沙庫巴曲纈沙坦對慢性心力衰竭小鼠心功能的影響及作用機(jī)制*

莫壁伶，余市成，鐘惠娟，林海真，周治來

（1.廣州市荔灣中心醫(yī)院，廣州 510130；2.廣東省第二人民醫(yī)院，廣州 510137）

慢性心力衰竭（chronic heart failure,CHF）是大多數(shù)心血管疾病的終末表現(xiàn)，嚴(yán)重威脅我國人民生命健康。心力衰竭可引起一系列的神經(jīng)體液變化，主要是交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)，腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)（RAAS）激活[1]。眾所周知，沙庫巴曲纈沙坦可同時作用于腦啡肽酶（neprilysin,NEP）和腎素－血管緊張素雙系統(tǒng)，起到排鈉利尿、擴(kuò)張血管以及預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的作用，是治療CHF的新藥[2-3]。但除以上兩個主要神經(jīng)體液調(diào)節(jié)機(jī)制，心肌炎癥和凋亡也是介導(dǎo)心臟重塑的重要因素[4]，目前關(guān)于沙庫巴曲纈沙坦對CHF炎癥、凋亡的調(diào)控作用及機(jī)制仍未闡明。本研究通過構(gòu)建小鼠CHF模型，給予沙庫巴曲纈沙坦治療，探討其對炎癥、凋亡的調(diào)控作用及其對心功能的影響，進(jìn)一步闡明沙庫巴曲纈沙坦對CHF心肌的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 8周齡SPF級C57/BL6雌性小鼠30只,購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心［SCXK（粵）2018-0002］,體重（25±2）g。飼養(yǎng)期間自由進(jìn)食及飲水。本研究符合動物倫理相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 實驗試劑及儀器 沙庫巴曲纈沙坦（諾欣妥，國藥準(zhǔn)字：H20170344，50 mg/片，Novartis公司），阿霉素（sigma），兔抗小鼠CD68單克隆抗體（BIO-RAD），兔抗小鼠Active Caspase-3單克隆抗體（Cell Signal Technology）。小動物心臟超聲儀（Vevo 3100 Imaging System），倒置顯微鏡（型號DMI1，Leica），熒光顯微鏡（型號TCSSP2，Leica）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及模型制備 將30只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成空白組、模型組和治療組，每組10只。模型組和治療組采用腹腔注射阿霉素制備慢性充血性心力衰竭小鼠模型。具體方法：滅菌注射用水溶解阿霉素粉針，配成0.8 mg/mL濃度，按1.5 mg/kg的劑量每3 d一次進(jìn)行腹腔注射，連續(xù)給藥6周，期間空白組小鼠予以等量生理鹽水。

1.2.2 藥物治療方案 造模成功后開始藥物治療，治療時間為4周。治療組小鼠灌胃沙庫巴曲纈沙坦（68 mg/kg），空白組和模型組小鼠予以等量生理鹽水。

1.2.3 心臟超聲檢查 在治療結(jié)束后，采用超聲心動圖（vevo 3100 imaging system）對小鼠進(jìn)行高頻超聲心動圖檢查。具體方法：小鼠吸入異氟烷氣體進(jìn)行麻醉,探頭切跡朝向小鼠頭部,觀察小鼠心臟運(yùn)動情況,啟動分析測試系統(tǒng)，記錄檢測的參數(shù)包括左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室短軸縮短率（LVFS）。

1.2.4 Bio-Plex懸液芯片技術(shù)檢測各組小鼠靜脈血炎癥因子濃度 治療結(jié)束后，收集小鼠尾靜脈血0.5 mL，離心后取上清，-80℃凍存?zhèn)溆?。待所有?biāo)本收集完畢，4℃水浴解凍，使用Bio-Plex細(xì)胞因子檢測試劑盒檢測12種細(xì)胞因子。按說明書操作：用250μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液溶解標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉，并制備連續(xù)4倍稀釋的系列標(biāo)準(zhǔn)品；在96孔板的每個孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋液、待測品，隨后每孔加入50μL磁性微球。樣本孵育完成后，使用Bio-Plex磁力架手動洗板3次除去殘留液，將檢測抗體加入96孔反應(yīng)板，25μL/孔?？贵w孵育完成后，去除殘留液，每孔加入50μL Streptavidin-PE（SA-PE），室溫?fù)u床孵育10 min。孵育完成后洗板，加入Assay buffer重懸孔內(nèi)微球，125μL/孔。室溫?fù)u床重懸2 min。運(yùn)行Bio-Plex 200懸液芯片系統(tǒng)儀器，上機(jī)檢測。使用Bio-Plex Manager 6.1軟件讀取并分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 蘇木精—伊紅（HE）染色及免疫熒光檢測治療結(jié)束后，過量麻醉處死動物并快速取出心臟，從3組中各隨機(jī)挑選5個心臟標(biāo)本，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、4μm厚切片，按標(biāo)準(zhǔn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察3組小鼠心肌纖維、心肌細(xì)胞排列等情況。石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，檸檬酸鈉緩沖液（pH=6.0）修復(fù)高溫修復(fù)5 min，PBS漂洗5 min×3次，山羊血清封閉30 min后加入一抗：兔抗小鼠CD68（1:200）檢測炎癥細(xì)胞浸潤情況，兔抗小鼠Active Caspase-3（1∶400）檢測心肌凋亡情況。4℃孵育過夜，PBS漂洗5 min×3次，加入二抗Alexa Fluor 594山羊抗兔（1∶500），室溫孵育30 min。DAPI復(fù)染后封片，Leica熒光顯微鏡下觀察，采用Image J軟件分析圖片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 沙庫巴曲纈沙坦對心力衰竭小鼠炎癥的調(diào)節(jié)作用

