抗生素暴露對小鼠腸道菌群的改變及結(jié)腸黏膜屏障功能的影響*

楊 夏，呂自力，肖 娟，王永才，陳秀奇，黃 婷，單慶文Δ

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 1.兒科；2.病理科，南寧 530021；3.廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學研究院，南寧 530021）

抗生素自發(fā)現(xiàn)以來被廣泛應用于多種致命的細菌感染性疾病中，如霍亂、傷寒、流行性腦脊髓膜炎和結(jié)核病等。但臨床上不規(guī)范使用抗生素現(xiàn)象日趨普遍，抗生素濫用的弊端隨之產(chǎn)生。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，抗生素的不規(guī)范使用與許多腸道相關(guān)疾病或腸道外疾病存在關(guān)聯(lián)，如抗生素相關(guān)性腸黏膜損傷、炎癥性腸病、結(jié)直腸癌、哮喘和糖尿病等[1-3]。

抗生素相關(guān)性腸黏膜損傷是指臨床上不規(guī)范應用抗生素后出現(xiàn)的一種常見不良反應?；颊吲R床表現(xiàn)大多較輕，表現(xiàn)為腹痛、嘔吐或腹瀉，暫停使用抗生素后癥狀可有不同程度的恢復。部分患者臨床表現(xiàn)較重，可有脫水、電解質(zhì)紊亂等表現(xiàn)，嚴重者出現(xiàn)偽膜性結(jié)腸炎或中毒性巨結(jié)腸，短期內(nèi)較難自行恢復或無法恢復，甚至出現(xiàn)腸穿孔或死亡[4]。健康人群擁有完整的腸道黏膜屏障系統(tǒng)，防止微生物入侵后造成的腸黏膜損傷。腸黏膜屏障系統(tǒng)主要由黏液屏障、腸上皮屏障、免疫屏障和微生物屏障組成。使用抗生素后，腸道內(nèi)細菌群落穩(wěn)態(tài)失衡，腸道黏膜屏障可能會受到損傷，細菌有可能侵入黏膜層，引發(fā)免疫效應[5]。因此，本研究通過抗生素連續(xù)灌胃誘導小鼠菌群紊亂，探討抗生素的使用對小鼠腸道黏膜屏障和微生物群落的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取32只雄性C57BL/J小鼠，5周齡，體重16～20 g。在22～25℃、12 h的光暗周期下，小鼠自由獲取水和食物，適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。所有動物實驗程序均獲得廣西醫(yī)科大學倫理委員會批準。

1.2 實驗分組及處理 所有小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為2組（n=16），分別為：（1）對照組（N組），生理鹽水200μL/只/d，1次/d，灌胃7 d；（2）抗生素組（M組），抗生素混合液200μL/只/d，1次/d，連續(xù)灌胃7 d?？股鼗旌弦号渲品桨竻⒄占韧墨I[6]，具體如下：甲硝唑（1 mg/mL）、氨芐青霉素（1 mg/mL）、新霉素（1 mg/mL）、慶大霉素（1 mg/mL）和萬古霉素（0.5 mg/mL）。

1.3 組織取材和處理 實驗期間每天記錄小鼠的精神狀態(tài)、體重和糞便性狀，計算糞便含水量，含水量計算公式如下：糞便含水量（%）=（糞便濕重－糞便干重）/糞便濕重×100%。實驗結(jié)束時，麻醉小鼠，眼球取血后處死，采集小鼠結(jié)腸、盲腸組織，按盲腸數(shù)=盲腸重量（mg）/小鼠體重（mg）公式計算盲腸指數(shù)并統(tǒng)計結(jié)腸長度。取部分結(jié)腸組織為PCR實驗做準備，剩余結(jié)腸組織放入4%組織固定液中，制作石蠟切片。

1.4 小鼠結(jié)腸組織蘇木精—伊紅（HE）染色 結(jié)腸組織收集于4%組織固定液中，石蠟包埋，切片為4μmol/L，二甲苯脫蠟、不同濃度酒精溶液中水化（無水酒精→90%→80%→70%），進行HE染色，在光學顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理學改變并拍片。

