.2 UGT1A1不同突變類型對(duì)血清總膽紅素水平的影響

攜帶單一c.211G＞A純合突變的血清總膽紅素高于無(wú)突變類型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而攜帶單一（TA）6＞7雜合、單一c.211G＞A雜合、c.686C＞A雜合+A復(fù)合突變的血清總膽紅素分別與無(wú)突變類型比較差異，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 不同UGT1A1基因類型血清總膽紅素水平分析

表2 不同UGT1A1基因類型血清總膽紅素水平分析

a、b、c、d分別與無(wú)突變類型比較。

2.3 UGT1A1基因多態(tài)性分析

在兩個(gè)民族群體中（TA）6＞7突變、c.211G＞A兩種類型的預(yù)期值和觀察值吻合度較好（P＞0.05），基因類型分布均符合Hardy-Weinberg平衡；侗、漢兩族間（TA）6/7和c.211G＞A的等位基因頻率相近，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；因c.686C＞A例數(shù)僅2例，本研究對(duì)其統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果不做分析，見(jiàn)表3。

表3 侗、漢兩族UGT1A1基因多態(tài)性分析

2.4 UGT1A1基因連鎖不平衡檢驗(yàn)和單倍型分析

本研究共5種單倍型，最常見(jiàn)的是單倍型1、2兩種（占所有單倍型的80%以上），兩個(gè)民族的單倍型頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在UGT1A1的3個(gè)位點(diǎn)之間觀察到的連鎖不平衡見(jiàn)表4，與單倍型對(duì)應(yīng)的頻率和P值見(jiàn)表5。

表4 連鎖不平衡檢驗(yàn)

表5 侗、漢民族間單倍型頻率比較

3 討論

群體中的多態(tài)現(xiàn)象是指在一個(gè)群體中存在由遺傳因素決定的兩種及以上的變異基因類型。在同一基因座上如果有≥2個(gè)以上的等位基因，當(dāng)?shù)任换蝾l率≥0.01且攜帶該等位基因的雜合子頻率＞2%，則可認(rèn)為該基因座具有多態(tài)性[8-9]。本研究中的（TA）6＞7突變和c.211G＞A點(diǎn)突變均滿足上述兩個(gè)條件，因此可認(rèn)為（TA）6＞7位點(diǎn)和c.211G＞A位點(diǎn)的基因座均具有多態(tài)性。

目前國(guó)內(nèi)研究最多的是c.211G＞A位點(diǎn)，該位點(diǎn)的多態(tài)性被認(rèn)為與國(guó)內(nèi)多個(gè)民族新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生有密切關(guān)系[6,10-12]。從研究結(jié)果中可以看出c.211G＞A是三江縣新生兒一個(gè)高頻突變位點(diǎn)，并且攜帶c.211G＞A純合突變的新生兒血清膽紅素水平顯著高于無(wú)突變新生兒，說(shuō)明c.211G＞A純合突變是引起三江縣新生兒血清膽紅素水平升高的重要的遺傳因素。對(duì)于（TA）6＞7位點(diǎn)，國(guó)內(nèi)觀點(diǎn)目前認(rèn)為（TA）6＞7插入突變雖然并不罕見(jiàn)[13-14]，但并不是我國(guó)少數(shù)民族的高頻突變位點(diǎn)，且與國(guó)內(nèi)新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生無(wú)明顯相關(guān)性[6]。另外該位點(diǎn)更多是在高加索人種中發(fā)生突變，例如我國(guó)的維吾爾族被認(rèn)為是高加索人種與蒙古人種的混合血統(tǒng)[15]，則有報(bào)道維吾爾族的（TA）6＞7突變頻率顯著高于漢族[2]。本研究結(jié)果支持上述觀點(diǎn)，認(rèn)為（TA）6＞7插入突變并不是三江縣新生兒UGT1A1基因的高頻突變位點(diǎn)，且并不會(huì)引起新生兒血清膽紅素明顯升高。而c.686C＞A突變，國(guó)內(nèi)外學(xué)者一致認(rèn)為該突變是個(gè)罕見(jiàn)突變類型，發(fā)生率較低[16-18]。本研究中只發(fā)現(xiàn)2例雜合突變，其中2例均是聯(lián)合（TA）6＞7突變的復(fù)合型基因突變，發(fā)生率低，可認(rèn)為是三江縣新生兒罕見(jiàn)突變類型。（TA）6＞7突變和c.211G＞A突變經(jīng)檢驗(yàn)符合遺傳平衡，但是侗族和漢族之間等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮是這兩個(gè)基因座的多態(tài)性并不存在民族性差異，符合遺傳平衡可能是自然環(huán)境和遺傳因素共同作用的結(jié)果。但是同樣是侗族和漢族，其他地區(qū)的（TA）6＞7和c.211G＞A等位基因頻率低于本研究[19]，也進(jìn)一步證實(shí)UGT1A1基因突變可能是存在地區(qū)性差異而非民族性差異。

綜上，本文通過(guò)總結(jié)三江縣侗族和漢族新生兒UGT1A1基因多態(tài)性的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)位于第1外顯子的c.211G＞A是三江縣新生兒高頻突變位點(diǎn)，且c.211G＞A純合突變是引起血清膽紅素升高的重要遺傳因素，上述結(jié)果對(duì)于基因篩查制定方案具有一定的臨床指導(dǎo)作用。