與空白組比較，模型組中6種細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17、IL-8）顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，治療組的IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17顯著下降（P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠血清中細(xì)胞因子表達(dá)情況 pg/mL，，n=5

表1 各組小鼠血清中細(xì)胞因子表達(dá)情況 pg/mL，，n=5

與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

2.2 心臟超聲結(jié)果

模型組小鼠心室壁菲薄，室壁運(yùn)動紊亂，治療組小鼠LVEF、LVFS顯著高于模型組，LVESD、LVEDD顯著小于模型組（P＜0.05)，見表2、圖1。

圖1 3組小鼠心臟彩超圖像

表2 各組小鼠超聲參數(shù)變化 ，n=5

表2 各組小鼠超聲參數(shù)變化 ，n=5

與空白組比較,*P＜0.05，與模型組比較,#P＜0.05。

2.3 沙庫巴曲纈沙坦對CHF小鼠心肌病理的作用

HE染色顯示，空白組小鼠心肌細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞間隙均勻，細(xì)胞核偏小、排列疏松，心肌橫紋清晰；模型組小鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞增大、擁擠，細(xì)胞間隙不清，細(xì)胞核增大，核型不規(guī)則，可見畸形核，細(xì)胞核排列紊亂，細(xì)胞質(zhì)染色不均、團(tuán)塊狀，心肌橫紋結(jié)構(gòu)不清；治療組小鼠心肌細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞輕度增大，細(xì)胞間隙尚均勻，細(xì)胞核排列尚規(guī)則，心肌橫紋較清晰。免疫熒光染色顯示，空白組小鼠可見散在分布少量CD68陽性巨噬細(xì)胞，模型組可見大量CD68陽性細(xì)胞，而治療組CD68陽性細(xì)胞數(shù)量與模型組相比顯著下降（P＜0.05）；在空白組中，Caspase-3陽性表達(dá)很低，治療組Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)量顯著少于模型組(P＜0.05），見表3、圖2。

圖2 各組小鼠心肌HE染色（A，×400）、CD68陽性細(xì)胞（B,×200）和Caspase-3陽性細(xì)胞染色（C,×200）的情況（標(biāo)尺：100μm）

表3 各組小鼠心肌切片CD68陽性面積百分比和Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù) ,n=5

表3 各組小鼠心肌切片CD68陽性面積百分比和Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù) ,n=5

與空白組比較,*P＜0.05，與模型組比較,#P＜0.05。

3 討論

CHF可活體內(nèi)交感神經(jīng)興奮性、激活腎素—血管緊張素醛固酮系統(tǒng)等，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷及重塑[5]。目前認(rèn)為沙庫巴曲纈沙坦作用于腦啡肽酶和腎素—血管緊張素雙系統(tǒng)，起到排鈉利尿、擴(kuò)張血管以逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的作用，但其對心力衰竭后炎癥和凋亡的調(diào)控及其在修復(fù)心肌中的作用尚未完全闡明。本研究通過構(gòu)建CHF小鼠模型，予以沙庫巴曲纈沙坦治療，發(fā)現(xiàn)其顯著下調(diào)心力衰竭小鼠促炎因子表達(dá)水平，抑制心肌炎癥細(xì)胞浸潤，減輕心肌細(xì)胞凋亡，改善心肌重構(gòu)和增強(qiáng)小鼠心功能。