1.5 小鼠結(jié)腸組織黏蛋白2（MUC2）蛋白免疫組織化學染色 制作好的石蠟切片脫蠟，水化，高壓抗原熱修復，內(nèi)源性過氧化物酶失活，封閉非特異性抗原，之后加入MUC2一抗（按1∶2 000稀釋，購于美國Proteintech公司），4℃過夜。次日加入生物素二抗工作液（1∶200），DAB顯色后，用蘇木精染液復染，脫水后封片，顯微鏡下觀察拍照。用Image-Pro Plus 6.0圖像軟件計算MUC2的平均光密度值。

1.6 RT-qPCR檢測小鼠結(jié)腸組織MUC2、白介素-10（IL-10）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）mRNA的表達 將各組小鼠結(jié)腸組織，加入500μL Nuclezol試劑，用研磨儀研磨，提取各組小鼠結(jié)腸組織總RNA。測定濃度后，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。后續(xù)以cDNA為模板對IL-10、MUC2、TNFα和IL-1β進行擴增，PCR反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性10 s，60℃退火、延伸30 s，共 40個循環(huán)；添加熔解曲線：95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s，以GAPDH為內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列5’～3’

1.7 ELISA檢測血漿二胺氧化酶（DAO）和D-乳酸（D-LA）表達水平 實驗結(jié)束后，收集外周血，離心，收集上清，嚴格按ELISA試劑盒（購自武漢華美生物工程有限公司）說明書方法進行DAO和D-LA含量的檢測。

1.8 16SrRNA腸道菌群測序分析 按照文獻的方法[7]，提取小鼠糞便總微生物基因組DNA樣品后針對細菌的V3+V4可變區(qū)序列設計引物進行PCR擴增，擴增后使用Illumina公司建庫試劑盒構(gòu)建文庫并質(zhì)檢，對該文庫使用NovaSeq 6000 PE250平臺上進行測序及分析（深圳微科盟科技集團有限公司）。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用Graphpad 7.0統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況觀察 N組小鼠精神活動、攝食、飲水正常，糞便呈棕褐色干燥成形大便。M組小鼠精神狀態(tài)欠佳，糞便呈棕黃色，顆粒濕潤。兩組小鼠體重變化趨勢一致（P＞0.05）。與N組相比，M組小鼠糞便含水量升高（P＜0.05），見圖1。

圖1 小鼠體重和糞便含水量的對比

2.2 兩組小鼠結(jié)腸和盲腸的變化比較 與N組相比，M組小鼠的結(jié)腸縮短（P＜0.05）。與N組相比，M組小鼠離體前和清洗內(nèi)容物后均可看見盲腸明顯脹大，盲腸指數(shù)增大（P＜0.05），見圖2。

圖2 小鼠結(jié)腸長度和盲腸大小的對比

2.3 兩組小鼠的結(jié)腸組織病理學形態(tài)比較 N組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整均勻，腸腺豐富排列規(guī)則，隱窩結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，未見明顯炎癥現(xiàn)象。與N組相比，M組小鼠有明顯腸黏膜受損，表現(xiàn)為上皮完整性破壞，結(jié)腸腺體結(jié)構(gòu)紊亂，部分腺體高度、密度下降，隱窩結(jié)構(gòu)萎縮，黏膜下層可見明顯水腫，黏膜及黏膜下層較多炎性細胞浸潤，見圖3。

圖3 小鼠結(jié)腸組織病理學形態(tài)對比（HE）

2.4 小鼠結(jié)腸組織中MUC2 mRNA和蛋白表達情況 M組小鼠結(jié)腸組織中MUC2蛋白的陽性細胞數(shù)較N組小鼠結(jié)腸中MUC2的陽性細胞數(shù)少，M組小鼠MUC2mRNA表達降低，MOD值較N組小鼠降低（P＜0.01），見圖4。

圖4 抗生素給藥對小鼠結(jié)腸組織中MUC2 mRNA和蛋白表達的影響

2.5 兩組小鼠結(jié)腸組織中IL-1β、TNF-α和IL-10的表達情況 與N組相比，M組小鼠結(jié)腸組織中促炎因子IL-1β和TNF-αmRNA表達水平升高（P＜0.01）。與N組相比，M組小鼠結(jié)腸組織中免疫調(diào)節(jié)因子IL-10mRNA表達水平降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA表達對比

2.6 各組小鼠外周血中二胺氧化酶（DAO）和D-乳酸（D-LA）含量對比 M組小鼠的外周血中DAO含量較N組升高（P＜0.05），M組小鼠外周血中D-LA含量與N組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖6。

圖6 小鼠外周血中DAO和D-LA含量對比

2.7 各組小鼠腸道菌群分析 由圖7A可知，各樣本的曲線趨向平緩，說明測序深度足以反應菌群結(jié)構(gòu)真實狀況，可進行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。圖7B可以看出，M組小鼠的Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和Observed OTU指數(shù)均小于N組（P＜0.05）。說明M組小鼠菌群Alpha多樣性低于N組。門和屬水平腸道菌群豐度柱狀分別見圖7C和7D，可以看出兩組小鼠菌群組成存在較大的差異，門水平上，M組小鼠中擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度較N組降低，而疣微菌門（Verrucomicrobia）、變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度明顯高于N組。圖7D的DESeq2火山圖分析可以發(fā)現(xiàn)M組和N組小鼠中差異的菌屬，其中M組中S24_7、普雷沃氏菌屬（Prevotella）、擬桿菌屬（Bacteroides）和異桿菌屬（Allobaculum）等腸道菌屬的相對比例較N組下降（P＜0.05），副擬桿菌屬（Parabacteroides）、克雷伯氏肺炎菌屬（Klebsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、阿克曼氏菌屬（Akkermansia）、變形桿菌屬（Proteus）和埃希式菌屬（Escherichia）等腸道菌屬的相對比例高于N組（P＜0.05）。為了研究抗生素暴露后腸道微生物組的功能，本研究使用PICRUSt軟件預測抗生素暴露后的功能改變，圖7E的KEGG L2水平功能預測柱狀圖表明，兩組小鼠代謝功能組成不同，PCA分析圖同樣說明兩組菌群的代謝功能預測存在明顯差異。Dunn test檢驗后發(fā)現(xiàn)，在KEGG通路中的代謝（Metabolism），生物系統(tǒng)（Organismal Systems）和人類疾?。℉uman Diseases）在兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖7 各組小鼠腸道菌群16SrRNA測序分析結(jié)果對比

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，M組小鼠的精神狀態(tài)較N組差，糞便含水量較N組增多，提示M組小鼠腸道出現(xiàn)損傷。研究證明，變大的盲腸是腸道菌群紊亂小鼠和無菌小鼠的典型表現(xiàn)[8]，本研究亦觀察到M組小鼠的盲腸增大，與既往研究結(jié)果相一致。此后進行的腸道菌群測序分析結(jié)果說明抗生素暴露可致小鼠的腸道生物屏障破壞，即菌群穩(wěn)態(tài)失調(diào)，其主要表現(xiàn)為菌群多樣性降低，與活動性結(jié)腸炎的鑒別性微生物譜系的升高（變形桿菌、腸桿菌、肺炎克雷伯菌、腸桿菌和阿克曼氏菌等菌屬）和與結(jié)腸炎緩解有關(guān)支系的減少（S24-7和擬桿菌等菌屬）[9]。有研究報道，變形桿菌屬（Proteus）和克雷伯氏肺炎菌屬（Klebsiella）的存在與小鼠的潰瘍性結(jié)腸炎（UC）發(fā)展有關(guān)，UC小鼠與野生鼠共飼養(yǎng)時，野生鼠也會發(fā)展為結(jié)腸炎[10]。也有研究報道，結(jié)腸炎治療后小鼠中S24-7豐度則會恢復至更高的水平，且S24-7的豐度與盲腸的丁酸鹽的水平呈正相關(guān)關(guān)系[11]。說明腸道內(nèi)菌群的結(jié)構(gòu)組成變化和結(jié)腸炎癥損傷密切相關(guān)，此后的功能預測顯示兩組小鼠KEGG代謝通路中代謝、生物系統(tǒng)和人類疾病存在顯著性差異，也間接說明小鼠菌群的紊亂使得某些代謝通路發(fā)生改變，可能與生物代謝過程和人類疾病相關(guān)。