炎癥與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。沙庫巴曲纈沙坦對CHF炎癥調(diào)控作用尚未完全闡明。張相杰等[7]指出，沙庫巴曲纈沙坦能降低心力衰竭患者血清中IL-33、TNF-α和ICAM1表達(dá)水平，改善患者心室重塑，改善心功能。張瑞英等[8]證實，沙庫巴曲纈沙坦可以降低急性心?；颊哐蠭L-6、TNFα和內(nèi)皮素1的表達(dá)水平，改善PCI治療后的心室重構(gòu)。國外有研究指出，沙庫巴曲纈沙坦可以顯著抑制CHF伴射血分?jǐn)?shù)下降患者TNF-α和IL-18的濃度，改善外周血管功能和心功能[9]。以上研究提示，抑制心力衰竭患者體內(nèi)炎癥因子可能是沙庫巴曲纈沙坦治療心力衰竭的機(jī)制之一。但這些研究僅僅采用ELISA法檢測了少數(shù)幾種炎癥因子。由于心力衰竭會激活體內(nèi)炎癥網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致大量炎癥因子表達(dá)變化，本研究采用Bio-Plex懸液芯片技術(shù)檢測12種細(xì)胞因子，與傳統(tǒng)的ELISA方法相比，具有可同時檢測多種細(xì)胞因子、高敏感性、高精確性的特點，可顯著提升一次檢測獲取單個樣本信息的能力[10-11]。結(jié)果顯示，與空白組相比，6種炎癥因子在模型組表達(dá)升高，但沙庫巴曲纈沙坦可顯著下調(diào)其中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-17的濃度。這些細(xì)胞因子濃度異常升高，可激活機(jī)體防御反應(yīng)、免疫細(xì)胞增殖、分化等，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)。尤其是IL-6，與受體IL-6R結(jié)合后形成IL-6/IL-6R復(fù)合物，該復(fù)合物進(jìn)一步激活gp130，在心血管系統(tǒng)主要表現(xiàn)為增加血小板數(shù)量，增強(qiáng)單核細(xì)胞促凝功能，加劇動脈粥樣硬化，加重心肌損傷[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，沙庫巴曲纈沙坦治療組IL-6濃度下降幅度大，提示沙庫巴曲纈沙坦的治療作用強(qiáng)。IL-1β、TNF-α與IL-6的作用類似，均對心肌有毒害作用[13]。

IL-17是調(diào)節(jié)心肌重構(gòu)的重要因子。IL-17可以濃度依賴性降低心肌細(xì)胞鈣離子內(nèi)流電流幅度，增加炎癥通路NF-κB亞基p50和p65的表達(dá)，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。IL-17能通過調(diào)節(jié)TGF-β的生存，促進(jìn)心肌細(xì)胞纖維化，并能通過STAT3信號通路激活Th17細(xì)胞分化，加重心肌纖維化[14]。本研究結(jié)果顯示，沙庫巴曲纈沙坦能顯著下調(diào)CHF小鼠血清IL-17濃度，這可能是其治療CHF的一個重要機(jī)制。但關(guān)于IL-10對心肌的作用尚存爭議，其即可通過激活巨噬細(xì)胞而間接發(fā)揮加重纖維化的作用，影響心臟舒張功能。也有研究認(rèn)為，IL-10等抗炎因子對纖維化作用不明顯，基因敲除IL-10并不影響模型動物肌纖維細(xì)胞增殖和心肌重塑[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，治療組IL-4、IL-10等抗炎因子濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。推測IL-4和IL-10的具體作用與具體環(huán)境有關(guān)，關(guān)于IL-4、IL-10在沙庫巴曲纈沙坦治療CHF中的具體作用仍需進(jìn)一步研究。

阿霉素具有較強(qiáng)的心臟毒性，通過長期、反復(fù)腹腔注射阿霉素可誘導(dǎo)充血性心力衰竭模型，該操作方法簡單、創(chuàng)傷小且重復(fù)率高，是一種公認(rèn)的可用于制作充血性心力衰竭[16]。心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變是本研究的重要監(jiān)測指標(biāo)，為準(zhǔn)確評估沙庫巴曲纈沙坦對CHF小鼠心功能的改善作用，本研究在治療結(jié)束時采用高頻心臟超聲檢測所有動物L(fēng)VEF、LVESD、LVEDD和LVFS，以全面反映各組小鼠心臟功能變化。結(jié)果顯示，沙庫巴曲纈沙坦能顯著改善心力衰竭小鼠LVEF、LVESD、LVFS和LVEDD，說明沙庫巴曲纈沙坦治療4周可以顯著改善CHF小鼠心肌收縮功能，這與既往研究結(jié)果類似[17]。心肌結(jié)構(gòu)與心功能關(guān)系密切，長期的血流動力學(xué)改變導(dǎo)致心肌重構(gòu)，包括心肌細(xì)胞肥大，心肌纖維增多，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、壞死，心功能不可逆損傷[18]。本研究的HE染色結(jié)果顯示，治療組小鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯著優(yōu)于模型組，免疫熒光進(jìn)一步證實，治療組Caspase-3陽性凋亡細(xì)胞、CD68陽性炎癥細(xì)胞數(shù)量顯著少于模型組，證實沙庫巴曲纈沙坦治療可以降低CHF小鼠心肌細(xì)胞炎癥和凋亡反應(yīng)，改善心肌重構(gòu)。

綜上所述，沙庫巴曲纈沙坦可以緩解CHF小鼠心肌炎癥細(xì)胞浸潤和細(xì)胞凋亡，改善心室重塑，增強(qiáng)心功能，其機(jī)制可能與其下調(diào)促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-17等的表達(dá)有關(guān)。