小鼠結(jié)腸表面有一層厚的黏液層，覆蓋在結(jié)腸上皮層表面，防止微生物的入侵。MUC2是腸道黏液屏障的最主要蛋白。研究證實，MUC2基因敲除小鼠可出現(xiàn)腹瀉、結(jié)直腸脫垂、腸道炎癥、自發(fā)性結(jié)腸炎和結(jié)腸癌風險增加等表現(xiàn)[12]。當小鼠腸道菌群發(fā)生紊亂，某些嗜黏蛋白菌過度增殖，可能會造成黏膜屏障變薄，從而結(jié)腸上皮屏障受損[13]。本研究菌群分析顯示，M組中導致黏液蛋白降解菌阿克曼氏菌（Akkermansia）較N組增多；且前者M組小鼠結(jié)腸組織MUC2表達明顯下降，表明抗生素導致小鼠結(jié)腸黏液屏障的破壞。

結(jié)腸上皮屏障的完整性對于防止菌群侵襲入血具有重要的作用[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥性腸病小鼠結(jié)腸上皮屏障受損，其小鼠的結(jié)腸長度有明顯縮短[15]。本研究結(jié)果提示M組小鼠的結(jié)腸長度較N組縮短，從形態(tài)學上說明M組小鼠造成了結(jié)腸上皮屏障的損傷。后續(xù)分析的結(jié)腸病理組織學同樣證實M組小鼠上皮屏障明顯受損，說明抗生素暴露可破壞結(jié)腸上皮屏障完整性。

當腸道黏膜屏障功能遭到破壞時常表現(xiàn)為腸道通透性升高。本研究選擇腸道通透性相關(guān)的指標DAO和D-LA進行分析[16-17]，結(jié)果提示M組小鼠DAO水平較N組升高，而D-LA變化雖無統(tǒng)計學差異但呈升高的趨勢，這表明抗生素給藥可致小鼠結(jié)腸通透性升高。

此外，結(jié)腸黏膜內(nèi)的免疫細胞可通過分泌促炎因子和抑炎因子平衡腸道免疫穩(wěn)態(tài)以維持正常的腸道免疫屏障功能。研究發(fā)現(xiàn)，炎性相關(guān)因子TNFα和IL-1β在炎癥性腸病患者或臨床前期患者中表達水平較高，說明TNF-α和IL-1β可能是導致腸道炎癥的重要因子[18-19]。在缺乏IL-10受體小鼠中發(fā)現(xiàn)嚴重的腸道炎癥，表明IL-10對于抑制炎癥反應可能起到重要的作用[20]。本研究分析炎癥細胞因子在結(jié)腸組織中的表達水平，發(fā)現(xiàn)M組小鼠的促炎因子IL-1β和TNF-α的表達水平較N組升高，抑炎因子IL-10較N組降低，表明抗生素可導致小鼠結(jié)腸黏膜的促炎和抗炎反應紊亂。

綜上，抗生素破壞小鼠腸道菌群的平衡，可能是黏液屏障破壞的始發(fā)因素，黏液屏障的破壞使得結(jié)腸上皮屏障失去物理阻隔，導致結(jié)腸上皮受損，從而破壞黏膜屏障功能，導致小鼠結(jié)腸處于促炎反應階段，最終導致抗生素相關(guān)性腸黏膜損傷。本研究初步說明抗生素對腸黏膜屏障的不利影響，為認識抗生素相關(guān)性腸黏膜損傷提供一定的理論依據(jù)。